Medidas de transferência de energia de ressonância förster em células vegetais vivas

Resumo

Um protocolo é fornecido para a criação de um microscópio de varredura a laser confocal padrão para medições de transferência de energia de ressonância in vivo Förster, seguido de avaliação de dados.

Resumo

Os experimentos de transferência de energia de ressonância Förster (FRET) baseados em emissões sensibilizadas são facilmente feitos, mas dependem da configuração microscópica. Microscópios de varredura a laser confocal tornaram-se um cavalo de trabalho para biólogos. Os sistemas comerciais oferecem alta flexibilidade no ajuste de energia a laser e sensibilidade ao detector e muitas vezes combinam diferentes detectores para obter a imagem perfeita. No entanto, a comparação de dados baseados em intensidade de diferentes experimentos e configurações é muitas vezes impossível devido a essa flexibilidade. Procedimentos amigáveis ao biólogo são vantajosos e permitem um ajuste simples e confiável das configurações de laser e detector.

Além disso, como os experimentos de FRET em células vivas são afetados pela variabilidade na expressão proteica e nas razões de aceitação de doadores, os níveis de expressão proteica devem ser considerados para avaliação de dados. Descrito aqui é um protocolo simples para medições de FRET confiáveis e reprodutíveis, incluindo rotinas para a estimativa de expressão proteica e ajuste da intensidade do laser e configurações do detector. A avaliação dos dados será realizada por calibração com uma fusão fluoróvasa de eficiência fret conhecida. Para melhorar a simplicidade, foram comparados fatores de correção que foram obtidos nas células e medindo proteínas fluorescentes recombinantes.

Introdução

A transferência de energia de ressonância förster ((F)RET) é tipicamente observada pela espectroscopia de fluorescência, embora o processo em si não se limite a ocorrer entre fluoroforos. O acoplamento dipolo-dipolo subjacente simplesmente requer uma molécula de doador emissor de luz e um aceitador absorvedor de luz. Isso é derivado da sobreposição espectral necessária J integral da emissão de doadores normalizada e espectros de absorção de ^aceitação1. No entanto, como o RET compete com a fluorescência, a transferência de energia torna-se mensurável por alterações na emissão de fluorescência: RET induz a extinção de doadores e emissão de aceitadores sensibilizados.

O RET baseado em fluorophore foi chamado de fluorescência resonance energy transfer (FRET) para separá-lo da transferência de energia de ressonância bioluminescência (BRET). O RET depende fortemente da distância entre doador e aceitador, que está amplamente na faixa de 0,5-10 ^nm2 e, portanto, na mesma faixa das dimensões das proteínas e seus complexos. Em segundo lugar, o RET depende da orientação dipolo-dipolo kappa ao quadrado. Combinado com o fato de que a liberdade rotacional de fluoroforos ligados à proteína pode ser negligenciada devido ao peso molecular e ao relaxamento rotacional lento, o RET permite a análise de alterações ^conformais3.

O chamado raio Förster é baseado na sobreposição espectral integral e na faixa de comprimento de onda da sobreposição, de modo que os cromóforos absorventes de luz vermelha resultam em raios de Förster mais longos do que corantes absorventes de luz azul. Como a faixa dinâmica das medições fret é limitada por 0,5 × _R0 e 1,5 × _R0, o par FRET ECFP-EYFP tem um alcance dinâmico de 2,5-7,3 nm devido ao seu _R0 de 4,9 nm4.

O brilho de um fluoróforo é dado pelo produto de seu coeficiente de extinção molar e seu rendimento quântico. Para as medidas do FRET, é vantajoso escolher fluoroforos de brilho quase semelhante. Isso aumenta a detecção de emissão de doadores saciados e sensibilizados. Também favorece a calibração do sistema de microscopia. Olhando para os pares de proteínas cianos e fluorescentes frequentemente usados, o menor brilho das proteínas fluorescentes de ciano torna-se óbvio (Figura 1A).

No entanto, a vida útil do aceitor deve ser menor do que a vida útil do doador, garantindo a disponibilidade do aceitador para transferência de energia. Se a vida útil do aceitor exceder a vida útil do doador, o aceitador ainda pode estar no estado animado quando o doador estiver animado novamente. Proteínas fluorescentes de ciano avançado, como a mTurquoise, mostram uma vida útil prolongada e, portanto, contribuem para uma maior probabilidade de FRET (Figure1B). A probabilidade de FRET também depende do coeficiente de extinção molar do aceitador.

Protocolo

NOTA: Para o seguinte protocolo, foi realizada transfesão transitória de protoplastos, conforme descrito ^{anteriormente12}. Uma breve descrição é dada abaixo.

1. Transfecção transitória de protoplastos

1. Corte ~4 g de folhas saudáveis de Arabidopsis thaliana ecotype Columbia em fatias de 1 mm e transfira-as para 20 mL de solução enzimática (1,5% de celulase; 0,4% macerozyme; 0,1% de soro bovino albumina Fração V; 0,4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino)ácido esfórfico (MES), pH 5.7; 10 mM _CaCl2).
2. Infiltrar-se a vácuo nas fatias de folhas seguidas de uma incubação com agitação por 2 h à temperatura ambiente. Colher as células por centrifugação por 3 min a 100 × g.
3. Lave os protoplastos com solução W5 (154 mM NaCl; 125 mM _CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5.7) e resuspensá-los em solução MMG (0,4 M mannitol; 15 mM _MgCl2; 4 mM MES, pH 5.7).
4. Realize a transfecção em um slide de 8 poços por choque osmótico na presença de polietilenoglicol (PEG) 4000. Misture 20 μL da suspensão protoplasta com 5 μL de DNA plasmídeo (5 μg/μL) e 25 μL de solução PEG (0,2 M mannitol, 0,1 M _CaCl2, 40% PEG 4000).
5. Reverter o choque osmótico por um reajuste suave das condições osmóticas.
   NOTA: Além da amostra de interesse, somente a expressão do doador e do usuário é necessária para determinar o sangramento espectral do doador e do usuário, respectivamente. Uma proteína de fusão do doador e do aceitador deve ser expressa também para fins de calibração. A expressão de proteína fluorescente estava sob o controle de um vírus mosaico de couve-flor 35S promotor (pCaMV35S). Para todas as medidas, foram utilizados dois microscópios de varredura a laser confocal (LSM1 e LSM2). O LSM1 possui dois tipos de detectores: para medições de FRET, o sinal do doador foi detectado por um detector de GaAsP, enquanto o FRET e a emissão de aceitadores foram registrados com um fotomultiplier. O LSM2 possui dois fotomultipliers, que foram utilizados para a detecção de doadores, FRET e emissão de aceitadores.

2. Ajuste a laser

NOTA: Aqui, foram aplicadas linhas de 458 nm e 514 nm de um laser de íon-argônio para análise de FRET entre proteína fluorescente de ciano aumentada (ECFP) e proteínas fluorescentes amarelas aprimoradas (EYFP). Para aquisição de dados reprodutíveis, ambas as linhas foram ajustadas para intensidade semelhante. Isso foi conseguido por uma fotomultiplier de transmissão ou pelo modo de reflexão.

1. Ajuste a laser com fotomultiplier de transmissão
   1. Use um poço vazio para ajuste.
   2. Escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma.
   3. Diminua a intensidade do laser ao mínimo e ajuste o ganho do detector para ruídos de fundo detectáveis.
   4. Aumente a intensidade do laser em etapas de 0,5% e regissou o sinal correspondente.
   5. Aplique a rotina para ambas as linhas de laser.
2. Ajuste a laser com modo de reflexão
   1. Use um poço vazio para ajuste.
   2. Aplique um filtro de reflexão, ligue o modo de reflexão, se disponível.
   3. Certifique-se de que o comprimento de onda do detector cobre o comprimento de onda do laser.
   4. Escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma.
   5. Diminua a intensidade do laser ao mínimo e ajuste o ganho do detector para ruídos de fundo detectáveis.
   6. Mova o objetivo para a posição mais baixa.
   7. Mova o objetivo até que o reflexo do deslizamento seja visível.
   8. Aumente a intensidade do laser em etapas de 0,5% e regissou o sinal correspondente.
   9. Aplique a rotina para ambas as linhas de laser.
3. Avaliação de dados
   1. Tabular os dados e classificar os dados por intensidades de sinal.
   2. Plote as intensidades do sinal contra a potência relativa do laser.
   3. Escolha intensidades de laser que resultem em intensidade de sinal semelhante.

3. Ajuste de fotomultipliers

NOTA: Após o ajuste do laser, os fotomultipliers foram ajustados a ganhos individuais para obter sensibilidade semelhante. Esta calibração foi feita com a linha laser de 514 nm, que está no centro da faixa de comprimento de onda de interesse.

1. Use um poço vazio para ajuste.
2. Aplique um filtro de reflexão e mude para o modo de reflexão, se disponível.
3. Certifique-se de que o comprimento de onda do detector cobre o comprimento de onda do laser (514 nm).
4. Escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma.
5. Diminuir o ganho do detector para metade do máximo e ajustar a intensidade do laser ao ruído de fundo detectável.
6. Mova o objetivo para a posição mais baixa.
7. Mova o objetivo até que o reflexo do deslizamento seja visível.
8. Aumente o ganho do detector em etapas de 50 a 100 V e regise o sinal correspondente.
9. Aplique as etapas 3.1 a 3.8 para ambos os detectores.
10. Avaliação de dados
    1. Plote a intensidade contra o ganho do detector para cada detector.
    2. Escolha os ganhos individuais do detector para obter sensibilidade semelhante.

4. Aquisição de imagem fret

NOTA: Comece com a amostra de interesse para a configuração da aquisição de imagens.

1. Escolha os filtros/espelhos dirítmicos apropriados, por exemplo, um espelho dicromático duplo MBS 458/514 para o ECFP/EYFP do par FRET. Use o mesmo espelho dicroico para todos os canais para permitir a varredura linha por linha. Selecione um objetivo de imersão em água para a imagem de células vivas. Escolha a varredura de 12 bits ou 16 bits e velocidade de varredura moderada.
2. Defina a faixa de detecção, preferencialmente 470-510 nm para detecção de doadores e 530-600 nm para detecção de acceptor/FRET no caso de ECFP/EYFP. Ao usar um laser de diodo de 445 nm ou 440 nm, use 450 a 510 nm como faixa de detecção. No caso de um divisor de feixe acousto-óptico (AOBS), defina a detecção de doadores na faixa de 450 a 500 nm para evitar a detecção indesejada de aceitadores.
3. Aplique a configuração do detector de acordo com 3.10.2.
4. Aplique a configuração do laser de acordo com 2.3.2. Revise a intensidade do laser com base na tabela de alimentação laser obtida, se necessário. Certifique-se de que a relação sinal-ruído cubra toda a gama dinâmica dos detectores (intensidade que varia de 0 a 4095 para varredura de 12 bits).
5. Mantenha as intensidades de laser e os ganhos do detector constantes. Use o diâmetro do orifício para ajuste fino.
   NOTA: Tenha em mente que as alterações no diâmetro do orifício afetam a resolução espacial.
6. Realizar as medições (tirar imagens de pelo menos 20 células).

5. Determinação de correções de crosstalk

NOTA: As células que expressam apenas o doador ou o usuário são obrigadas a determinar o sangramento espectral do doador (DSBT) e o sangramento espectral aceitor (ASBT), respectivamente. Mantenha as mesmas configurações descritas na seção 4.

1. Realize medições de FRET com células expressando o fluorophore doador.
2. Realize medições de FRET com células expressando o fluorophore aceitor.

6. Calibração das medidas de acordo com Beemiller et ^al.13

NOTA: São necessárias células que expressem uma fusão aceitadora de doadores da eficiência conhecida do FRET. Aqui, ^{foi utilizada uma} fusão AA-EYFP EA-EYFP com eficiência DE 0,46 FRET. Mantenha as mesmas configurações descritas na seção 4.

1. Realizar medições de FRET com células expressando a fusão doador-aceitante

7. Avaliação de dados

1. Obtenha perfis de linha das células, garantindo que cada perfil não contenha mais do que uma célula. Salve os perfis como arquivos de texto.
2. Importe os arquivos de texto em uma planilha usando a opção de importação de arquivos de texto na seção Dados .
3. Leia os valores máximos aplicando a função Max .
4. Liste os valores obtidos em uma tabela, tenha uma coluna cada para _ID de emissão de doadores, _IF de emissão de FRET, _IA de emissão aceitadora e pelo menos quatro conjuntos de dados: apenas doador, apenas aceitador, fusão doador-aceitador e medição.
   NOTA: A excitação do doador também resulta em excitação direta do aceitador e causa ASBT descrito pelo valor α.
5. Calcule os valores de α ASBT com o conjunto de dados somente para aceitador usando equação (1).
   (1)
   NOTA: Use a mediana de todos os valores α nas seguintes equações. O doador apresenta um amplo espectro de emissões que resulta em crosstalk de emissões com a emissão sensibilizada do aceitador. Este DSBT é dado pelo valor β.
6. Calcule os valores de sangria β espectral do doador com o conjunto de dados somente para doadores usando equação (2).
   (2)
   NOTA: Use a mediana de todos os valores β nas seguintes equações. O fator de calibração descreve a relação linear de doadores derivados do FRET e emissão sensibilizada do aceitador. Use as medianas de 7,5 e 7,6 nas equações a seguir.
7. Calcule os fatores de calibração com o conjunto de dados de fusão doador-aceitor e sua eficiência FRET E (0,46) usando equação (3).
   (3)
   NOTA: Use a mediana de todos os valores nas seguintes equações.
8. Calcule as eficiências fret do par de proteínas de interesse usando equações (4) e (5).
   (4)
   (5)
9. Estime os efeitos da força de expressão e/ou relação doador-aceitador: plote a soma do _ID, _IF e _IA contra as eficiências do FRET. Realizar uma regressão linear; note que quanto mais íngreme o gráfico e quanto maior for o ^R2 , maior é o impacto do nível de expressão ou maior é a diferença de abundância de doador e aceitador.

Resultados

Ajuste do microscópio de varredura a laser confocal
O ajuste a laser revelou um aumento linear da emissão com aumento da intensidade do laser (Figura 2 e Tabela 1). Como esperado para os lasers de íons de argônio, a emissão da linha de 514 nm foi muito maior do que a emissão da linha de 458 nm, como evidenciado por uma inclinação mais íngreme. Para experimentos subsequentes, foi escolhida potência laser de 4,5% e 6,5% para a linha de 514 nm e a ...

Discussão

A emissão de aceitadores de doadores e sensibilizadas são caracterizadas por uma relação linear que permite o cálculo baseado em doadores ou aceitadores de FRET. Os fatores correspondentes de linearidade são chamados fator G (doador para aceitador) ou xi (aceitador ao doador), que são valores recíprocos4. Medir o FRET entre proteínas fluorescentes por microscopia de fluorescência muitas vezes requer correções para DSBT e ASBT devido ao amplo espectro de absorção e emissão das prote?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well slides	Ibidi	80821
Immersion oil Immersol  W2010	Zeiss	444969-0000-000	refraction index of water
LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope	Zeiss
LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope	Zeiss