Funcionalização vesícula extracelular derivada de plaquetas de implantes ti

Resumo

Aqui, apresentamos um método para o isolamento de Vesículas Extracelulares (EVs) derivados das plaquetas (PL) e seu uso para revestimento de superfícies de implante de titânio (Ti). Descrevemos o método de revestimento de fundição de gota, o perfil de liberação de EVs das superfícies e a biocompatibilidade in vitro de superfícies Ti revestidas de EVs.

Resumo

Vesículos extracelulares (EVs) são nanovesculas biológicas que desempenham um papel fundamental na comunicação celular. Seu conteúdo inclui biomoléculas ativas, como proteínas e ácidos nucleicos, que apresentam grande potencial na medicina regenerativa. Mais recentemente, os EVs derivados de Plaqueta Lysate (PL) mostraram uma capacidade osteogênica comparável ao PL. Além disso, os biomateriais são frequentemente utilizados em ortopedia ou restauração dentária. Aqui, fornecemos um método para funcionalizar superfícies ti com EVs derivados de PL, a fim de melhorar suas propriedades osteogênicas.

Os EVs são isolados do PL por cromatografia de exclusão de tamanho, e depois as superfícies ti são funcionalizadas com PL-EVs por fundição de gota. A funcionalidade é comprovada pela liberação de EVs e sua biocompatibilidade pelo ensaio de liberação de lactato desidrogenase (LDH).

Introdução

Os EVs são vesículas de membrana (30-200 nm) secretadas por qualquer célula e desempenham um papel fundamental na comunicação célula-celular, entregando sua carga. Eles contêm uma variedade de biomoléculas ativas que podem incluir ácidos nucleicos, fatores de crescimento ou lipídios bioativos1. Por essas razões, os EVs têm sido avaliados por seu potencial uso na terapêutica. Em termos de ortopedia e regeneração óssea, EVs de diferentes fontes foram testados. Entre eles, os EVs derivados de plaquetas têm sido mostrados para induzir um efeito de diferenciação sobre as células-tronco, mantendo um perfil citotóxico ^baixo2,3. Portanto, mais pesquisas são necessárias para explorar a possibilidade de combinar EVs com biomateriais para usá-los na prática clínica diária.

Os biomateriais à base de titânio são amplamente utilizados como andaimes para intervenções clínicas de cicatrização óssea devido às suas propriedades mecânicas, alta biocompatibilidade e durabilidade a longo ^prazo4. No entanto, os implantes ti são um material biointendo e, portanto, apresentam uma baixa capacidade de ligação com o tecido ósseo ^circundante5. Por essa razão, modificações de titânio estão sendo estudadas para melhorar seu desempenho, alcançando um microambiente mais funcional em sua ^{superfície4,6,7}. Nesse sentido, os EVs podem ser ancorados em titânio por interações ^químicas8 ou ^físicas9,10. EVs imobilizados derivados de células-tronco ou macrófagos aumentam a bioatividade de Ti, promovendo a adesão celular e a proliferação, induzindo assim um efeito osteogênico8,9,10.

Este artigo se concentrará em uma estratégia de lançamento de gota para revestimento de superfícies Ti com EVs derivados de PL em detalhes. Além disso, avaliaremos o perfil de liberação de EVs da superfície revestida ao longo do tempo e confirmaremos sua biocompatibilidade celular in vitro.

Protocolo

A plaqueta Lysate (PL) é obtida como descrito anteriormente em conformidade com as diretrizes ^{institucionais3} utilizando casacos de buffy fresco fornecidos pelo IdISBa Biobank como material inicial. Sua utilização para o projeto atual foi aprovada pelo Comitê de Ética (IB 1995/12 BIO).

1. Isolamento de EVs do PL

1. Remoção de corpos maiores
   1. Descongelar PL em temperatura ambiente.
   2. Centrifugar PL a 1.500 x g para 15 min a 4 °C. Descarte a pelota, pois contém detritos celulares.
   3. Colete o supernatante e realize duas centrífugas consecutivas a 10.000 x g por 30 min a 4 °C.
      NOTA: A pelota corresponde a EVs maiores, como microvesículos, e neste caso, é descartada.
   4. Filtre o supernasal primeiro através de 0,8 μm de membrana porosa e, em seguida, através de 0,2 μm de membrana porosa.
      NOTA: Estas etapas removem todos os EVs não desejados.
   5. Acumule o PL filtrado e armazene a -20 °C até usar.
2. Cromatografia de exclusão de tamanho
   1. Equilibre a coluna acoplada ao equipamento de cromatografia na vazão desejada com PBS filtrado.
      NOTA: A taxa de fluxo utilizada depende das características da coluna; neste caso, está definido para 0,5 mL/min.
   2. Carregue o PL processado (5 mL) com uma seringa no equipamento.
   3. Injete o PL na coluna e comece a coletar frações de 5 mL em tubos de 15 mL.
   4. Colete as frações enriquecidas dos EVs e armazene-as a -80 °C até usar.
      NOTA: Ao realizar o experimento pela primeira vez, caracterize todas as frações por quantificação proteica e imunodeseção para determinar a enriquecida com ^EVs3,11. Neste experimento, a ^9ª fração é coletada.
   5. Lave a coluna cromatográfica com 30 mL de solução NaOH de 0,2% e armazene-a em solução de 20% de etanol quando atingir o equilíbrio.

Figura 1: Diagrama esquemático do isolamento de vesícula extracelular (EVs) da plaqueta lysate (PL). PL é centrifugado primeiro a 1.500 x g, e depois a 10.000 x g para remover corpos maiores. O supernante é filtrado através de filtros de 0,8 e 0,2 μm. O PL processado é carregado na coluna, e os EVs são separados por cromatografia de exclusão de tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Caracterização de EVs

NOTA: A caracterização dos EVs é necessária para a realização de estudos ^funcionais12. Microscopia eletrônica ou caracterização de manchas ocidentais foram relatadas ^{anteriormente13}. Este relatório se concentrará nas técnicas essenciais de caracterização para a funcionalização da superfície Ti.

1. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
   1. Diluir os EVs (1:1000) em PBS filtrado de 0,2 μm.
      NOTA: Amostras muito concentradas ou amostras muito diluídas estarão fora de alcance para determinação da NTA, e será necessário ajuste.
   2. Carregue 1 mL dos EVs diluídos com uma seringa no equipamento NTA e injete-os no equipamento NTA.
   3. Siga o protocolo do fabricante para a concentração de partículas e determinação de distribuição de tamanho.
2. Concentração de proteínas
   1. Determine a concentração usando 1 μL da solução EVs. Meça a absorvância com um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 280 nm.
      NOTA: Os EVs devem apresentar baixos níveis de proteínas em comparação com o número de partículas.
   2. Siga as instruções do fabricante para obter a leitura de absorvência usando o espectrômetro.

3. Funcionalização da superfície de titânio

NOTA: Neste método, são utilizados discos de titânio usinados, grau IV, 6,2 mm de diâmetro e 2 mm de altura. Os discos podem ser manipulados com pinças Ti, mas é importante não arranhar a superfície. Além disso, o lado usinado deve enfrentar para cima durante todo o processo.

1. Ti discos lavam
   NOTA: O volume de soluções utilizadas para a lavagem ti deve ser suficiente para cobrir discos Ti. Coloque discos Ti em um béquer de vidro e despeje soluções sobre eles. Em seguida, remova a solução decantando.
   1. Lave os implantes ti com água deionizada (DI) e, em seguida, descarte a água.
   2. Lave os implantes com etanol 70%, e depois decante para remover a solução.
   3. Coloque os implantes em água DI e sonicate a 50 °C por 5 min. Descarte a água.
   4. Incubar implantes ti em uma solução NaOH de 40% a 50 °C por 10 min com agitação. Descarte a solução.
      ATENÇÃO: A solução NaOH aquece durante a preparação. A solução é corrosiva e deve ser usada dentro de um capô de fumaça.
   5. Sonicar os implantes em água DI a 50 °C por 5 minutos e, em seguida, remova a água.
   6. Realize várias lavagens com água DI (pelo menos 5) até chegar ao pH neutro. Verifique o pH com indicadores de pH.
   7. Sonicar os implantes em água DI a 50 °C por 5 minutos e remover a água.
   8. Incubar implantes ti em uma solução _HNO3 de 50% a 50 °C por 10 minutos com agitação. Remova a solução.
      ATENÇÃO: _HNO3 é uma substância corrosiva e oxidante, e deve ser usado dentro de um capô de fumaça.
   9. Sonicar os implantes em água DI a 50 °C por 5 min. Retire a água.
   10. Realize várias lavagens com água DI (pelo menos 5) até obter pH neutro. Verifique o pH com indicadores de pH.
   11. Sonicar os implantes em água DI a 50 °C por 5 min. Retire a água.
       NOTA: Neste ponto, o experimento pode ser interrompido armazenando implantes ti em uma solução de 70% de etanol.
2. Ti passivation
   NOTA: As etapas de passivação ti são realizadas cobrindo completamente os discos Ti com as diferentes soluções no pedido listado abaixo. Os discos ti são colocados em um copo de vidro e as soluções são suavemente derramadas sobre eles. Os volumes utilizados em todas as etapas de lavagem devem cobrir completamente os implantes e são removidos por decantação.
   1. Incubar os implantes ti em uma solução _HNO3 de 30% por 30 minutos à temperatura ambiente sob suave agitação. Remova a solução.
   2. Realize várias lavagens com água DI (pelo menos 5) até chegar ao pH neutro. Verifique o pH com indicadores de pH.
   3. Incubar implantes ti durante a noite em temperatura ambiente em água DI.
   4. Seque os implantes em condições de vácuo a 40 °C por 10 minutos.
3. EVs lançam lançamento
   NOTA: Para estudos funcionais de células, é importante trabalhar em um armário de cultura celular.
   1. Coloque os implantes Ti em uma placa de 96 poços, com o lado usinado voltado para cima.
      NOTA: Se os implantes forem virados de cabeça para baixo, uma agulha pode ser usada para atrvê-los.
   2. Descongele a solução de EVs e misture-as com agitação. Use um vórtice para pulsar por 3 s.
   3. Deposite os EVs na superfície ti. Neste estudo, gotas de 40 μL de solução de EVs são colocadas na Ti para imobilizar um máximo de 4 x ¹⁰¹¹ EVs por implante de acordo com a concentração determinada pela NTA.
   4. Coloque as placas contendo a Ti em condições de vácuo a 37 °C até que as gotas estejam completamente secas (~2 h).
      NOTA: Ajuste o tempo dependendo do número de implantes e da água presente na câmara de vácuo.

Figura 2: Diagrama esquemático de ti passivation e funcionalização de EVs por fundição de gota. Os implantes ti são passivados primeiro pela incubação por 30 min em uma solução _HNO3 de 30% à temperatura ambiente. Depois de várias lavagens com água DI, o pH chega neutro. Em seguida, os implantes ti são incubados durante a noite à temperatura ambiente em água DI. Depois disso, os implantes são secos em condições de vácuo a 40 °C. Para a imobilização de EVs, 40 μL de solução EVs são depositados em implantes Ti. Em seguida, os implantes são incubados no vácuo por 2 h até que os EVs estejam fisicamente ligados à superfície. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Caracterização da superfície ti

1. Estudo de liberação
   1. Incubar a superfície Ti com 200 μL de PBS filtrado a 37 °C.
      NOTA: O PBS é filtrado para evitar interferências na medição NTA.
   2. Substitua o PBS em diferentes pontos de tempo e armazene a -80 °C.
      NOTA: Neste estudo, foram analisados os pontos de tempo de 2, 6, 10 e 14 dias.
   3. Analise o PBS armazenado para estudos de partículas pela NTA de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: A concentração de partículas no PBS em diferentes momentos é uma representação do perfil de liberação de EVs ao longo do tempo.
2. Estudos de biocompatibilidade
   NOTA: As células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC) são obtidas do IdISBa Biobank em conformidade com as diretrizes institucionais.
   1. Manter hUC-MSC em DMEM baixa glicose suplementada com 20% de FBS até o uso. Troque o meio duas vezes por semana.
   2. Para semeadura celular, lave as células em frascos com 5 mL de PBS duas vezes.
   3. Trypsinize hUC-MSC adicionando 1 mL de solução de trippsina. Certifique-se de que cobre completamente a monocamada das células. Remova a solução de trippsina e coloque o frasco de cultura celular a 37 °C por 2 min aproximadamente. Veja o desprendimento celular sob o microscópio. As células isoladas aparecerão em forma redonda e estarão em suspensão.
   4. Células resuspendas em DMEM de baixa glicose com EVs de 1% esgotadas FBS.
      NOTA: Prepare a mídia complementada com 1% de FBS e, em seguida, ultracentrifuuge a 120.000 x g por 18 h para remover FBS-EVs. É importante remover EVs para evitar interferências com EVs plaquetas.
   5. Determine a concentração celular contando o número de células com uma câmara de ^Neubauer14.
   6. Leve o hUC-MSC a uma concentração de 50.000 células/mL.
   7. Semente 200 μL da solução celular para os implantes ti.
   8. Após 48 h, colete 50 μL de mídia e realize a determinação citotóxica usando o kit de atividade lactato desidrogenase (LDH), de acordo com o protocolo do fabricante.

Resultados

O método apresentado neste artigo permite a obtenção de discos de titânio funcionalizados EVs. Os EVs são fisicamente ligados à superfície, o que permite uma liberação sustentada ao longo do tempo. A quantidade de EVs liberados pode ser medida pela NTA nos dias 2, 6, 10 e 14. As primeiras medições, no dia 2, mostram que cerca de ¹⁰⁹ EVs são lançados, seguidos de uma liberação sustentada no dia 6 (~¹⁰⁸ EVs); dia 10 (~¹⁰⁷ EVs) e dia 14 (~¹⁰⁷ EVs). Isso confirma uma...

Discussão

Este protocolo visa fornecer instruções claras para a funcionalização dos EVs nas superfícies ti. O método apresentado baseia-se em uma estratégia de fundição de gota, que é um tipo de funcionalização de fissionação. A má bibliografia existe em relação à funcionalização de EVs nas superfícies de Ti, embora existam poucos estudos mostrando diferentes vantagens ao imobilizar EVs no ^Ti10. De qualquer forma, algumas das estratégias exploradas incluem ligação bioquímica8, armad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,8 µm syringe filter	Sartorius	16592K
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1mL syringe	BD	303174
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolut ethanol	Scharlau	ET0006005P	Used to prepare 20 %  ethanol with Milli-Q® water
AKTA purifier System	GE Healthcare	8149-30-0014
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coutler	392934	SX4750A swinging rotor
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
Conical Tube, Conical Bottom, 50ml	SPL life sciences	PLC50050
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
Disposable Syringes 10 ml	Becton Dickinson	BDH307736
DMEM Low Glucose Glutamax	GIBCO	21885025
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified	GIBCO	16000044
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR	GE Healthcare	28-9356-04	Precast columns
human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)	IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 spectrophotometer	ThermoFisher	ND-2000
NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Needle	Terumo	946077135
Nitric acid 69,5%	Scharlau	AC16071000
Optima L-100 XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124	SW-32Ti Rotor
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Biowest	L0022
pH Test strips 4.5-10.0	Sigma	P-4536
Platelet Lysate (PL)	IdISBa Biobank		Obtained from  buffy coats discarded after blood donation
Polypropylene centrifuge tubs	Beckman Coutler	326823
Power wave HT	BioTek	10340763
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print	Sarstedt	62554502
Sodium hidroxide	Sharlau	SO04251000
Titanium implants replicas	Implantmedia, SA	NA	Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm
Trypsin-EDTA 1 X	Biowest	L0930
Tryton X100	Sigma	T8787