Cultivo Microbiano Automatizado e Evolução Adaptativa usando Sistema de Cultura microbiana de microdroplet (MMC)

Resumo

Este protocolo descreve como usar o sistema microbiano de cultura de microdroplet (MMC) para realizar o cultivo microbiano automatizado e a evolução adaptativa. A MMC pode cultivar e subsu cultivar microrganismos automaticamente e continuamente e monitorar on-line seu crescimento com rendimento relativamente alto e boa paraleloização, reduzindo o consumo de mão-de-obra e reagente.

Resumo

Os métodos convencionais de cultivo microbiano geralmente têm operações complicadas, baixo rendimento, baixa eficiência e grande consumo de mão-de-obra e reagentes. Além disso, os métodos de cultivo de alto rendimento baseados em microplaca desenvolvidos nos últimos anos têm baixo status de crescimento microbiano e paraleloização de experimentos devido ao seu baixo oxigênio dissolvido, mistura pobre e evaporação severa e efeito térmico. Devido a muitas vantagens das micro-gotículas, como pequeno volume, alto rendimento e forte controlabilidade, a tecnologia microfluidica baseada em gotículas pode superar esses problemas, que tem sido usado em muitos tipos de pesquisa de cultivo microbiano de alto rendimento, triagem e evolução. No entanto, a maioria dos estudos anteriores permanece na fase de construção e aplicação laboratorial. Algumas questões-chave, como altos requisitos operacionais, alta dificuldade de construção e falta de tecnologia de integração automatizada, restringem a ampla aplicação da tecnologia microfluidica gotícula em pesquisa microbiana. Aqui, um sistema automatizado de Microdroplet Culture (MMC) foi desenvolvido com sucesso com base na tecnologia microfluida de gotículas, alcançando a integração de funções como inoculação, cultivo, monitoramento on-line, subculo, classificação e amostragem exigidas pelo processo de cultivo de gotículas microbianas. Neste protocolo, escherichia coli (E. coli) MG1655 e uma cepa E. coli (MeSV2.2) de tipo selvagem foram tomadas como exemplos para introduzir como usar o MMC para realizar o cultivo microbiano automatizado e relativamente de alto rendimento e a evolução adaptativa em detalhes. Este método é fácil de operar, consome menos mão-de-obra e reagentes, e tem alto rendimento experimental e boa paraleloidade de dados, o que tem grandes vantagens em comparação com os métodos convencionais de cultivo. Fornece uma plataforma experimental de baixo custo, amigável à operação e confiável para pesquisadores científicos realizarem pesquisas microbianas relacionadas.

Introdução

O cultivo microbiano é uma importante base para pesquisas científicas microbiológicas e aplicações industriais, amplamente utilizadas no isolamento, identificação, reconstrução, triagem e evolução dos microrganismos ^1,2,3. Os métodos convencionais de cultivo de microbianos usam principalmente tubos de ensaio, frascos de shake e placas sólidas como recipientes de cultivo, combinados com incubadoras de agitação, espectrofotômetros, leitores de microplaca e outros equipamentos para cultivo, detecção e triagem de microbianas. No entanto, esses métodos têm muitos problemas, como operações complicadas, baixo rendimento, baixa eficiência e grande consumo de mão-de-obra e reagentes. Os métodos de cultivo de alto rendimento desenvolvidos nos últimos anos são baseados principalmente na microplaca. Mas a microplacão tem um baixo nível de oxigênio dissolvido, má mistura de propriedade, e evaporação severa e efeito térmico, que muitas vezes levam a um baixo status de crescimento e paraleloização de experimentos de microrganismos 4,5,6,7; por outro lado, ele precisa ser equipado com equipamentos caros, como estações de trabalho de manuseio líquido e leitores de microplaca, para alcançar o cultivo automatizado e detecção de processos ^8,9.

Como um importante ramo da tecnologia microfluidica, os microfluidos de gotículas foram desenvolvidos nos últimos anos com base em sistemas microfluidos tradicionais de fluxo contínuo. É uma tecnologia microfluida de fluxo discreto que usa duas fases líquidas imiscíveis (geralmente óleo-água) para gerar micro-gotículas dispersas e operá-las¹⁰. Como as micro-gotículas têm as características de pequeno volume, grande área de superfície específica, alta taxa interna de transferência de massa e nenhuma contaminação cruzada causada pela compartimentação, e as vantagens da forte controlabilidade e alto rendimento de gotículas, houve muitos tipos de pesquisa aplicando tecnologia microfluidica gotícula no cultivo de alto rendimento, triagem e evolução dos microrganismos¹¹ . No entanto, ainda há uma série de questões-chave para tornar a tecnologia microfluidica gotícula popularizada e amplamente aplicada. Em primeiro lugar, o funcionamento de microfluidos de gotículas é complicado e intrincado, resultando em altos requisitos técnicos para os operadores. Em segundo lugar, a tecnologia microfluidica de gotículas combina componentes ópticos, mecânicos e elétricos e precisa estar associada a cenários de aplicação de biotecnologia. É difícil para um único laboratório ou equipe construir sistemas eficientes de controle microfluídico gotícula se não houver colaboração multidisciplinar. Em terceiro lugar, por conta do pequeno volume de micro-gotículas (do picoliter (pL) ao microliter (μL),é preciso muita dificuldade para realizar o controle automatizado preciso e a detecção on-line em tempo real de gotículas para algumas operações microbianas básicas, como subculto, triagem e amostragem, e também é difícil construir um sistema de equipamento integrado¹².

Para resolver os problemas acima, um sistema automático de Microdroplet Culture (MMC) foi desenvolvido com sucesso com base na tecnologia microfluídica^{gotícula 13}. O MMC consiste em quatro módulos funcionais: um módulo de reconhecimento de gotículas, um módulo de detecção de espectro de gotículas, um módulo de chip microfluido e um módulo de amostragem. Através da integração e controle do sistema de todos os módulos, o sistema de operação automatizado inclui a geração, cultivo, medição (densidade óptica (OD) e fluorescência), divisão, fusão, classificação de gotículas é precisamente estabelecida, alcançando a integração de funções como inoculação, cultivo, monitoramento, subculonça, triagem e amostragem exigidas pelo processo de cultivo de gotículas microbianas. O MMC pode conter até 200 unidades de cultivo de gotículas de réplica de volume de 2-3 μL, o que equivale a 200 unidades de cultivo de frascos de shake. O sistema de cultivo de micro-gotículas pode satisfazer os requisitos de não contaminação, oxigênio dissolvido, mistura e troca de massa-energia durante o crescimento de microrganismos, e atender às várias necessidades de pesquisa microbiana através de múltiplas funções integradas, por exemplo, medição da curva de crescimento, evolução adaptativa, análise e análise metabólica de fator único (baseada na detecção e análise de fluorescência)^13,14.

Aqui, o protocolo introduz como usar o MMC para realizar o cultivo automatizado e microbiano e a evolução adaptativa em detalhes (Figura 1). Tomamos escherichia coli (E. coli) MG1655 como exemplo para demonstrar a medição da curva de crescimento e uma cepa E. coli essencial de metanol MeSV2.2¹⁵ para demonstrar a evolução adaptativa no MMC. Foi desenvolvido um software de operação para MMC, o que torna a operação muito simples e clara. Em todo o processo, o usuário precisa preparar a solução inicial de bactérias, definir as condições do MMC e, em seguida, injetar a solução de bactérias e reagentes relacionados no MMC. Posteriormente, o MMC executará automaticamente operações como geração de gotículas, reconhecimento e numeração, cultivo e evolução adaptativa. Ele também executará a detecção on-line (OD e fluorescência) das gotículas com resolução de alto tempo e exibirá os dados relacionados (que podem ser exportados) no software. O operador pode parar o processo de cultivo a qualquer momento de acordo com os resultados e extrair as gotículas-alvo para experimentos subsequentes. O MMC é fácil de operar, consome menos mão-de-obra e reagentes, e tem rendimento experimental relativamente alto e boa paraleloidade de dados, que tem vantagens significativas em comparação com os métodos convencionais de cultivo. Fornece uma plataforma experimental de baixo custo, amigável à operação e robusta para os pesquisadores realizarem pesquisas microbianas relacionadas.

Protocolo

1. Instalação de instrumentos e software

1. Escolha um ambiente limpo e estéril (como um banco limpo) como um espaço permanente dedicado para mmc. Instale o MMC de forma constante no espaço.
   NOTA: Mantenha o MMC longe da interferência de fortes campos elétricos, campos magnéticos e fortes fontes de radiação térmica. Evite que vibrações severas afetem os componentes de detecção óptica. Fornecer a fonte de alimentação de AC220 V, 50 HZ para o MMC. Para obter detalhes sobre o MMC, consulte a Tabela de Materiais e o site da MMC¹⁶.
2. Instale o software de operação do arquivo MMC.zip
   NOTA: Entre em contato com os autores do arquivo .zip MMC.
   1. Crie uma pasta dedicada e salve o arquivo zip nele.
   2. Crie outra pasta dedicada como o "Diretório de Instalação". Descompacte o MMC.zip e salve os arquivos na nova pasta.
      NOTA: A configuração do computador é melhor para atender: (1) Sistema operacional Windows 7 de 64 bits ou superior; (2) CPU: i5 ou superior; (3) memória: 4 GB ou superior; (4) disco rígido: 300 GB ou superior (velocidade rotacional superior a 7200 rpm ou disco de estado sólido).

2. Preparativos

1. Conecte a agulha da seringa (o diâmetro interno é de 0,41 mm e o diâmetro externo é de 0,71 mm), conector rápido A e garrafa de reagente (Figura 2C) e autoclave-os a 121 °C por 15 min.
   NOTA: Desaparafusar ligeiramente a tampa da garrafa de reagente durante a esterilização. Mais algumas garrafas de reagente podem ser preparadas cada vez para uso.
2. Use um filtro de fluoreto de polivinida de 0,22 μm (PVDF) para filtrar o óleo MMC. Coloque o chip microfluídico (Figura 2B) e o óleo MMC no banco limpo com antecedência e esterilize-os por irradiação ultravioleta por 30 minutos antes do uso.
   NOTA: Para obter detalhes do conector Rápido A, garrafa de reagente, óleo MMC e chip microfluidic consulte a Tabela de Materiais.
3. Instale o chip microfluido
   1. Abra a porta da câmara de operação (Figura 2A) e levante a sonda de fibra óptica.
   2. Alinhe os orifícios de campo elétrico com as agulhas de campo elétrico e coloque suavemente o chip no pedestal do chip. Em seguida, insira as duas colunas de posicionamento nos orifícios de posicionamento e coloque a sonda de fibra óptica (Figura 2D).
   3. Conecte o conector rápido A no chip à porta correspondente do MMC de acordo com o número de posição (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Então feche a porta da câmara de operação.
4. Reabasteca o óleo MMC (cerca de 80 mL) na garrafa de óleo e esvazie o líquido de resíduos na garrafa de resíduos antes de usar.
   NOTA: O líquido de resíduos geralmente é resíduos orgânicos. Consulte o direito regional e a regulamentação mediante disposição, sujeito a alterações com base na configuração experimental.

3. Medição da curva de crescimento no MMC

1. Preparação para solução bacteriana inicial
   1. Siga as normas padrão relacionadas para preparar luria-bertani média e autoclave a 121°C por 15 min.
      NOTA: Componentes do meio LB: NaCl (10 g/L), extrato de levedura (5 g/L) e triptona (10 g/L).
   2. Retire a cepa E. coli MG1655 do caldo de glicerol e cultive-a em um frasco de shake de 50 mL com 10 mL de meio LB em uma incubadora de agitação (200 rpm) a 37 °C por 5-8 h.
      NOTA: O tempo de cultivo depende das cepas específicas. É ideal cultivar a cepa até o período/fase logarítmica.
   3. Diluir a solução E. coli MG1655 cultivada com meio fresco a um OD₆₀₀ de 0,05-0,1 para obter uma solução inicial de bactérias (prepare cerca de 10 mL).
2. Clique em Inicialização para inicializar o MMC. Após a realização da interface de inicialização, defina a temperatura de cultivo como 37 °C e o valor do sinal fotoelétrico como 0,6 (Figura 3A). A inicialização levará cerca de 20 minutos.
3. Ligue a lâmpada UV (comprimento de onda 254 nm) durante a inicialização.
4. Injete a solução inicial de bactérias e o óleo MMC no frasco de reagente.
   1. Pegue uma garrafa de reagente esterilizada no banco limpo e aperte a tampa.
   2. Use uma seringa estéril de 10 mL para injetar 3-5 mL de óleo MMC da agulha de seringa do tubo lateral. Incline e gire a garrafa de reagente lentamente para fazer o óleo se infiltrar totalmente na parede interna.
   3. Injete cerca de 5 mL de solução inicial de bactérias e, em seguida, encha o frasco de reagente injetando 5-7 mL do óleo novamente.
   4. Retire o conector rápido independente A e insira o conector rápido A da garrafa de reagente em seu conector rápido B para completar a operação de injeção de amostra (Figura 4A).
5. Aguarde o término da inicialização e, em seguida, desligue a lâmpada UV (comprimento de onda 254 nm).
6. Abra a porta da câmara de operação, e coloque a garrafa de reagente no banho de metal.
7. Retire o conector C2 do chip e o conector rápido A da garrafa de reagente. Conecte o conector do tubo lateral da garrafa de reagente ao conector C2 e ao conector superior do tubo ao conector O2. Então feche a porta da câmara de operação.
8. Clique na Curva de Crescimento para escolher a função de medição da curva de crescimento (Figura 3A). Na interface de configuração do parâmetro, insira o número como 15, ligue o interruptor de detecção de OD e defina o comprimento de onda como 600 nm. Clique em Iniciar a geração de gotículas. Vai levar cerca de 10 minutos.
   NOTA: Aqui, o número refere-se ao número de gotículas a serem geradas. O comprimento de onda refere-se ao comprimento de onda do OD a ser detectado. Defina o Número (máximo 200) e o comprimento de onda (350-800 nm) de acordo com os requisitos do experimento.
9. Quando uma janela pop-up aparecer na interface principal, solicitando "Remova a garrafa de reagente entre C2 e O2, clique no botão OK após a conclusão", abra a porta da câmara de operação para retirar a garrafa de reagente e conectar os conectores C2 e O2.
10. Feche a porta e clique no botão OK na janela pop-up para cultivar automaticamente as gotículas e detectar os valores de OD.
    NOTA: O MMC detecta o valor OD quando a gota passa pela sonda de fibra óptica. Portanto, o período de detecção depende do número de gotículas geradas.
11. Quando a curva de crescimento chegar à fase estacionária, clique no botão Exportação de dados para exportar os dados OD. Selecione o caminho de salvamento de dados e exporte o valor OD registrado durante o período de cultivo no formato .csv, que pode ser aberto por software apropriado (por exemplo, Microsoft Excel). Em seguida, use um software de mapeamento (por exemplo, EXCEL e Origin 9.0) para traçar a curva de crescimento.
    NOTA: Durante o processo de cultivo, é viável clicar na Exportação de Dados a qualquer momento para exportar os dados de OD de todas as gotículas atuais.

4. Evolução adaptativa no MMC

1. Preparação para solução bacteriana inicial
   1. Siga as normas padrão relacionadas para preparar as placas médias e sólidas líquidas especiais para o MeSV2.2 e autoclave a 121 °C por 15 min.
      NOTA: Para os componentes do meio especial consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais.
   2. Cultive o MeSV2.2 utilizando a placa sólida (diâmetro = 90 mm) em uma incubadora de temperatura constante de 37 °C por 72 h. Em seguida, escolha uma colônia independente e cultive-a em um frasco de shake de 50 mL com 10 mL do meio líquido especial em uma incubadora de agitação (200 rpm) a 37 °C por 72 h.
   3. Diluir a solução MeSV2.2 cultivada com o médio para um OD₆₀₀ de 0,1-0.2 (certifique-se de que o volume total não seja inferior a 10 mL) e continue cultivando-o no frasco de shake por 5h para obter a solução inicial de bactérias.
      NOTA: O MeSV2.2 é uma cepa E. coli essencial para metanol. O meio líquido especial contém 500 mmol/L metanol, o que é um forte estresse para o MeSV2.2, resultando em um crescimento muito lento. Observe que a obtenção da solução inicial de bactérias aqui é diferente da descrita na etapa 3.1.
2. Inicialize o MMC como explicado nas etapas 3.2, 3.3 e 3.5.
3. Tire duas garrafas de reagente esterilizadas, uma delas para a solução inicial de bactérias e a outra é para o meio fresco. Injete a solução inicial de bactérias (5 mL), meio fresco (12-15 mL) e óleo MMC nas garrafas de reagente, conforme explicado na etapa 3.4.
   NOTA: Como a evolução adaptativa é um processo de longo prazo envolvendo múltiplos subcultos, armazene o máximo possível de meios frescos no MMC. O meio não pode ser reabastecido durante a execução do experimento.
4. Instale as duas garrafas de reagente no MMC conforme explicado na etapa 3.6. Instale um para a solução inicial de bactérias entre o conector C2 e O2 e o outro para o meio fresco entre o conector C4 e O4.
5. Clique em ALE para escolher a função de evolução adaptativa (Figura 3B). Na interface de configuração do parâmetro, ligue o interruptor de detecção de OD .
6. Definir o número como 50, comprimento de onda como 600 nm, Concentração como 0%, Tipo como Tempo, Parâmetro como 30 h e Repetições como 99. Clique em Iniciar a geração de gotículas. Vai levar cerca de 25 minutos.
   NOTA: Aqui, "Concentração" refere-se à concentração máxima de fatores químicos para evolução adaptativa. Para diferentes gotículas, é realizado no MMC introduzir diferentes concentrações de fatores químicos para fornecer diferentes condições de crescimento. Calcule as concentrações introduzidas usando a seguinte equação:
   
   Aqui "C" refere-se à concentração de fatores químicos introduzidos em gotículas; "a" refere-se à concentração de fatores químicos nas garrafas de reagente entre o conector C4 e O4; "b" refere-se à concentração de fatores químicos nas garrafas de reagente entre o conector C6 e O6; e "i" refere-se à concentração disponível. Há oito concentrações disponíveis no MMC. Como o fator químico aqui tem uma única concentração (500 mmol/L metanol) e é um dos ingredientes do meio, apenas uma garrafa de reagente contendo o fator químico é instalada aqui, e a Concentração é definida como 0%. O tipo refere-se ao modo de subculto, que é dividido em três tipos: modo tempo, modo de valor OD e modo fluorescência. O primeiro significa cultivar as gotículas por um tempo fixo e, em seguida, sub-cultivar, enquanto os dois últimos significam cultivar as gotículas para a intensidade pré-definida de valor/fluorescência do OD e, em seguida, sub-cultivar. O parâmetro refere-se ao parâmetro relacionado necessário ao escolher um modo de subculto. Repetições referem-se ao número de subcultos.
7. Remova a garrafa de reagente colocada entre o conector C2 e O2 conforme explicado na etapa 3.8.
8. Observe se os valores máximos de OD das gotículas durante cada período de subculto aumentaram significativamente. Se o aumento ocorrer e atender aos requisitos do experimento, clique no botão Exportação de dados para exportar os dados OD conforme explicado na etapa 3.9.
   NOTA: Aqui, o período de subculgênio depende do Parâmetro. Por exemplo, ao definir Tipo como Tempo e Parâmetro como 30 h, o período de subculgão é de 30 h. Durante cada período de subculgênio, existem os valores máximos de OD das gotículas. Estimar se a evolução adaptativa atende aos requisitos do experimento pelo aumento dos valores máximos de OD (O aumento depende do processo real de cultivo da cepa, por exemplo, aumentado em mais de 20%).
   ATENÇÃO: Preste atenção se o meio fresco armazenado está esgotado. Se o aumento significativo não ocorreu mesmo após o esgotamento do meio, extraia as gotículas de melhor crescimento e realize uma nova rodada de evolução adaptativa.
9. Extrair as gotículas de destino do MMC.
   1. Clique no botão Triagem para escolher a função de extração de gotícula (Figura 3C). Escolha a opção Coletar , clique nos números das gotículas de destino e clique em OK.
      NOTA: A triagem de gotículas inclui "Coletar", "Descartar" e "Extratar solução de sementes". "Extrato de solução de sementes" significa coletar as gotículas restantes¹³ após a operação de subculto.
   2. Aguarde a janela pop-up para solicitar: "Por favor, puxe o conector rápido CF e coloque-o no tubo EP". Coloque o conector rápido CF no tubo de microcentrifutura para coleta de acordo com o prompt do software e clique em OK (Figura 4D).
   3. Após 1-2 min, a interface de software aparecerá em uma nova janela solicitando: "Por favor, insira o conector de volta e clique em OK se terminar". Em seguida, insira o conector rápido CF para trás e clique em OK para fazer o MMC continuar a ser executado (Figura 4D). Quando a próxima gotícula de destino chegar ao site de reconhecimento de gotículas, repita 4.9.2-4.9.3 para recolhê-lo.
      NOTA: Depois que todas as gotículas de destino forem coletadas, o MMC continuará cultivando as gotículas restantes. Se o cultivo não for necessário, clique em Parar para encerrar diretamente a operação.
   4. Extrair a gotícula usando uma pipeta de 2,5 μL, solte-a na placa de 90 mm de agarose e espalhe-a uniformemente com uma haste de vidro triangular com um comprimento lateral de 3 cm. Em seguida, cultive-o em uma incubadora de temperatura constante de 37 °C por 72 h.
   5. Escolha 3-5 colônias independentes e cultive-as separadamente nos frascos de shake de 50 mL com 10 mL de meio fresco em uma incubadora de agitação (200 rpm) a 37 °C por 48-72 h. Siga as normas padrão relacionadas para armazenar a solução de bactérias cultivadas no tubo de glicerol para experimentos subsequentes.

5. Limpo do MMC

1. Após a conclusão do experimento, clique em Parar para parar todas as operações. Em seguida, clique em Limpar o chip e os tubos. Vai levar cerca de 15 minutos.

Resultados

Este protocolo usa e. coli MG1655 e uma cepa MeSV2.2 como exemplos para demonstrar o cultivo microbiano e a evolução adaptativa essencial do metanol com uma estratégia automatizada e relativamente alta no MMC. A medição da curva de crescimento foi utilizada principalmente para caracterizar o cultivo microbiano. A evolução adaptativa foi conduzida pelo subculto contínuo automatizado e adicionando uma alta concentração de metanol como pressão seletiva durante cada subculto. Se a evolução adaptativa fo...

Discussão

Este protocolo apresenta como usar o sistema microbiano de cultura de microdroplet (MMC) para realizar o cultivo microbiano automatizado e a evolução adaptativa a longo prazo. MMC é um sistema de cultivo microbiano miniaturizado, automatizado e de alto rendimento. Em comparação com métodos e instrumentos convencionais de cultivo de alto rendimento microbiano, o MMC tem muitas vantagens, como baixo consumo de mão-de-obra e reagente, operação simples, detecção on-line (DCE e fluorescência), coleta de dados de a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PVDF filter membrane	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator	Haier	BCD-289BSW	For reagent storage
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20011160	Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10007216	Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MMC control
Constant temperature incubator	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10008218	Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance	OHAUS	AR 3130	For reagent weighing
EP tube	Thermo Fisher	1.5 mL	For droplet collection
FeCl3·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10011928	Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For strain preservation
Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054	Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot	SANYO Electric	MLS3020	For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)	Biotopped	420322	Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate	Solarbio	K8020	Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol	MACKLIN	M813895	Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O	BIOBYING	1305715	Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20026118	Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O	GENERAL-REAGENT	G10267B	Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10001518	Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish	Corning Incorporated	90 mm	For the preparation of solid medium
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Quick connector A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask	Union-Biotech	50 mL	For microbial cultivation
Shaking incubator	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate	Solarbio	S8290	Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 mL	Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle	OUBEL Hardware Store	22G	Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone	Oxoid Ltd.	LP0042	Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer	General Electric Company	Ultrospec 3100 pro	For the measurement of OD values
Vitamin B1	Solarbio	SV8080	Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract	Oxoid Ltd.	LP0021	Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10024018	Component of the special medium for MeSV2.2.