Desenvolvimento de um modelo de co-cultura celular para imitar isquemia cardíaca/reperfusão in vitro

Resumo

A distância espacial é um parâmetro fundamental na avaliação da lesão por hipóxia/reoxigenação em um modelo de cocultura de camadas separadas de células células endoteliais e cardiomiócitos, sugerindo, pela primeira vez, que a otimização do ambiente espacial de co-cultura é necessária para fornecer um modelo in vitro favorável para testar o papel das células endoteliais na proteção de cardiomiócitos.

Resumo

A doença isquêmica do coração é a principal causa de morte e incapacidade em todo o mundo. A reperfusão causa lesões adicionais além da isquemia. As células endoteliais (CES) podem proteger os cardiomiócitos (CMs) da lesão de reperfusão através de interações célula-células. Co-culturas podem ajudar a investigar o papel das interações célula-células. Uma cocultura mista é a abordagem mais simples, mas é limitada, pois tratamentos isolados e análises a jusante de tipos de células únicas não são viáveis. Para investigar se as CES podem atenuar os danos celulares cm dependentes de dose e se essa proteção pode ser ainda mais otimizada variando a distância de contato entre as duas linhas celulares, usamos células endotelias da artéria coronária primária do rato e cardiomiócitos de rato adulto para testar três tipos de inserções de cultura celular que variaram em sua distância de camada intercelular a 0,5, 1.0, e 2,0 mm, respectivamente. Somente em CMs, a lesão celular avaliada pela liberação de lactato desidrogenase (LDH) aumentou significativamente durante a hipóxia e ainda mais após a reoxigenação quando a distância foi de 2,0 mm em comparação com 0,5 e 1,0 mm. Quando as CES e os CMs estavam em contato quase direto (0,5 mm), houve apenas uma atenuação leve da lesão de reoxigenação de CMs após a hipóxia. Essa atenuação aumentou significativamente quando a distância espacial foi de 1,0 mm. Com 2,0 mm de distância, eCs atenuaram lesão cm durante hipoxia e hipóxia/reoxigenação, indicando que é necessário distanciamento cultural suficiente para os CES conversam com CMs, de modo que moléculas de sinal secretado possam circular e estimular totalmente caminhos de proteção. Nossos achados sugerem, pela primeira vez, que a otimização do ambiente espacial de co-cultura EC/CM é necessária para fornecer um modelo in vitro favorável para testar o papel das CE na proteção de CM contra lesões simuladas de isquemia/reperfusão. O objetivo deste relatório é fornecer uma abordagem passo a passo para que os investigadores usem este importante modelo a seu favor.

Introdução

A doença isquêmica do coração é a principal causa de morte e incapacidade em todo o mundo ^1,2. No entanto, o processo de tratamento da reperfusão pode causar a morte por cardiomiócito, conhecido como isquemia miocárdica/reperfusão (IR), para o qual ainda não há remédio efetivo³. Células endoteliais (CE) têm sido sugeridas para proteger cardiomiócitos (CMs) através da secreção de sinais paracrírinos, bem como interações célula-célula⁴.

Modelos de cocultura celular têm sido usados extensivamente para investigar o papel das interações células autocririnas e/ou paracrinas na função celular e diferenciação. Entre os modelos de cocultura, a cocultura mista é a mais simples, onde dois tipos diferentes de células estão em contato direto dentro de um único compartimento de cultura na proporção^{celular desejada 5}. No entanto, tratamentos separados entre tipos celulares e análise a jusante de um único tipo de célula não são facilmente viáveis dada a população mista.

Estudos anteriores indicaram que insultos hipóxicos e isquêmicos causam danos significativos à integridade da membrana celular, medida pela liberação de lactato desidrogenase (LDH). Esta lesão é agravada após a reoxigenação, imitando lesão de reperfusão ^6,7,8. O objetivo do protocolo atual foi testar as hipóteses de que a presença de CE pode atenuar a membrana celular dependente de CMs causada por hipóxia e reoxigenação (HR) e que o efeito protetor das CEs pode ser otimizado variando a distância de contato entre as duas linhas celulares. Assim, empregamos três tipos de inserções de cultura celular e células endotelias da artéria coronária primária do rato e cardiomiócitos de camundongos adultos. As pastilhas, marcadas por Corning, Merck Millipore e Greiner Bio-One, nos permitiram criar três diferentes condições de crosstalk de cultura celular com distâncias de linha intercelular de 0,5, 1,0 e 2,0 mm, respectivamente. 100.000 CEs foram emplacados por inserção em cada caso.

Além disso, para determinar se a densidade de CEs na cocultura contribui para a atenuação de lesões de RH neste modelo, estudamos a relação dose-resposta entre concentração de CE e liberação de LDH por CMs. As CE foram emplacar em 25.000, 50.000 e 100.000 por inserção, respectivamente, na inserção de 2,0 mm.

Este relatório fornece uma abordagem passo a passo para que os investigadores usem este importante modelo a seu favor.

Protocolo

1. Preparação/revestimento experimental

1. Mantenha CMs e CEs de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Descongele as duas linhas de celular quando chegarem dos vendedores. Placa em frascos T25 depois de ser lavada com mídia fresca. Recomenda-se a compra de cada mídia de cultura celular dos mesmos fornecedores de onde as células foram compradas. No dia seguinte, refresque as células com mídia e use quando confluente.
   2. Mantenha a incubadora de cultura celular a 37 °C com 21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂ e mantenha umidificada.
      NOTA: As células endotelias da artéria coronária primária do rato utilizadas neste protocolo são isoladas das artérias coronárias de camundongos C57BL/6, e os Cardiomiócitos do Rato Adulto são isolados dos corações de camundongos adultos C57BL/6J e obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais).
2. CMs de placa em condições estéreis na parte inferior de placas de 24 poços (camada inferior). 24 h depois, placaS ECs na pastilha (ou porção superior) do bem co-cultura. 24 h após o revestimento ce, coloque as pastilhas EC nas bases das placas CM, iniciando o período de cocultura. Deixe as células co-cultura por pelo menos 12-24 h antes de usar. Estas etapas são descritas em detalhes abaixo.
   1. Estimar a confluência da linha celular CM sob um microscópio leve. Quando as células parecem ser 90%-100% confluentes em frascos de cultura, proceda com revestimento experimental.
   2. Remova a mídia dos frascos contendo culturas celulares confluentes e tente com 3-5 mL de ácido trippsin/ethylenodiaminetetraacético (EDTA) para frascos T25. Agitar o frasco suavemente, incubar a 37 °C por 2-5 min e, em seguida, avaliar o progresso enzimático sob um microscópio leve. Uma vez que as células comecem a arredondar, use um raspador de células para separar as células da superfície.
   3. Após o desprendimento, inative a solução de trippsina adicionando a solução trypsin/célula a um tubo de 50 mL contendo 10 mL de mídia para frascos T25. Centrifugar a suspensão celular a 120 x g por 2 min para obter uma pelota de célula macia. Remova o supernatante e resuspenda a pelota em 5 mL de mídia.
   4. Para realizar a contagem celular e confirmar a viabilidade celular, misture uma alíquota de 10 μL de células resuspended e 10 μL de corante azul trypan. Conte as células vivas usando um contador de células. Diluir as células com novas mídias regulares para alcançar as densidades de semeadura desejadas. Os volumes são calculados dependendo da densidade de sementes desejada e da concentração celular das soluções de estoque. Todo o revestimento deve ser realizado em condições estéreis.
   5. CMs de placa em densidades de semeadura de 300.000 por poço na parte inferior de uma placa de 24 poços pré-revestida com matriz extracelular. Mantenha as células a 37 °C com 21% O_{2 e} 5% DE CO₂ durante a noite.
   6. Após 24h, a placa ECs em inserções a uma densidade ideal de revestimento de 100.000 por inserção (a área de cultura é de 33,6 mm²), (Figura 1). Após 24 horas de revestimento ce, coloque as pastilhas EC dentro dos poços CM, iniciando a cocultura. Permitir que as células co-cultuam por 12-24 h antes de realizar os experimentos.
   7. Certifique-se de que, quando os experimentos forem realizados, tanto os CMs quanto os CEs atingiram 80%-90% de confluência.

2. Hipoxia/reoxigenação para simular isquemia/lesão de reperfusão in vitro

NOTA: As seguintes etapas precisam ser executadas conforme descrito, não faça uma pausa no meio.

1. Prepare a mídia hipóxica derramando ~25 mL de mídia em um tubo cônico de 50 mL. Feche a parte superior com uma membrana de silicone e use uma pipeta esterilizada para fazer um buraco. Crie outro buraco, desta vez deixando a pipeta submersa aproximadamente 2/3 na mídia.
2. Lave a mídia com gás hipóxico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) por 5 min a uma vazão de 30 L/min. Isso minimiza o O₂ dissolvido na mídia quando a hipóxia começa (passo 2.5).
3. Descarte a mídia das placas de 24 poços ou inserções de cultura contendo células anexadas e lave com 100 μL/well de 10% de Salina Tamponada fosfato (PBS) muito suavemente. Posteriormente, adicione 500 μL da mídia hipoxica recém-preparada a cada poço das placas ou pastilhas.
   NOTA: A hipóxia na mídia é interrompida o mais brevemente possível durante esta etapa antes que a verdadeira hipóxia para células e mídia comece na etapa 2.5.
   1. No grupo de controle normoxic, substitua a mídia original por mídia normal fresca contendo glicose e soro.
4. Umidifice a câmara de hipóxia colocando uma placa de Petri cheia de água estéril dentro da câmara. Em seguida, coloque as placas que compõem os grupos hipóxicos na câmara.
5. Lave a câmara de hipóxia com gás hipóxico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) por 5 min a um fluxo de 30 L/min. Coloque a câmara na incubadora de 37 °C por 24 horas.
6. Após a hipóxia, cultive CMs e CEs em condições normais. Para isso, descarte a mídia antiga das placas/pastilhas, substitua-a por mídia normal (contendo glicose e soro; 500 μL de cada poço/inserção) e armazene-a na incubadora em condições normais de cultura (21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂, 37 °C) por 2 h para imitar reperfusão.
7. Para controlar quaisquer efeitos da substituição da mídia, mude a mídia das células normoxicas ao mesmo tempo em que a mídia hipóxica é alterada.
   NOTA: A Figura 2 fornece uma visão geral esquemática deste protocolo.

3. Avaliação do ponto final

1. Transfira a mídia de cultura celular da placa de 24 poços para uma placa de 96 poços. Use 200 μL de mídia de cada poço da placa de 24 poços e distribua igualmente em quatro poços da placa de 96 poços, em conformidade. Use uma placa cada para normoxia versus hipóxia versus HR.
2. Determine o grau de lesão celular, por exemplo, medindo a absorvência para LDH usando um kit de ensaio de citotoxicidade seguindo as instruções do fabricante. Execute o ensaio em uma placa de 96 poços como instruído no protocolo de ensaio.

4. Estatísticas

1. Exibir os dados paramétricos como desvio médio/padrão e dados não paramétricos como gráficos de caixa com intervalo mediano/interquartil. Testes de comparações paramétricas e não paramétricas adequadas com testes pós-hoc aceitáveis para diminuir a chance de um erro tipo 1 devem ser realizados. O significado é tipicamente definido em um alfa de 0,05 (duas caudas).
2. Para todos os experimentos realizados no presente estudo, realize pelo menos três bem-replicações dentro de um experimento. Houve três a seis repetições de cada experimento utilizado para análise estatística.

Resultados

Todos os três tipos de pastilhas (A, B, C) utilizadas neste experimento têm o mesmo tamanho de poros de 0,4 μm. A única diferença entre eles é a altura insert-to-base, que permite que as distâncias entre as duas camadas de células co-cultivadas sejam 0,5, 1,0 e 2,0 mm, respectivamente, (Figura 3) e que são de diferentes fornecedores (para detalhes ver Tabela de Materiais).

Para estabelecer um modelo de co-cultura in vitro com cam...

Discussão

Passos críticos no protocolo
Modelos de cocultura celular têm sido usados para estudar mecanismos celulares de cardioproteção. Como criar duas camadas separadas com uma distância significativa entre elas é, portanto, crucial para o desenvolvimento de um modelo de cocultura adequado. Um desafio no estudo de IR simulado, ou seja, RH, lesão é que não só a isquemia (hipoxia) em si, mas também a reperfusão (reoxigenação) agrava a disfunção celular. Portanto, um modelo realista precisa refle...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested