Estudo de modelos experimentais de doação de órgãos para transplante pulmonar

Resumo

O presente estudo mostra o estabelecimento de três diferentes modelos de doação pulmonar (doação pós-morte encefálica, doação pós-morte circulatória e doação pós-choque hemorrágico). Compara os processos inflamatórios e distúrbios patológicos associados a esses eventos.

Resumo

Modelos experimentais são ferramentas importantes para a compreensão dos fenômenos etiológicos envolvidos em diversos eventos fisiopatológicos. Nesse contexto, diferentes modelos animais são utilizados para estudar os elementos desencadeantes da fisiopatologia da disfunção primária do enxerto após o transplante, a fim de avaliar possíveis tratamentos. Atualmente, podemos dividir os modelos experimentais de doação em dois grandes grupos: doação após morte encefálica e doação após parada circulatória. Além disso, os efeitos deletérios associados ao choque hemorrágico devem ser considerados quando se consideram modelos animais de doação de órgãos. Descrevemos o estabelecimento de três diferentes modelos de doação pulmonar (doação pós-morte encefálica, doação pós-morte circulatória e pós-doação de choque hemorrágico) e comparamos os processos inflamatórios e distúrbios patológicos associados a esses eventos. O objetivo é fornecer à comunidade científica modelos animais confiáveis de doação pulmonar para o estudo dos mecanismos patológicos associados e busca de novos alvos terapêuticos para otimizar o número de enxertos viáveis para transplante.

Introdução

Relevância clínica
O transplante de órgãos é uma opção terapêutica bem estabelecida para diversas patologias graves. Nos últimos anos, muitos avanços foram alcançados no campo clínico e experimental dos transplantes de órgãos, como maior conhecimento da fisiopatologia da disfunção primária do enxerto (PGD) e avanços nas áreas de terapia intensiva, imunologia e farmacologia ^1,2,3. Apesar das conquistas e melhorias na qualidade dos procedimentos cirúrgicos e farmacológicos relacionados, a relação entre o número de órgãos disponíveis e o número de receptores em lista de espera continua sendo um dos principais desafios ^2,4. Nesse sentido, a literatura científica tem proposto modelos animais para o estudo de terapias que podem ser aplicadas a doadores de órgãos para tratar e/ou preservar os órgãos até o momento do transplante5,6,7,8.

Ao mimetizar os diferentes eventos observados na prática clínica, os modelos animais permitem o estudo dos mecanismos patológicos associados e suas respectivas abordagens terapêuticas. A indução experimental desses eventos, na maioria dos casos isolados, tem gerado modelos experimentais de doação de órgãos e tecidos que são amplamente investigados na literatura científica sobre transplante de órgãos6,7,8,9. Esses estudos empregam diferentes estratégias metodológicas, como as indutoras de morte encefálica (ME), choque hemorrágico (EH) e morte circulatória (DC), uma vez que esses eventos estão associados a diferentes processos deletérios que comprometem a funcionalidade dos órgãos e tecidos doados.

Morte encefálica (ME)
O THB está associado a uma série de eventos que levam à deterioração progressiva de diferentes sistemas. Geralmente ocorre quando um aumento agudo ou gradual da pressão intracraniana (PIC) ocorre devido a trauma cerebral ou hemorragia. Esse aumento da PIC promove um aumento da pressão arterial na tentativa de manter estável o fluxo sanguíneo cerebral, em um processo conhecido como reflexo de Cushing^10,11. Essas alterações agudas podem resultar em disfunções cardiovasculares, endócrinas e neurológicas que comprometem a quantidade e a qualidade dos órgãos doados, além de impactar na morbidade e mortalidade pós-transplante 10,11,12,13.

Choque hemorrágico (HS)
A EH, por sua vez, está frequentemente associada a doadores de órgãos, pois a maioria deles é vítima de trauma com perda significativa da volemia. Alguns órgãos, como pulmões e coração, são particularmente vulneráveis à EH devido à hipovolemia e consequente hipoperfusão tecidual¹⁴. A EH induz lesão pulmonar por meio do aumento da permeabilidade capilar, edema e infiltração de células inflamatórias, mecanismos que, em conjunto, comprometem as trocas gasosas e levam à deterioração progressiva dos órgãos, inviabilizando o processo de doação ^6,14.

Morte circulatória (DC)
A utilização da doação pós-DC vem crescendo exponencialmente nos grandes centros mundiais, contribuindo para o aumento do número de órgãos coletados. Órgãos recuperados de doadores pós-DC são vulneráveis aos efeitos da isquemia quente, que ocorre após um intervalo de baixo (fase agônica) ou nenhum suprimento sanguíneo (fase assistólica)^8,15. A hipoperfusão ou a ausência de fluxo sanguíneo levará à hipóxia tecidual associada à perda abrupta de ATP e ao acúmulo de toxinas metabólicas nos tecidos¹⁵. Apesar de sua utilização atual para transplante na prática clínica, muitas dúvidas permanecem sobre o impacto do uso desses órgãos na qualidade do enxerto pós-transplante e na sobrevida do paciente¹⁵. Assim, a utilização de modelos experimentais para melhor compreensão dos fatores etiológicos associados à DC também vem crescendo8,15,16,17.

Modelos experimentais
Existem vários modelos experimentais de doação de órgãos (ME, EH e DC). No entanto, os estudos muitas vezes se concentram em apenas uma estratégia de cada vez. É perceptível a lacuna nos estudos que combinam ou comparam duas ou mais estratégias. Esses modelos são muito úteis no desenvolvimento de terapias que buscam aumentar o número de doações e, consequentemente, diminuir a fila de espera dos potenciais receptores. As espécies animais utilizadas para este fim variam de estudo para estudo, sendo os modelos suínos mais comumente selecionados quando o objetivo é uma tradução mais direta com a morfofisiologia humana e menor dificuldade técnica no procedimento cirúrgico devido ao tamanho do animal. Apesar dos benefícios, dificuldades logísticas e altos custos estão associados ao modelo suíno. Por outro lado, o baixo custo e a possibilidade de manipulação biológica favorecem a utilização de modelos de roedores, permitindo ao pesquisador partir de um modelo confiável para reproduzir e tratar lesões, bem como integrar o conhecimento adquirido na área de transplante de órgãos.

Apresentamos um modelo de roedor de morte encefálica, morte circulatória e doação por choque hemorrágico. Descrevemos processos inflamatórios e condições patológicas associadas a cada um desses modelos.

Protocolo

Os experimentos com animais foram submetidos ao Comitê de Ética para Uso e Cuidados com Animais de Experimentação da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (protocolo número 112/16).

1. Agrupamento de animais

1. Atribuir aleatoriamente doze ratos machos Sprague Dawley (250-300 g) a um dos três grupos experimentais (n=4) para analisar e comparar os efeitos associados aos modelos animais.
2. Atribuir animais ao grupo choque hemorrágico (SH, n=4): animais submetidos a cateterismo vascular com indução de choque hemorrágico + manutenção por 360 min + extração de bloqueio cardiopulmonar + preparo da amostra para análise.
3. Atribuir animais ao grupo morte encefálica (BD, n=4): animais submetidos à morte encefálica + manutenção por 360 min + extração do bloqueio cardiopulmonar + preparo da amostra para análise.
4. Atribuir animais ao grupo morte circulatória (DC, n=4): animais submetidos a cateterismo vascular + indução de morte circulatória + suspensão da ventilação + isquemia à temperatura ambiente por 180 min + preparo da amostra para análise.

2. Anestesia e preparo pré-cirúrgico

1. Coloque o rato em uma câmara fechada com isoflurano a 5% por 1 - 4 min. Confirme a anestesia adequada verificando o reflexo de pinça do dedo do pé. Na ausência de reações reflexas (sem retração da pata), realizar intubação orotraqueal (angiocath 14G) com auxílio de laringoscópio pediátrico.
2. Com ventilador mecânico previamente ajustado (FiO₂ 100%, volume corrente 10 mL/kg, 90 ciclos/min e PEEP 3,0 cmH₂O), conecte o cateter traqueal ao ventilador e ajuste a concentração anestésica para 2%.
   OBS: Todos os procedimentos relacionados aos modelos animais seguiram o mesmo protocolo anestésico descrito nesta seção.
3. Remova os pelos das regiões de interesse (cabeça, pescoço, tórax e abdômen). Em seguida, com gaze, desinfetar o campo cirúrgico e a cauda do animal. A desinfecção é realizada com três rodadas alternadas de uma solução alcoólica de esfoliante de digluconato de clorexidina.
4. Corte a ponta da cauda do animal, coloque o polegar e o indicador sobre a base da cauda e, em seguida, pressione e deslize-os para longe da base. Coletar uma amostra de sangue periférico (20 μL) através da cauda para a contagem total de leucócitos⁸.
   OBS: Este procedimento deve ser realizado antes do início da traqueostomia e imediatamente ao final de cada protocolo (BD e EH - após 360 min).
5. Utilizar uma pipeta de precisão para diluir o sangue coletado em 380 μL (1:20) de solução de Turk (ácido acético glacial 99%). Uma vez diluída, pipetar a amostra de sangue para uma câmara de Neubauer e colocá-la sob um microscópio (40x). Realizar a contagem total de leucócitos nos quatro quadrantes laterais da câmara.

3. Traqueostomia

1. Com o auxílio de tesoura e pinça apropriadas, realizar dissecção longitudinal da traqueia cervical, iniciando do terço médio do pescoço até a fúrcula esternal (incisão de 1,5 cm). Após a incisão da pele e tecido subcutâneo, dissecar os músculos cervicais até que a traqueia fique exposta.
2. Coloque uma ligadura de seda 2-0 sob a traqueia.
3. Com microtesoura, traqueostomize o terço superior da traqueia para obter uma ventilação uniforme. Cortar horizontalmente a traqueia entre dois anéis cartilaginosos para acomodar o diâmetro de uma cânula metálica (3,5 cm).
4. Insira o tubo de ventilação e fixe-o com ligaduras preparadas.
5. Conecte o tubo de ventilação ao sistema de ventilação de pequenos animais.
6. Ventilar o rato com volume corrente de 10 mL/kg, velocidade de 70 ciclos/min e PEEP de 3 cmH₂O.

4. Cateterismo de artéria e veia femoral

1. Expor o triângulo femoral através de uma pequena incisão (1,5 cm) na região inguinal. Identificar e isolar os vasos femorais. Para este procedimento, utilizar um estereomicroscópio (aumento de 3,2x).
2. Coloque duas ligaduras de seda 4-0 sob os vasos sanguíneos (veia ou artéria), uma distalmente e outra proximalmente. Fechar a ligadura mais distal, colocar um nó pré-ajustado na ligadura proximal e puxar.
3. Insira o cateter através de uma pequena incisão pré-formada nos vasos. Fixar a cânula para evitar luxação.
   OBS: Realizar os cateteres a partir de extensor neonatal de 20 cm soldado por aquecimento a cateter intravenoso periférico adequado ao calibre da rede venosa do animal, evitando assim a regurgitação do conteúdo sanguíneo. Lubrificar a cânula com heparina, evitando a formação de trombos e complicações durante a medida da pressão arterial média (PAM).
4. Conecte o cateter arterial a um transdutor de pressão e a um sistema de monitorização de sinais vitais para registrar a pressão arterial média (PAM). O transdutor deve ser posicionado ao nível do coração do animal. Registre o MAP a cada período de 10 minutos.
5. Colocar o cateter da seringa (3 mL) na veia, visando hidratação e exsanguinação quando necessário.

5. Indução de choque hemorrágico

1. Por acesso venoso e com seringa heparinizada, retirar pequenos volumes de sangue até atingir valores de PAM de 50 mmHg, estabelecendo-se choque hemorrágico.
   NOTA: Coletar uma alíquota de 2 mL de sangue a cada 10 min na primeira hora do experimento e a cada 30 min nas horas subsequentes.
2. Manter a pressão estável em aproximadamente 50 mmHg por um período de 360 min. Para fazer isso, remova ou adicione alíquotas de sangue se a pressão aumentar ou diminuir, respectivamente.
3. Coloque uma fonte de calor nas proximidades para evitar hipotermia.
   NOTA: Aqui, uma lâmpada de calor é usada.
4. Ao final do protocolo, colher o bloqueio pulmonar na capacidade pulmonar total (CPT) e congelar em nitrogênio líquido ou colocá-lo em solução fixadora para estudos posteriores.
   OBS: Com o auxílio de um ventilador para pequenos animais, os parâmetros ventilatórios podem ser acessados durante o protocolo. No presente estudo, esses parâmetros foram avaliados imediatamente antes da indução com EH (Baseline) e 360 min depois (Final).

6. Indução da morte circulatória

1. Para induzir morte circulatória, administrar 150 mg/kg de tiopental sódico através da linha venosa. Em seguida, desligue o sistema de ventilação.
2. Notar a diminuição progressiva da PAM até atingir 0 mmHg. A partir deste ponto, considere o início do período de isquemia quente e comece a contagem de tempo. O animal deve permanecer à temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C) durante 180 minutos.
3. Ao final do protocolo, reconectar os pulmões ao ventilador mecânico e retirar o bloqueio pulmonar em CPT para coleta. Congelar rapidamente usando nitrogênio líquido ou colocá-lo na solução de fixação para estudos posteriores.

7. Indução da morte encefálica

1. Coloque o rato na posição prona.
2. Retire a pele do crânio usando tesoura cirúrgica. Perfurar um furo de calibre 1mm 2,80 mm anterior e 10,0 mm ventral ao bregma e 1,5 mm lateral à sutura sagital.
3. Insira todo o cateter-balão na cavidade craniana e certifique-se de que o balão seja pré-preenchido com soro fisiológico (500 μL).
4. Com a ajuda de uma seringa, inflar rapidamente o cateter.
5. Confirmar a morte encefálica observando elevação abrupta da PAM (reflexo de Cushing), ausência de reflexos, midríase bilateral e apneia. Após a confirmação, suspender a anestesia e manter o animal em ventilação mecânica por 360 min.
6. Coloque uma fonte de calor nas proximidades para evitar hipotermia.
7. Ao final do protocolo, colher o bloco pulmonar em CCT para coleta e congelar em nitrogênio líquido ou colocá-lo em solução fixadora para estudos posteriores.
   OBS: Com o auxílio de um ventilador para pequenos animais, os parâmetros ventilatórios podem ser acessados durante o protocolo. No presente estudo, avaliamos esses parâmetros imediatamente antes da indução do DO (Baseline) e após 360 minutos (Final).

Resultados

Pressão arterial média (PAM)
Para determinar as repercussões hemodinâmicas do TAB e da EH, a PAM foi avaliada ao longo dos 360 minutos do protocolo. A medida basal foi coletada após a remoção da pele e perfuração do crânio e antes da coleta de alíquotas de sangue para os animais submetidos a ME ou EH, respectivamente. Antes da indução com ME e EH, a PAM basal dos dois grupos foi semelhante (BD: 110,5 ± 6,1 vs. CC: 105,8 ± 2,3 mmHg; p=0,5; ANOVA de duas vias). Após a insuflação do cat...

Discussão

Nos últimos anos, o crescente número de diagnósticos de morte encefálica fez com que se tornasse o maior provedor de órgãos e tecidos destinados a transplante. Esse crescimento, no entanto, tem sido acompanhado por um aumento incrível de doações após a morte circulatória. Apesar de sua natureza multifatorial, a maioria dos mecanismos desencadeantes das causas de morte inicia-se após ou acompanha o trauma com extensa perda de conteúdo^{sanguíneo4,18}.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-gauge angiocath	DB	38186714	Orotracheal intubation
2.0-silk	Brasuture	AA553	Tracheal tube fixation
24-gauge angiocath	DB	38181214	Arterial and venous access
4.0-silk	Brasuture	AA551	Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).	Vic Pharma	Y/N	Asepsis
Trichotomy apparatus	Oster	Y/N	Clipping device
Precision balance	Shimadzu	D314800051	Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)	Cristália	18080003	DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)	Edwards Life Since	120804	BD induction
Neonatal extender	Embramed	497267	Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVent	Scireq	1142254	Analysis of ventilatory parameters
Heparin	Blau Farmaceutica SA	7000982-06	Anticoagulant
Isoflurane	Cristália	10,29,80,130	Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)	Eppendorf	347765Z	Handling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)	Eppendorf	H19385F	Handling of small- volume liquids
Microscope	Zeiss	1601004545	Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitor	Dixtal	101503775	MAP registration
Motorized drill	Midetronic	MCA0439	Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamber	Kasvi	D15-BL	Cell count
Pediatric laryngoscope	Oxygel	Y/N	Assistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)	SR	3330N4	Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducer	Edwards Life Since	P23XL	MAP registration
Metallic tracheal tube	Biomedical	006316/12	Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizer	Harvard Bioscience	1,02,698	Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)	Harvard Apparatus	MA1 55-0000	Mechanical ventilation
xMap methodology	Millipore	RECYTMAG-65K-04	Analysis of inflammatory markers