Análise Citométrica de Fluxo para Identificação das Células Imunes Inatas e Adaptativas do Pulmão murino

Resumo

Neste estudo, apresentamos um protocolo eficaz e reprodutível para isolar as populações imunes do sistema respiratório murino. Também fornecemos um método para a identificação de todas as células imunes inatas e adaptativas que residem nos pulmões de camundongos saudáveis, usando um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores.

Resumo

O trato respiratório está em contato direto com o ambiente externo e requer um sistema imunológico precisamente regulado para fornecer proteção enquanto suprime reações indesejadas a antígenos ambientais. Os pulmões abrigam várias populações de células imunes inatas e adaptáveis que fornecem vigilância imunológica, mas também mediam respostas imunes protetoras. Essas células, que mantêm o sistema imunológico pulmonar saudável em equilíbrio, também participam de várias condições patológicas, como asma, infecções, doenças autoimunes e câncer. A expressão seletiva de proteínas superficiais e intracelulares fornece propriedades imunofenópicas únicas às células imunes do pulmão. Consequentemente, a citometria de fluxo tem um papel fundamental na identificação dessas populações celulares durante condições de estado estável e patológico. Este artigo apresenta um protocolo que descreve um método consistente e reprodutível para identificar as células imunes que residem nos pulmões de camundongos saudáveis em condições de estado estável. No entanto, este protocolo também pode ser usado para identificar alterações nessas populações celulares em vários modelos de doenças para ajudar a identificar alterações específicas da doença na paisagem imunológica pulmonar.

Introdução

O trato respiratório murino contém um sistema imunológico único responsável por combater patógenos e manter a homeostase imunológica. O sistema imunológico pulmonar consiste em populações celulares com heterogeneidade significativa em seu fenótipo, função, origem e localização. Os macrófagos alveolares residentes (AMs), originados principalmente de monócitos fetais, residem no lúmen ^{1 alveolar}, enquanto macrófagos intersticiais (IMs) derivados da medula óssea residem no pulmão parenchyma2. Os IMs podem ser ainda mais subclassificados pela expressão do CD206. Os IMs CD206⁺ povoam a área peribronquial e perivascular, enquanto os IMs CD206-IMs estão localizados no interstício alveolar3. Algumas subclassificações de IMs foram propostas recentemente 3,4,5,6. Embora os IMs sejam menos estudados do que as AMs, evidências recentes apoiam seu papel crucial na regulação do sistema imunológico do ^pulmão7. Além disso, o CD206 também é expresso em AMs8 ativados alternativamente.

As células dendríticas pulmonares (DCs) são outro grupo heterogêneo de células imunes pulmonares em relação às suas propriedades funcionais, localização e origem. Quatro subcategorias de DCs foram descritas no pulmão: DCs cd103⁺ convencionais (também conhecidos como cDC1), CD11b⁺ DCs convencionais (também conhecidos como cDC2), DCs derivados de monocitoides (MoDCs) e DCs 9,10,11,12,13. As três primeiras subclasses podem ser definidas como principais complexos de histocompatibilidade (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Os DCs plasmacitóides expressam MHC II e são intermediavelmente positivos para CD11c, mas expressam altos níveis de B220 e PDCA-19,13,16. Em pulmões murinos ingênuos, os DCs CD103 e os DCs CD11b estão localizados no interstício das vias aéreas, enquanto os DCs plasmacitóides estão localizados no interstício ^alveolar17.

Duas grandes populações de monócitos residem no pulmão durante o estado estável: monócitos clássicos e monócitos não clássicos. Os monócitos clássicos são Ly6C⁺ e são críticos para a resposta inflamatória inicial. Em contraste, os monócitos não clássicos são ^{Ly6C e} têm sido amplamente vistos como células anti-inflamatórias3,16,18. Recentemente, foi descrita uma população adicional de monócitos CD64⁺CD16.2⁺, que se originam ^de monócitos Ly6C e dão origem ^a IMs3 CD206⁺.

Os eosinófilos aparecem principalmente nos pulmões durante a infecção por helminto ou condições alérgicas. No entanto, há um pequeno número de eosinófilos no parenchyma pulmonar durante o estado estável, conhecidos como eosinófilos residentes. Ao contrário dos eosinófilos residentes, eosinófilos inflamatórios são encontrados no interstício pulmonar e na lavagem broncoalveolar (BAL). Em modelos de camundongos de ácaro de poeira doméstica (HDM), eosinófilos inflamatórios são recrutados para o pulmão após estimulação mediada por antígeno. Foi proposto que os eosinófilos residentes possam ter um papel regulatório na alergia, inibindo a sensibilização do auxiliar T 2 (Th2) para o ^HDM19.

Em contraste com o resto das células mielóides pulmonares, os neutrófilos expressam Ly6G, mas não CD68, e são caracterizados por uma assinatura do imunofenótipo CD68-Ly6G⁺16,20,21. Estudos de visualização mostraram que, durante o estado estável, o pulmão reserva um pool de neutrófilos no compartimento intravascular e hospeda um número considerável de neutrófilos ^{extravasculares22}. Semelhante aos eosinófilos, os neutrófilos não são encontrados em BAL em estado estável; no entanto, várias formas de estimulação imunológica, como desafio LPS, asma ou pneumonia, levam os neutrófilos para o lúmen alveolar, resultando em sua presença em BAL21,22,23.

Um número substancial de células CD45⁺ do pulmão representam o assassino natural (NK), células T e células B e são negativos para a maioria dos marcadores mieloides24. Nos pulmões de camundongos ingênuos, esses três tipos de células podem ser identificados com base na expressão de CD11b e MHC ^II18. Cerca de 25% das células CD45⁺ pulmonares são células B, enquanto a porcentagem de células NK é maior no pulmão do que outros tecidos linfoides e não linfoides24,25,26. Entre as células T pulmonares, uma fração considerável é ^CD4-CD8- e desempenha um papel importante nas infecções ^{respiratórias26}.

Como o pulmão possui um sistema imunológico muito complexo e único, várias estratégias de gating para a identificação de células imunes pulmonares foram desenvolvidas e relatadas16,18,20,27. A estratégia de gating descrita aqui fornece uma maneira abrangente e reprodutível de identificar até 12 populações imunes mielóides pulmonares e não mieloides usando 9 marcadores. Marcadores adicionais foram usados para validar os resultados. Além disso, é fornecido um método detalhado para a preparação de uma suspensão unicelular que minimize a morte celular e permita a identificação do perfil mais completo do compartimento de células imunes do pulmão. Deve-se notar que a identificação de células não imunes do pulmão, como células epiteliais (CD45-CD326⁺CD31^-), células endoteliais (CD45-CD326-CD31⁺) e fibroblastos requer uma abordagem ^{diferente28,29}. A identificação dessas populações não está incluída no protocolo e método aqui descrito.

Protocolo

Todos os estudos e experimentos descritos neste protocolo foram conduzidos sob diretrizes de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Beth Israel Deaconess Medical Center. De seis a dez semanas de idade, os ratos C57BL/6 de ambos os sexos foram usados para desenvolver este protocolo.

1. Excisão cirúrgica e preparação tecidual

1. Eutanize o mouse injetando 1 mL de tribromoetanol (preparado de acordo com o protocolo padrão; Tabela de Materiais).
   NOTA: A asfixia por _CO2 deve ser evitada em estudos pulmonares, pois pode causar lesão pulmonar e alterar as características e propriedades das células imunes pulmonares. A luxação cervical também deve ser evitada, pois pode causar lesões mecânicas no pulmão.
2. Transfira o mouse para uma área limpa e dedicada para operação cirúrgica.
3. Estabilize o lado dorsal do rato para baixo usando agulhas ou fita nas quatro extremidades. Use 70% de etanol para higienizar a pele da área ventral.
4. Faça uma incisão na pele, do pescoço ao abdômen. Remova cuidadosamente a pele da área torácica.
5. Remova cuidadosamente o esterno e as costelas.
6. Lave os pulmões injetando 10 mL de PBS frio diretamente no ventrículo direito, usando uma agulha de 18-21 G, até que os pulmões fiquem completamente brancos.
7. Remova cuidadosamente o timo e o coração sem tocar nos pulmões.
8. Retire suavemente os pulmões dos tecidos circundantes e transfira-os para um tubo com tampão BSA frio (Tabela 1).
   NOTA: Deve-se fazer esforços para remover toda a gordura adjacente dos pulmões antes de preparar ainda mais a suspensão unicelular, pois isso poderia influenciar as leituras.

2. Preparação de suspensão unicelular

1. Transfira os pulmões para uma placa de Petri vazia e pique-os com dois bisturis finos. Transfira todos os pedaços do pulmão picado para um novo tubo cônico de 50 mL. Use 5 mL de tampão de digestão para lavar a placa e adicioná-la ao tubo de 50 mL contendo o pulmão picado (Tabela 1).
   NOTA: O tampão de digestão deve ser preparado imediatamente antes do uso. Use 5 mg/mL de colagenase28. A combinação de 1 ou 5 mg de colagemnase com tampão BSA ou PBS livre de proteínas não melhorou os resultados (Figura Suplementar S1).
2. Fixar a tampa do tubo e digerir o pulmão por 30 minutos em um agitador orbital a uma velocidade de 150 rpm a 37 °C. Pare a reação adicionando 10 mL de tampão BSA frio.
3. Após a digestão, use uma agulha de 18 G para misturar e dissolver os pedaços pulmonares. Coloque um filtro de 70 μm no topo de um novo tubo cônico de 50 mL.
   NOTA: O uso de um filtro de míccro menor pode resultar na perda de grandes populações mieloides.
4. Transfira lentamente a mistura pulmonar digerida diretamente no coador. Use o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 10 mL para esmagar as peças restantes do pulmão no filtro. Lave o material processado no filtro com tampão BSA.
5. Centrifugar a suspensão unicelular a 350 × g por 8 min a 4 °C.
6. Descarte cuidadosamente o supernasciente e resuspenja as células em 1 mL de tampão de lise ACK. Misture bem usando uma tubulação de 1 mL e incubar por 90 s à temperatura ambiente.
7. Adicione 10 mL de tampão BSA frio para parar a reação e centrífuga a 350 × g por 7 min a 4 °C.Descarte cuidadosamente o supernatário e resuspenque a pelota no Tampão de Coloração para contar as células usando um hemócito.
8. Resuspengem as células a uma concentração de 5 × ¹⁰⁶ células/mL e use-as para coloração superficial (ver seção 3).
   NOTA: Para este fim, coloque as células em uma placa de fundo redondo de 96 poços seguida de manchas de anticorpos e lavagens. Se uma centrífuga de placa não estiver disponível, use tubos de fluxo em vez de placas. Com este protocolo, ~15-20 × ¹⁰⁶ células por pulmão podem ser obtidas de um mouse C57BL/6 de 6-10 semanas de idade de tamanho médio.

3. Mancha de anticorpos de superfície

1. Transfira 1 × ¹⁰⁶ células em 200 μL por poço em uma placa de 96 poços. Centrifugar a placa a 350 × g por 7 min a 4 °C. Enquanto isso, prepare a solução de bloco de Fc diluindo anticorpo anti-16/32 (1:100) no tampão de coloração (Tabela 1).
2. Resuspenda as células em 50 μL da solução pré-preparada de bloqueio de Fc (Tabela de Materiais) e incubar por 15-20 min a 4 °C ou no gelo.
3. Adicione 150 μL de tampão de coloração e centrifule a placa a 350 × g por 5 min a 4 °C. Enquanto isso, prepare o coquetel de anticorpos da superfície diluindo anticorpos superficiais (1:100; Tabela 2) no tampão de coloração.
   NOTA: (i) Anticorpo anti-16/32 para bloqueio de Fc pode ser usado com os anticorpos superficiais na mesma mistura. (ii) Se for usado o corante de viabilidade fixável, adicione-o ao coquetel de anticorpos da superfície a uma diluição de 1:100.
4. Resuspenda as células em 50 μL do coquetel de anticorpos de superfície pré-preparado e incubar por 30-40 min a 4 °C no escuro. Lave as células com tampão de coloração duas vezes.
   NOTA: Se não for necessária uma coloração intracelular, resuspensar as células em 200 μL de tampão de coloração e proceder diretamente à aquisição de dados no citómetro de fluxo. Alternativamente, as células podem ser fixadas e armazenadas a 4 °C para aquisição posteriormente. Recomendamos o uso das células para citometria de fluxo dentro de 24 h.

4. Fixação celular e coloração intracelular

1. Prepare o buffer de fixação/permeabilização (Fix/Perm Buffer) misturando três partes do concentrado de fixação/permeabilização e 1 parte da fixação/permeabilização diluída do Conjunto de Buffer de Manchas de Fator FoxP3/Transcrição (Tabela 1).
2. Resuspenque as células em 50 μL do buffer fixo/perm pré-preparado por poço da placa de 96 poços, onde as células foram banhadas como descrito na seção 3, e incuba-las por 20-25 min a 4 °C no escuro.
3. Diluir o tampão de permeabilização de 10x como 1: 10 em água deionizada purificada para preparar 1x tampão de permeabilização.
4. Lave as células uma vez com 1x de tampão de permeabilização. Enquanto isso, prepare o coquetel de anticorpos intracelulares diluindo anticorpos intracelulares (1:100) em 1 mL de tampão de permeabilização.
5. Resuspenque as células usando 50 μL do coquetel de anticorpos de superfície pré-preparado por célula da placa de 96 poços e incubar por 40 min a 4 °C no escuro.
6. Lave as células uma vez com tampão de permeabilização e uma vez com tampão de coloração. Após a lavagem final, resuspenja as células em 200 μL de tampão de coloração.
   NOTA: Se não houver um citómetro de fluxo com leitor de placas, transfira as células para tubos de citometria de fluxo.
7. Adquira um mínimo de 1,5 × ¹⁰⁶ células por amostra no citômetro de fluxo.
   NOTA: Para cores simples e amostras de controle não manchadas, 0,5-1 × ¹⁰⁶ células por amostra serão suficientes. Recomenda-se a titer os anticorpos individuais utilizados para alcançar a coloração ideal e reduzir custos. O presente protocolo foi otimizado usando o Buffer Fix/Perm preparado usando o conjunto de buffer de coloração FoxP3. Como o CD68 é um citoplasmático e não um marcador nuclear, outras soluções de permeabilização, como uma baixa concentração de paraformaldeído ou cytofix/cytoperm kits de vários fornecedores podem ser suficientes.

Resultados

Estratégia gating
O primeiro passo da nossa estratégia de gating é a exclusão dos detritos e dobras (Figura 1A). A exclusão cuidadosa dos doublets é fundamental para evitar populações falso-positivas (Figura Suplementar S2). Em seguida, as células imunes são identificadas usando CD45⁺, um marcador para células hematopoiéticas (Figura 1B). A mancha morta pode ser adicionada para excluir células mortas. ...

Discussão

A identificação de células imunes pulmonares pode ser desafiadora devido aos múltiplos tipos de células imunes residentes no pulmão e suas características imunofenópicas únicas em comparação com suas contrapartes residentes em outros tecidos. Em várias condições patológicas, células com características fenotípicas distintas aparecem nos pulmões. Por exemplo, a lesão pulmonar induzida pela bleomicina resulta no recrutamento de macrófagos derivados de monócitos circulantes no espaço alveolar, onde po...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co