Detecção de vírus e proteínas salivares de um vetor cigarrinha no hospedeiro vegetal

Resumo

Este protocolo demonstra como utilizar o hospedeiro vegetal para detectar proteínas salivares de cigarrinhas e proteínas virais de plantas liberadas por vetores cigarrinhas.

Resumo

Insetos vetores transmitem horizontalmente muitos vírus de plantas de importância agrícola. Mais da metade dos vírus de plantas são transmitidos por insetos hemípteros que têm partes bucais sugadoras de perfuração. Durante a transmissão viral, a saliva do inseto faz a ponte vírus-vetor-hospedeiro porque os vírus vetores da saliva e as proteínas do inseto desencadeiam ou suprimem a resposta imune das plantas dos insetos para os hospedeiros das plantas. A identificação e análise funcional de proteínas salivares estão se tornando uma nova área de foco no campo de pesquisa das interações arbovírus-hospedeiro. Este protocolo fornece um sistema para detectar proteínas na saliva de cigarrinhas usando o hospedeiro da planta. O vetor cigarrinha Nephotettix cincticeps infectado com o vírus anão do arroz (RDV) serve como exemplo. A vitelogenina e a proteína P8 do capsídeo externo principal do RDV vetorado pela saliva de N. cincticeps podem ser detectadas simultaneamente na planta de arroz da qual N. cincticeps se alimenta . Este método é aplicável para testar as proteínas salivares que são temporariamente retidas no hospedeiro da planta após a alimentação do inseto. Acredita-se que este sistema de detecção beneficiará o estudo das interações hemiptera-vírus-planta ou hemiptero-planta.

Introdução

O modo de transmissão vetor-hospedeiro das arboviroses, um problema fundamental, está na fronteira das ciências biológicas. Muitos vírus de plantas de importância agrícola são transmitidos horizontalmente por insetos vetores¹. Mais da metade dos vírus de plantas são vetores por insetos hemípteros, incluindo pulgões, moscas-brancas, cigarrinhas, cigarrinhas e tripes. Esses insetos possuem características distintas que lhes permitem transmitir eficientemente vírus de plantas¹. Possuem partes bucais sugadoras de piercing e se alimentam da seiva do floema e do xilema, e secretam sua saliva 1,2,3,4. Com o desenvolvimento e aprimoramento de técnicas, a identificação e análise funcional de componentes salivares vem se tornando um novo foco de intensas pesquisas. As proteínas salivares conhecidas na saliva incluem inúmeras enzimas, como pectinesterase, celulase, peroxidase, fosfatase alcalina, polifenoloxidase, sacarose,^entre outras5,6,7,8,9,10,11,12,13 . As proteínas presentes na saliva também incluem eliciadores que desencadeiam a resposta de defesa do hospedeiro, alterando o desempenho dos insetos, e efetores que suprimem a defesa do hospedeiro, o que aumenta a aptidão dos insetos e componentes indutores de respostas patológicas do hospedeiro^14,15,16,17. Portanto, as proteínas da saliva são materiais vitais para a comunicação entre insetos e hospedeiros. Durante a transmissão de vírus, a saliva secretada pelas glândulas salivares de insetos virulíferos sugadores de piercing também contém proteínas virais. Os componentes virais utilizam o fluxo de saliva para liberá-los do inseto para o hospedeiro da planta. Portanto, a saliva do inseto faz a ponte entre a interação tritrófica vírus-vetor-hospedeiro. Investigar a função biológica das proteínas da saliva secretadas por insetos virulíferos ajuda a entender a relação vírus-vetor-hospedeiro.

Para vírus animais, é relatado que a saliva de mosquitos medeia a transmissão e patogenicidade dos vírus do Nilo Ocidental (WNV) e Dengue vírus (DENV). A proteína da saliva AaSG34 promove a replicação e transmissão do vírus da dengue-2, enquanto a proteína da saliva AaVA-1 promove a transmissão do vírus DENV e Zika (ZIKV) por ativar a autofagia^18,19. A proteína D7 da saliva de mosquitos pode inibir a infecção por DENV in vitro e in vivo via interação direta com os virions DENV e proteína recombinante do envelope^{DENV 20}. Em vírus de plantas, o begomovírus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induz a proteína salivar Bsp9 da mosca-branca, que suprime a imunidade mediada por WRKY33 do hospedeiro vegetal, para aumentar a preferência e o desempenho da mosca-branca, eventualmente aumentando a transmissão de vírus²¹. Como os estudos sobre o papel que as proteínas salivares de insetos desempenham em hospedeiros vegetais ficaram atrás daqueles de hospedeiros animais, um sistema estável e confiável para detectar as proteínas salivares em hospedeiros vegetais é urgentemente necessário.

O vírus da planta conhecido como vírus anão do arroz (RDV) é transmitido pela cigarrinha Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) com alta eficiência e de forma persistentemente propagativa^22,23. O RDV foi relatado pela primeira vez como transmitido por um inseto vetor e causa uma doença grave do arroz na Ásia^24,25. O virion é icosaédrico e esférico de camada dupla, e a camada externa contém a proteína P8 do capsídeo^{externo 22}. O período de transmissão circulativa do RDV em N. cincticeps é de 14 dias 26,27,28,29,30. Quando o RDV chega às glândulas salivares, os virions são liberados em cavidades armazenadas nas glândulas salivares por meio de um mecanismo semelhante à exocitose²³. A vitelogenina (Vg) é o precursor da proteína da gema essencial para o desenvolvimento oocitário em fêmeas de insetos^31,32,33. A maioria das espécies de insetos tem pelo menos um transcrito Vg de 6-7 kb, que codifica uma proteína precursora de aproximadamente 220 kDa. Os precursores proteicos da Vg geralmente podem ser clivados em fragmentos grandes (140 a 190 kDa) e pequenos (<50 kDa) antes de entrarem no ovário^18,19. Análises proteômicas prévias revelaram a presença dos peptídeos derivados da Vg na saliva secretada da cigarrinha Recilia dorsalis, embora sua função seja desconhecida (dados não publicados). Recentemente é relatado que o Vg, que é secretado por via oral a partir de cigarrinhas, funciona como um efetor para danificar as defesas das plantas³⁴. Não se sabe se o Vg de N. cincticeps também poderia ser liberado para o hospedeiro da planta com fluxo salivar, e então poderia desempenhar um papel na planta para interferir com as defesas da planta. Para determinar se N. cincticeps explora proteínas salivares, como Vg, para inibir ou ativar as defesas da planta, o primeiro passo é identificar as proteínas liberadas para a planta durante a alimentação. O entendimento do método de identificação das proteínas salivares presentes na planta é potencialmente essencial para explicar a função das proteínas da saliva e as interações entre Hemiptera e plantas.

No protocolo aqui apresentado, N. cincticeps é usado como exemplo para fornecer um método para examinar a presença de proteínas salivares no hospedeiro vegetal introduzidas através da alimentação de insetos. O protocolo detalha principalmente a coleta e detecção de proteínas salivares e é útil para investigações adicionais na maioria dos hemípteros.

Protocolo

As cigarrinhas adultas não virulíferas foram propagadas no Centro de Pesquisa de Vírus Transmitidos por Vetores da Universidade de Agricultura e Florestas de Fujian, China.

1. Criação de insetos não virulíferos

1. Recuar os adultos em mudas de arroz em uma gaiola cúbica de 40 cm x 35 cm x 20 cm (comprimento x largura x altura). Mantenha um lado da gaiola coberto com uma rede à prova de insetos para ventilação.
   1. Mantenha as gaiolas com cigarrinhas em uma incubadora que contenha um controlador de umidade embutido a 26 °C com uma umidade relativa de 60-75% sob um fotoperíodo de 16 h claro e 8 h escuro.
2. Use um aspirador para transferir suavemente todos os adultos de sua gaiola para uma nova gaiola que contenha mudas de arroz fresco a cada semana.
   1. Deixe mais de 200 adultos acasalar e colocar ovos no arroz.
   2. Retenha as mudas velhas de arroz para que as ninfas surjam. Leve essas novas ninfas não virulíferas para o estágio de 2 ínstares.

2. Aquisição de vírus e coleta de insetos virulíferos

1. Transfira cuidadosamente as ninfas não virulíferas de 2 ínstares para um tubo de cultura de vidro (2,5 cm de diâmetro por 15 cm de altura) por 1-2 h para inanição usando o aspirador.
   1. Solte as ninfas em uma gaiola que contém uma planta de arroz infectada por RDV cultivada em um vaso.
   2. Deixe as ninfas se alimentarem da planta de arroz infectada por 2 dias.
      NOTA: Regue cuidadosamente a planta de arroz e evite lavar as ninfas. As ninfas de 2 ínstares têm aproximadamente 1,6-2 mm de comprimento.
2. Transfira cuidadosamente essas ninfas para uma nova gaiola que contenha mudas frescas de arroz livres de vírus com umidade relativa de 60-75% sob fotoperíodo de 16 h claro e 8 h escuro. Permitir que as ninfas se alimentem da planta de arroz infectada por 12 dias para completar o período de transmissão circulativa do RDV.

3. Coleta de proteínas salivares utilizando gaiola de alimentação

1. Prepare cinco pequenas gaiolas de alimentação semelhantes a tubos (2,5 cm de diâmetro por 4 cm de altura) nas quais uma extremidade é coberta com rede à prova de insetos.
2. Confine 15-20 cigarrinhas em cada gaiola de alimentação e, em seguida, cubra a outra extremidade da gaiola com uma esteira de espuma fina.
   1. Fixe uma muda de arroz (5-6 cm de altura) entre a extremidade da gaiola e uma esteira de espuma com fitas. Certifique-se de que as cigarrinhas na gaiola de alimentação possam se alimentar das mudas de arroz expostas ao interior da gaiola.
3. Mergulhe as raízes da muda em água para que a planta de arroz permaneça viva. Deixe as cigarrinhas se alimentarem delas por 2 dias.
4. Retire as cigarrinhas de suas gaiolas de alimentação e colete as mudas de arroz nas quais elas se alimentaram. Corte as partes das mudas fora da gaiola e recupere as regiões alimentícias das mudas.
   NOTA: Esta amostra pode ser armazenada a -80 °C durante no máximo 3 meses, se não for utilizada instantaneamente para detecção.

4. Preparação dos reagentes

1. Dissolva 15,1 g de Tris-base, 94 g de glicina e 5 g de SDS em 1 L de água estéril para preparar o tampão 5xTris-glicina. Diluir 200 ml de tampão 5xTris-glicina com 800 ml de água estéril para preparar tampão 1xTris-glicina (ver Tabela 1 para composição do tampão).
2. Dissolver 80 g de NaCl, 30 g de Tris-base e 2 g de KCl em 1 L de água estéril para preparar tampão salino tamponada com 10xTris (TBS). Autoclave a solução a 121 °C durante 15 min.
3. Dissolver 8 g de SDS, 4 mL de ß-mercaptoetanol, 0,02 g de azul de bromofenol e 40 mL de glicerol em 40 mL de Tris-HCl 0,1 M (pH 6,8) para preparar 4x tampão de amostra de proteína.
4. Misturar 800 mL de tampão Tris-glicina com 200 mL de metanol para preparar o tampão de transferência.
5. Adicionar 100 mL de solução de 10xTBS e 3 mL de Tween 20 a 900 mL de água estéril para preparar o tampão TBS com solução de Tween 20 (TBST).

5. Western blotting para detectar a saliva e proteínas virais

1. Triture 0,1 g das amostras de arroz com nitrogênio líquido até que o tecido se torne um pó. Adicionar 200 μL de tampão de amostra de proteína 4x à amostra e fervê-la por 10 min. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 10 min à temperatura ambiente.
   1. Retire o sobrenadante e coloque-o num frasco novo. Carregar 10 μL da amostra em um gel SDS-PAGE e executá-lo em tampão Tris-glicina a 150 V por 45-60 min.
      OBS: O resíduo após centrifugação pode ser descartado.
2. Coloque uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm e outros suprimentos de sanduíche no tampão de transferência por 30 min.
   NOTA: Esta etapa pode ser feita antes que o gel tenha concluído sua execução.
3. Sanduíche o gel e transfira-o por 90-120 min a 100 V no buffer de transferência.
4. Pegue a membrana e coloque-a em solução de bloqueio de leite seco a 7% sem gordura em solução de TBST por 20 min. Adicionar o anticorpo específico contra RDV P8 ou Vg a uma solução a 7% de leite em pó desnatado em TBST. Incubar com o anticorpo para colorir a membrana por 2 h ou durante a noite.
5. Lave a membrana com solução de TBST três vezes, com 5 min de lavagem de cada vez.
6. Adicionar a IgG anti-coelho de cabra como anticorpo secundário a 7% de leite em pó desnatado com TBST. Incubar com o anticorpo por 60-90 min à temperatura ambiente.
7. Lave a membrana com solução de TBST três vezes por 5 min de cada vez.
8. Use o kit ECL Western para o método quimioluminescente. Misture os reagentes de detecção 1 e 2 no kit na proporção de 1:1 em um tubo. Coloque o reagente misto na membrana e incube a mancha por 5 min.
9. Escorra o excesso de reagente e tire uma foto colorimétrica da imagem quimioluminescente. Combine-os para ver a escada com bandas de proteínas.

Resultados

A Figura 1 ilustra todas as etapas desse protocolo: criação de insetos, aquisição de vírus, coleta de proteínas salivares via alimentação do arroz e western blot. Os resultados de western blots mostraram que bandas específicas e esperadas de aproximadamente 220 kDa foram observadas nas amostras de arroz alimentado e glândulas salivares de insetos na membrana incubada com anticorpos contra Vg. Em contraste, nenhuma banda foi observada na amostra de arroz não alimentado. O ...

Discussão

A saliva secretada diretamente pelas glândulas salivares dos insetos perfurocortantes desempenha um papel fundamental, pois predigere e desintoxica os tecidos do hospedeiro e os fatores biológicos cruzados dos vetores nos hospedeiros ^1,3,4. Os fatores biológicos entre reinos, incluindo eliciadores, efetores e pequenos RNAs, são críticos para a comunicação inseto-hospedeiro^14,15,16

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tris base	Roche	D609K69032	For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5×Tris-glycine buffer preparation
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5×Tris-glycine buffer preparation
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10×TBS buffer preparation
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10×TBS buffer preparation
ß-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4× protein sample buffer preparation
bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4× protein sample buffer preparation
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4× protein sample buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
Buffers and Solutions
Buffer	Composition		Comments/Description
5×Tris-glycine buffer	15.1 g Tris base 94 g glycine  5 g SDS in 1 L sterile water		Stock solution
1×Tris-glycine buffer	200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water		Work solution, for SDS-PAGE
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer	80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water		Stock solution
TBS with Tween 20 (TBST) solution	100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water		Work solution
4× protein sample buffer	8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)		For protein extraction
Transfer buffer	800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol		For protein transfer
Instruments
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4x protein sample buffer preparation
Constant temperature incubator	Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.	PRX-1200B	For rearing leafhoppers
Electrophoresis	Tanon Science & Technology Co.,Ltd.	Tanon EP300	For SDS-PAGE
Electrophoretic transfer core module	BIO-RAD	1703935	For SDS-PAGE
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4x protein sample buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5x Tris-glycine buffer preparation
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
High-pass tissue grinding instrument	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	JXFSIPRP-24	For grinding plant tissues
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10x TBS buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Mini wet heat transfer trough	BIO-RAD	1703930	For SDS-PAGE
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10x TBS buffer preparation
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
Pierce ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
Protein color instrument	GE Healthcare bio-sciences AB	Amersham lmager 600	For detecting proteins
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5x Tris-glycine buffer preparation
Tris base	Roche	D609K69032	For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
Vertical plate electrophoresis tank	BIO-RAD	1658001	For SDS-PAGE
Water bath	Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.	XMTD-8222	For boil the protein samples
β-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4x protein sample buffer preparation