Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos

Resumo

O padrão-ouro em cardiologia para experimentos funcionais celulares e moleculares são os cardiomiócitos. Este artigo descreve adaptações à técnica não-Langendorff para isolar cardiomiócitos de camundongos.

Resumo

A necessidade de métodos reprodutíveis, porém tecnicamente simples, que produzam cardiomiócitos de alta qualidade é essencial para a pesquisa em biologia cardíaca. Experimentos funcionais celulares e moleculares (por exemplo, contração, eletrofisiologia, ciclagem de cálcio, etc.) em cardiomiócitos são o padrão-ouro para estabelecer mecanismo(s) de doença. O camundongo é a espécie de escolha para experimentos funcionais e a técnica descrita é específica para o isolamento de cardiomiócitos de camundongos. Métodos anteriores que requerem um aparelho de Langendorff requerem altos níveis de treinamento e precisão para a canulação aórtica, muitas vezes resultando em isquemia. O campo está mudando para métodos de isolamento livres de Langendorff que são simples, são reprodutíveis e produzem miócitos viáveis para aquisição de dados fisiológicos e cultura. Esses métodos diminuem muito o tempo de isquemia em relação à canulação aórtica e resultam em cardiomiócitos obtidos de forma confiável. Nossa adaptação ao método livre de Langendorff inclui uma perfusão inicial com solução de limpeza gelada, uso de uma plataforma estabilizadora que garante uma agulha estável durante a perfusão e etapas adicionais de digestão para garantir cardiomiócitos obtidos de forma confiável para uso em medidas funcionais e cultura. Este método é simples e rápido de executar e requer pouca habilidade técnica.

Introdução

Há décadas, uma ideia essencial na literatura de biologia cardíaca é o mecanismo molecular de ação. O mecanismo de ação deve ser estabelecido para a publicação de estudos confiáveis. Uma estratégia bem estabelecida para determinar o mecanismo molecular são os estudos isolados de cardiomiócitos, que requerem cardiomiócitos de alta qualidade para a obtenção de dados confiáveis. Experimentos celulares e moleculares realizados em cardiomiócitos para determinar o mecanismo de ação são o padrão-ouro para investigar contração¹, eletrofisiologia², ciclagem de cálcio (Ca²+)³, miofilamento Ca²⁺ sensibilidade⁴, citoesqueleto⁵, metabolismo⁶, efeitos de hormônios⁷, moléculas sinalizadoras⁸, estudos de fármacos⁹ etc. O camundongo tornou-se a espécie de escolha para a maioria dos experimentos de biologia cardíaca devido à facilidade de manipulação genética, seu pequeno tamanho, sua vida útil relativamente curta, baixo custo, etc¹⁰. No entanto, o isolamento confiável de cardiomiócitos de camundongos de alta qualidade não é trivial com as técnicas atuais.

Os laboratórios vêm isolando cardiomiócitos há quase 70 anos¹¹. Praticamente todas as técnicas para isolar cardiomiócitos dependem da digestão do coração através de várias enzimas (colagenase, protease, tripsina, etc.). Nos primeiros períodos (décadas de 1950-1960), foi empregado o método chunk, que envolvia a remoção do coração, o corte em pedaços bem menores e a incubação em solução com colagenase/protease/tripsina¹². Na década de 1970, os laboratórios implementaram o método de "Langendorff"^melhorado13, que isolava cardiomiócitos usando uma técnica de isolamento baseada na perfusão coronariana (perfusão retrógrada com enzima via aparelho de Langendorff); Esta técnica continua sendo o método dominante de isolamento de miócitos no campo hoje, ~50 anos depois^14,15,16. Trabalhos recentes passaram a cularizar o coração in vivo para limitar o tempo de hipóxia e o dano isquêmico, resultando em isolamentos superiores de cardiomiócitos (melhor rendimento e maior qualidade)¹⁷. Recentemente, este evoluiu para a realização in vivo de perfusões cardíacas livres de Langendorff 18,19,20,21,22. Evoluímos a técnica de isolamento de cardiomiócitos sem Langendorff baseada na técnica de Ackers-Johnson et ^al.18 e adaptamos vários componentes das várias técnicas de isolamento anteriores. Essas principais adaptações incluem a injeção de um tampão de limpeza gelado e a incorporação de uma plataforma de suporte para estabilizar a agulha, permitindo a diminuição da manipulação do coração. Também é detalhado nessa técnica o controle da temperatura dos tampões injetados (37 °C), que diminuiu o tempo entre a injeção in vivo e a digestão devido à menor perfusão com EDTA, como publicado anteriormente¹⁸. Diminuindo a manipulação do coração e, portanto, minimizando o tamanho do local de punção, obtém-se perfusão completa e constante das artérias coronárias. Também refinamos a técnica com um método secundário de digestão, a quantidade de EDTA no tampão de limpeza injetado e mudamos o pH. Nossa técnica descrita é mais confiável, mais eficiente e não requer treinamento/prática extensiva em comparação com o uso do aparelho de Langendorff (Tabela 1).

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Protocolo

Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Ohio State University, de acordo com as diretrizes do NIH.

1. Preparação da solução

NOTA: Consulte o quadro 2 para as concentrações de tampão.

1. Pré-isolamento (até 2 semanas antes do isolamento do miócito)
   1. Base tampão de perfusão: Preparar 1 L de base tampão de perfusão (NaCl, KCl, NaH 2PO 4, HEPES, Glicose e BDM) em 1 L de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H₂O. Ajustar para pH_7,4 antes da filtração estéril de 0,22 μm. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento.
   2. Tampão de limpeza: Prepare 1 L de tampão de limpeza (NaCl, KCl, NaH 2PO 4, HEPES, Glicose, EDTA e BDM) em 1 L de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H₂O. Ajuste para pH_7,4 antes da filtração estéril de 0,22 μm. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento.
   3. Solução-mãe de CaCl 2 100 mM: Pesar 1,11 g de CaCl 2 e dissolver em 100 mL de solução ultrapura de 18,2 MΩ·cm H₂ O. Conservar à temperatura ambienteaté ao dia do isolamento.
   4. Alíquotas de liberase: Dissolver 5 mg de enzimas digestivas em 5 mL de água estéril e livre de RNase. Preparar alíquotas de 0,8 ml e conservar a -20 °C até ao dia do isolamento.
   5. Laminar os pratos: Aplicar 100 μL de laminina de rato a 40 μg/mL de laminação de Petri de 30 mL estéreis. Deixe descansar por 30 min e remova o excesso de laminina. Coloque a laminina em uma placa de Petri com incubação UV à temperatura ambiente por 30 min. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento (podem ser utilizadas placas de Petri laminadas até 2 semanas).
   6. Meio DMEM: Em uma cabine de biossegurança, adicionar 2,5 mL de FBS, 0,5 mL de Penicilina-Estreptomicina (50 U/mL-50 μg) e 1 mL de BDM 500 mM a 46 mL de DMEM. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento (os meios podem ser utilizados até 2 semanas).
   7. Meio M199: Preparar 1 L de meio M199 (NaHCO₃, HEPES, L-glutationa, M199, BDM e BSA) em 1 L de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H₂O. Ajustar para pH 7,4 antes da filtração estéril (filtro de 0,22 μm). Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento.
   8. Estoque de BDM 500 mM: Adicionar 0,5 g de BDM a 10 mL de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H₂O. Conservar a 4 °C até o dia do isolamento.
   9. Criação de plataforma estabilizadora: Molde a massa em torno da base da agulha rosqueada na torneira Luer. Molde para a placa de Petri que irá conter o coração e garantir que a agulha está na altura adequada para a injeção ventricular (~5 mm acima do fundo do prato).
2. O dia do isolamento
   1. Tampão de perfusão: No dia do isolamento, adicionar 9,5 mg de MgCl₂ a 100 mL de tampão base de perfusão. Deixe misturar completamente antes de remover 30 mL de tampão de perfusão completo e coloque em um frasco de vidro limpo e de boca larga de 100 mL com uma tampa de tampa de rosca (tampão de digestão).
      NOTA: Estas adições podem ser feitas no dia do isolamento sem ajustes adicionais de pH, pois sua adição altera insignificantemente o pH.
      1. Retirar 12 mL de tampão de perfusão e ajustar para o lado (stop buffer). Despeje os 58 mL restantes de tampão de perfusão em outro frasco de vidro limpo, de boca larga e 100 mL com tampa de rosca. Conservar o tampão de perfusão restante a 37 °C durante todo o isolamento.
   2. Tampão de digestão: Adicionar 7,5 μL de CaCl₁₀₀ mM 2 a 30 mL de tampão de perfusão para uma concentração final de 25 μM. Imediatamente antes do isolamento, adicionar 770 μL de Liberase ao tampão de digestão para uma concentração final de 26 μg/mL.
   3. Tampão de parada: Dissolver 240 mg de BSA em 12 mL de tampão de perfusão. Conservar a 37 °C durante todo o isolamento.
   4. Tampão de limpeza: Prepare uma seringa de 3 mL de tampão de limpeza e limpe a agulha de bolhas. Conservar no gelo até ao isolamento.

2. Preparação do coletor

1. Limpe o coletor com temperatura controlada com tampão de perfusão recém-preparado, tomando cuidado para garantir que não restem bolhas. Usando um conector Luer lock, rosqueie em uma agulha de 27 G e livre de bolhas. Uma variedade limpa é essencial para um isolamento bem-sucedido.

3. Preparo dos animais

1. Injetar o rato por via intraperitoneal com 100 mg/kg de quetamina e 20 mg/kg de xilazina em peso corporal imediatamente antes do isolamento. Este procedimento foi utilizado em um camundongo C57Bl/6 macho, com 4 meses de idade.
2. Se necessário, coloque o mouse em uma almofada cirúrgica aquecida para incentivar a sedação. Tenda os braços do rato, e tape os membros e base da cauda para uma fralda de laboratório azul. Certifique-se de que o animal esteja totalmente anestesiado pela retirada do reflexo de pinça dos dedos. Aplique um pano estéril ao redor da área cirúrgica.

4. Procedimento de isolamento de cardiomiócitos

1. Expor o esterno do camundongo e, lateralmente à linha média, cortar proximalmente através das costelas e da axila. Corte suavemente totalmente o diafragma, garantindo cortes rasos para evitar o coração. Aperte o esterno com um hemostático e dobre as costelas para trás para expor a cavidade torácica.
2. Remover suavemente o pericárdio do coração e cortar totalmente através da veia cava inferior, imediatamente distal ao coração. Use uma seringa de 3 mL com uma agulha de 27 G para injetar rapidamente 3 mL de tampão de limpeza gelado no ventrículo direito do coração durante 1 minuto.
3. Segure suavemente o coração usando uma pinça e afaste-se do corpo, expondo o máximo possível da aorta. Usando um hemostático, pinça a aorta ascendente, tomando cuidado para não apertar os átrios, e extirpe o coração do tórax.
4. Transfira rapidamente o coração pinçado para a tampa de uma placa de Petri de polipropileno com aproximadamente 10 mL de tampão de perfusão quente. Coloque o coração pinçado na plataforma de suporte e use uma agulha estabilizada de 27 G conectada ao coletor para injetar 10 mL de tampão de perfusão de 37 °C com temperatura controlada no ventrículo esquerdo durante 5 minutos.
5. Transfira o coração pinçado e a plataforma de suporte para uma placa de Petri com aproximadamente 5 mL de tampão de digestão. Troque as seringas de entrada por uma seringa de 50 mL com 25 mL de tampão de digestão.
6. Limpe o coletor de quaisquer bolhas e o tampão de perfusão restante antes da injeção. Substitua cuidadosamente a agulha na mesma posição da agulha no ápice do ventrículo esquerdo.
7. Use uma bomba de perfusão para injetar tampão de digestão de 37 °C com temperatura controlada no ventrículo esquerdo por 15 minutos usando uma seringa de 50 mL. Controlar a temperatura da solução com uma camisa de água previamente calibrada para ejetar a solução de 37 °C na extremidade da agulha.
8. Retire os ventrículos dos átrios e transfira para um copo de 10 mL. Adicione 3 mL de tampão de digestão ao copo e, usando uma tesoura afiada, corte os ventrículos em pedaços grandes. Cubra o copo com papel alumínio e coloque em banho-maria pré-aquecido a 37 °C por 5 min.
9. Descarte o sobrenadante, tomando cuidado para evitar a retirada de pedaços de tecido. Ressuspender os pedaços de tecido em 3 mL de tampão de digestão e triturar por aproximadamente 4 min ou até que uma mistura homogênea seja alcançada.
10. Filtrar as células através de um filtro de células de nylon de 70 μm para um tubo de polipropileno de 50 mL.
11. Retorne o filtrado a um tubo de polipropileno de fundo redondo de 14 mL e centrifuja por 1 min a 100 rpm. Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender o pellet em 3 ml de tampão stop.
12. Adicionar 54 μL de CaCl 2 100 mM às células ressuspensas para uma concentração final de CaCl₂ de 1,8 mM. Esta etapa também pode ser realizada passo a passo para aumentar o rendimento celular.
13. Deixe as células vivas se acomodarem por gravidade por 10 minutos antes de remover o sobrenadante que contém células mortas. Ressuspender o pellet em solução de armazenamento (solução de perfusão com 200 μM de CaCl₂). Essas células agora podem ser usadas para experimentos funcionais (por exemplo, imagem/contração de cálcio, patch clamp, etc.), cultura, etc.
    NOTA: As células também podem ser ressuspensas em soluções dependentes de laboratório ou experimento.

5. Cultura celular

1. Conte as células usando um hemocitômetro ou por uma contagem de visão de campo usando uma folha de cobertura quadriculada. Como os miócitos são muito grandes, a contagem por hemocitômetro nem sempre é precisa. Isso é usado para se ter uma ideia de aproximadamente quantas células foram obtidas a partir do isolamento.
2. Diluir as células para ~25.000 células/mL com meio DMEM. Adicionar 1 ml de solução celular a cada poço.
3. Incubar a 37 °C, 95% O 2, 5% CO 2 durante₂ h.
4. Aspirar suavemente o meio DMEM de cada poço e adicionar 2 mL do meio M199.
5. Incubar a 37 °C, 95% O 2, 5% CO₂ por até 24 h.

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Resultados

Há alguns elementos a serem examinados ao determinar o sucesso de um isolamento. Primeiro, os cardiomiócitos devem ser em forma de bastonete, sem bolhas de membrana, como as células isoladas na Figura 1. Um isolamento típico produzirá ~80% dos miócitos em forma de bastonete. Se o isolamento produzir algo menos do que 50% de células em forma de bastonete, então é considerado um isolamento malsucedido e cardiomiócitos não são usados. Por fim, os cardiomiócitos devem ser quiescente...

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Discussão

A principal vantagem de nossa técnica de isolamento de cardiomiócitos sem Langendorff é que ela limita a hipóxia e o tempo de isquemia por não necessitar de canulação para um aparelho de Langendorff. Alternativamente às técnicas clássicas de Langendorff que levam vários minutos para remover, limpar e pendurar o coração, muitas vezes resultando em dano isquêmico ao miócito, nosso método inclui uma limpeza in vivo do sangue por meio de uma solução de limpeza gelada. O tampão de limpeza ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815