Controle da adesão celular usando técnicas de padronização de hidrogel para aplicações em microscopia de força de tração

Resumo

A litografia quase UV e a microscopia de força de tração são combinadas para medir forças celulares em hidrogéis micropatterados. A liberação induzida por luz direcionada de células únicas permite um alto número de medições na mesma amostra.

Resumo

A microscopia de força de tração (TFM) é o principal método utilizado na mecanobiologia para medir forças celulares. Comumente isso está sendo usado para células que aderiram a substratos macios planos que se deformam sob tração celular (2D-TFM). O TFM conta com o uso de materiais elásticos lineares, como polidimtilsiloxano (PDMS) ou poliacrilamida (PA). Para o 2D-TFM em PA, a dificuldade em alcançar alto rendimento resulta principalmente da grande variabilidade das formas e trações celulares, exigindo padronização. Apresentamos um protocolo para fabricar de forma rápida e eficiente hidrogéis pa micropatterned para estudos 2D-TFM. Os micropatterns são criados pela primeira vez pela fotolitografia sem máscara usando luz quase UV onde proteínas de matriz extracelular se ligam apenas às regiões micropatteradas, enquanto o resto da superfície permanece não-adesiva para células. A micropattersagem de proteínas de matriz extracelular deve-se à presença de grupos de aldeídos ativos, resultando em regiões adesivas de diferentes formas para acomodar células únicas ou grupos de células. Para as medições de TFM, usamos hidrogéis pa de diferentes elasticidade, variando as quantidades de acrilamida e bis-acrilamida e rastreando o deslocamento de contas fluorescentes incorporadas para reconstruir campos de tração celular com cytometria de tração de quatro e quatro tração regularizada (FTTC).

Para alcançar ainda mais o registro preciso das forças celulares, descrevemos o uso de uma dose controlada de luz padronizada para liberar trações celulares em regiões definidas para células únicas ou grupos de células. Chamamos este método de microscopia de força de tração UV local (LUVI-TFM). Com o tratamento enzimático, todas as células são separadas da amostra simultaneamente, enquanto com luvi-TFM forças de tração de células em diferentes regiões da amostra podem ser registradas em sequência. Demonstramos a aplicabilidade deste protocolo (i) para estudar as forças de tração celular em função da adesão controlada ao substrato, e (ii) para obter um maior número de observações experimentais a partir da mesma amostra.

Introdução

Ao interagir com seu ambiente extracelular, as células aderentes exercem forças que são mediadas principalmente por aderências focais baseadas em integrin que conectam a matriz extracelular (ECM) ao citoesqueleto de actina. As aderências focais são conjuntos multiproteínas que são centrados em torno da ligação de integrins a proteínas ECM como fibronectina e colágeno. O agrupamento integrino e o crescimento das aderências focais são cruciais não apenas para o estabelecimento de uma conexão mecanicamente estável, mas também para o recrutamento de outras proteínas de adesão focal, incluindo aquelas que ativam o caminho rhoa para a regulação da contratilidade ^celular1. A contratibilidade dependente de RhoA do citoesqueleto de actina permite que as células se espalhem e migrem sobre o ECM subjacente, e também para sentir sua ^rigidez2. A distribuição das forças de tração depende fortemente da área e forma das células, ambas baseadas em propriedades matriciais e, portanto, impactam a organização citoesqueletal, eventualmente formando um ciclo de feedback fechado entre a mecânica matricial e a organização citoesquelética3,4.

As técnicas de micropattering superficial permitem um controle definido da forma celular, criando regiões do tamanho de micron, apresentando proteínas adesivas ECM; de acordo com o tamanho dessas regiões, células únicas ou grupos de células que aderem ao micropattern5. As proteínas ECM podem ser padronizadas em substratos de vidro por diferentes abordagens, como impressão de microcontatos, modelagem fotográfica ou padronização a ^laser6. O uso de luz UV (λ = 185 ou 375 nm) combinado com estratégias de anti-envelhecimento da superfície oferece a flexibilidade para projetar diferentes formas e tamanhos e imobilização de múltiplos tipos de proteínas com uma alta precisão perto das bordas ^{superficiais7,8}. As regiões revestidas com produtos químicos repelentes de proteínas, como o polietileno glicol (PEG) são protegidas com um fotomask de cromo ou um sistema de litografia sem máscara baseado em DMD. Os padrões nas máscaras permitem a exposição à luz UV de regiões que serão então padronizadas com proteínas ECM. A padronização das superfícies de hidrogel com proteínas ECM requer uma etapa de transferência para remover proteínas da superfície do vidro e ligá-las aos padrões. Alternativamente, a padronização em materiais macios pode ser alcançada primeiro revestindo a máscara fotográfica com uma proteína repelente, seguida pela queima das regiões desmascaradas usando iluminação UV profunda. Como o UV profundo gera ozônio e torna a superfície reativa para a ligação de proteínas, as regiões desmascaradas são revestidas com proteínas ECM e, finalmente, o gel é polimerizado diretamente em cima das regiões ^{desmascaradas9,10}.

Os hidrogéis padronizados podem ser usados para executar o TFM, uma técnica que mede as forças celulares na interface de material ^celular11. Em 2D-TFM, usa-se a superfície plana de uma película polímera espessa, na qual contas de marcador foram incorporadas para rastrear deformações12,13,14,15. Para extrair vetores de deslocamento, é essencial combinar duas imagens, uma do estado deformado e uma de referência sem deformações. As duas imagens são então mapeadas umas nas outras com processamento de imagem. Em alta densidade de marcadores, isso geralmente é feito com a Velocimetria de Imagem de Partícula (PIV), que é um método bem estabelecido para reconstruir o fluxo hidrodinâmico. Com baixa densidade de marcadores e em 3D-TFM, isso geralmente é feito com Velocimetria de Rastreamento de Partículas (PTV), que inclui características específicas do conjunto de dados experimentais. Um exemplo de uma alternativa computacionalmente mais barata é o fluxo óptico, como o algoritmo Kanade-Lucas-Tomasi (KLT⁾¹⁶. No caso dos substratos de hidrogel, as contas fluorescentes são geralmente incorporadas em alta densidade durante a polimerização do material, e as imagens são gravadas antes e depois da liberação celular após o descolamento enzimático. O descolamento enzimático das células aderentes, por exemplo, por trippsinização, leva à liberação simultânea de trações celulares de todas as células nos hidrogéis, dificultando a obtenção de uma análise detalhada de um alto número de células.

Aqui apresentamos um protocolo para preparar hidrogéis micropatterados para controlar a forma e localização celular e um método para medir eficientemente as forças de tração em sequência usando UV para separar células individuais do substrato. Para medições de força de tração, apresentamos uma técnica para produzir hidrogéis pa de duas camadas, onde contas fluorescentes são incorporadas apenas na camada superior, o que aumenta sua densidade e reduz sua propagação vertical. A combinação da liberação mediada por UV de forças de tração celular com a micropatterning permite obter controle espacial sobre o descolamento celular (por exemplo, de células únicas sem afetar a adesão de outras células na região de interesse), desde que haja uma distância suficiente entre as células padronizadas. A tração celular é então reconstruída usando o método mais eficiente e confiável para 2D-TFM, ou seja, Fourier Transform Traction Cytometria (FTTC) com ^{regularização17,18}.

Protocolo

1. Preparação de tampas metacrilatadas

NOTA: As tampas de vidro são metacrilatadas para ligar covalentemente os hidrogéis PA e, portanto, evitar seu desprendimento durante a incubação com células. As tampas de vidro do microscópio são usadas para alcançar alta qualidade de imagem.

1. Para preparar uma solução de 300 mL, pegue um copo de vidro limpo de 400 mL e coloque-o dentro de um capô de fumaça.
2. Adicione 10 mL de água dupla destilada (_ddH2O) no béquer. Adicione 18,75 mL de ácido acético (≥99,8% pro análise, p.a.), 18,75 mL de 3-(Trimethoxysilyl)methacrilato propil e 252,5 mL de etanol (≥99,8% a.a.) utilizando um pipetatorlógico. Despeje a solução em um prato cristalizador.
3. Limpe tampas de vidro redondo de 24 mm com lenços de precisão. Coloque as tampas em um rack de politefluoretileno feito sob medida.
4. Mergulhe o rack na solução e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente (RT).
5. Pegue o rack e enxágue todas as tampas com etanol (99,8% a.a.). Seque as tampas sob o fluxo de ar.
   NOTA: As tampas methacrilated podem ser armazenadas por até 1 mês na RT.

2. Micropatterning de proteínas de matriz extracelular em tampas de vidro

NOTA: As tampas de vidro são primeiro revestidas com uma camada de moléculas, compostas por proteínas e repelente celular. Esta camada é então removida usando uma técnica de fotopatterning, para permitir a deposição subsequente de proteínas de matriz extracelular em regiões micropatteradas.

1. Pegue uma tampa de vidro redonda de 15 mm e coloque-a em uma placa de Petri. Use uma caneta de diamante para marcar o lado superior da mancha de cobertura. Em seguida, prossiga para a limpeza via tratamento de plasma de oxigênio a 0,4 mbar e 200 W por 2 min.
2. Pipeta 100 μL de solução de 0,01% de poli-L-lisina na superfície de cada deslizamento de cobertura. Incubar por 30 min no RT. Lave as tampas com 10 mM 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) pH 8.5. Remova qualquer excesso de líquido, mas mantenha a superfície molhada.
3. Pipeta 100 μL de 50 mg/mL poly (etileno glicol) ácido succinimidyl succinimidyl (mPEG-SVA) em 10 mM HEPES pH 8,5 na superfície de cada deslizamento de cobertura. Incubar por 1 h na RT. Enxágue as tampas com 10 mM HEPES pH 8,5 e seque sob o fluxo de ar.
4. Adicione 2 μL de fotoinitiador sensível a UV (por exemplo, PLPP-gel) seguido de 40 μL de etanol (≥99,8% a.a.) na superfície. Para obter uma distribuição homogênea do gel e do etanol na superfície, incline suavemente a placa de Petri para frente e para trás. Aguarde 5 minutos para a solução polimerizar.
5. Coloque uma única mancha de cobertura dentro de uma placa de Petri de 35 mm com um orifício de 20 mm na parte inferior. Isso permite que o raio laser vindo de baixo para alcançar diretamente a superfície de vidro.
6. Ligue o microscópio e um módulo de padronização de luz (trabalhar com este dispositivo só é permitido após uma introdução de segurança dos oficiais de segurança a laser). Calibrar o laser UV-A no objetivo de ar de 20x. Coloque a amostra com o fotoinitidor no palco. Ajuste o foco na superfície do vidro e ligue o controle de foco. Carregue e bloqueie o padrão pré-desenhado.
   1. Prepare o padrão usando um software gráfico como o Inkscape. Certifique-se de que o arquivo padrão não exceda as dimensões DMD (1824 x 1140 px, que corresponde a 552 x 325 μm em 20 x lente (0,28 μm/px)).
      NOTA: Recomenda-se usar o tamanho DMD (1824 x 1140 pixels) como o tamanho do arquivo padrão, pois isso não garantirá nenhum erro durante a padronização. Por exemplo, não produza um arquivo padrão com dimensão de 1830 x 1130 pixels.
   2. Para fins de transferência de padrão para poliacrilamida, certifique-se de que a padronização seja feita apenas até 60%-70 % do raio do centro do vidro até a borda.
   3. Para padronizar uma única célula, use um diâmetro de 50-100 μm com a distância de 100 μm entre padrões e um diâmetro de 150-300 μm para um grupo celular. O tamanho do padrão apropriado depende muito do tamanho típico da célula, e tem que ser suficientemente grande para permitir que as células aderam.
7. Inicie a padronização por dose UV de 30 mJ/^mm2. A duração da padronização depende do número de padrões. Fazer um único padrão leva aproximadamente 1 s.
8. Após completar a etapa de padronização, enxágüe a superfície com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) três vezes. Incubar a amostra com 100 μL de fibronectina de 25 μg/mL dissolvida em 1x PBS e 25 μg/mL fibrinogen Alexa488 conjugado em PBS por 1 h no RT. Para outras proteínas ECM, encontre as concentrações ideais cobrindo completamente as regiões padronizadas.
9. Enxágüe a superfície com 1x PBS três vezes. Certifique-se de que o vidro padronizado seja imediatamente utilizado para transferência de vidro-PA. Armazene o vidro estampado em PBS na RT durante a preparação do hidrogel.

3. Fabricação de hidrânis de poliacrilamida padronizados

NOTA: São preparados hidgel de poliacrilamida, incluindo acrilamida de N-hidroxitila oxidada (HEA) para apresentar grupos de aldeído reativo para a ligação covalente de proteínas matricitárias na superfície. Além disso, uma abordagem de camada dupla para incorporar contas fluorescentes apenas na camada superior do hidrogel é usada para melhorar o registro de deslocamento de contas durante experimentos de microscopia de força de tração.

1. Coloque as tampas de vidro com metanfetamina em uma placa de Petri.
2. Para preparar a solução HEA oxidada fresca, adicione 9,55 mL de água duplamente destilada em um tubo de centrífuga de 15 mL. Em seguida, adicione 0,5 mL de HEA e 42 mg de sódio (meta)periodate para obter 10 mL da solução. Mexa continuamente a solução no escuro por 4h.
3. Misture acrilamida, bis-acrilamida e água duplamente destilada de acordo com a Tabela 1, para obter 10 mL de hidrogel de solução de estoque (faça-o sob a capa de fumaça, monômeros são neurotóxicos). Degas e feche a tampa para um selo hermético.
   NOTA: A solução de estoque pode ser mantida em alíquotas por até 1 ano a 4 °C. Caracterize sempre o módulo young do hidrogel antes de ser usado.
4. Prepare um hidrogel pa de duas camadas (faça-o sob a capa de fumaça, os monômeros são neurotóxicos).
   1. Comece com a camada inferior misturando suavemente 99,3 μL de solução de estoque, 0,5 μL de persulfito de amônio de 1% (APS) e 0,2 μL de tetrametilenenodiamina (TEMED) em um tubo de 1,5 mL. Pegue 10 μL da solução e pipeta-a cair no centro da tampa metacrilatada.
   2. Coloque cuidadosamente uma tampa redonda de 15 mm na goteta e espere 45 min para polimerização. Desprender suavemente a tampa superior com um bisturi.
   3. Para a camada superior, misture suavemente 93,3 μLde solução de estoque com 1 μL de solução HEA oxidada fresca, 5 μL de contas fluorescentes (correspondente a três contas por mícron quadrado para contas de 200 nm de contas de tamanho), 0,5 μL de 1% APS e 0,2 μL de TEMED em um tubo de 1,5 mL. Pegue 5 μL da solução e pipeta-a cair no centro da camada inferior já polimerizada.
   4. Coloque suavemente a mancha de cobertura micropatterada na gota. Aguarde 45 min no RT para que a gota polimerize. Certifique-se de que o lado padronizado toque na gota. Desprender suavemente a tampa com um bisturi.
5. Cole as tampas de 24 mm na parte inferior das placas de 6 poços perfuradas sob medida usando cola de silicone de dois componentes. Depois de 5 min, adicione PBS aos poços.
6. Caracterize o módulo young das amostras de hidrogel de poliacrilamida por microscopia de força atômica (AFM).
   1. Monte uma cantilever de ponta esférica no suporte AFM.
   2. Calibrar cada cantilever adquirindo uma curva de distância de força (setpoint de 3-4 V) em um substrato duro (por exemplo, vidro ou mica), extrapolar a sensibilidade cantilever, retrair-se da superfície e executar uma melodia térmica para obter sua constante de mola.
   3. Coloque as cantilevers calibradas sobre a amostra de hidrogel e adquira curvas de força no buffer PBS, utilizando os seguintes parâmetros: setpoint de força de 20-30 nN, 5 ou 10 μm/s de aproximação e velocidade de retração, tamanho da rampa de 5 μm.
      NOTA: Um microscópio óptico invertido, equipado com um objetivo de ar 40x e um filtro de proteína fluorescente verde (GFP) foi usado para visualizar e atingir áreas micropatteradas ECM dentro das amostras de hidrogel pa.
   4. Plote as curvas de força adquirida versus distância com o software de análise AFM.
   5. Encontre o ponto de contato e converta as curvas de força versus distância em força versus curvas de recuo.
   6. Encaixe a parte de recuo da curva com o modelo Hertz (ou um modelo de mecânica adequado em função da geometria da ponta), utilizando uma razão Poisson entre 0,2 e 0,5.

4. Liberação local de forças de tração celular por iluminação laser UV-A (LUVI-TFM)

NOTA: O laser UV-A é aplicado para liberar forças de tração em células localizadas em regiões definidas dos hidrogéis. O laser UV-A (ou seja, λ = 375 nm laser de estado sólido, <15 mW) é um laser classe 3B. O raio laser não-liolegado é perigoso para os olhos e muitas vezes para a pele. Luz refletida e dispersa e radiação podem ser perigosas. Além disso, a radiação UV pode causar câncer de pele. Trabalhar com dispositivos só é permitido após a introdução de segurança dos oficiais de segurança a laser.

1. Aspire o PBS dos poços.
2. Sementes 3 x ¹⁰⁶ células por placa de 6 poços em meio de crescimento. Para fibroblastos, utilize o Médio Águia Modificada (DMEM) de alta glicose Dulbecco contendo L-glutamina e suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina. Incubar as células durante a noite a 37 °C/5% de _CO2. Lave amostras para remover células flutuantes antes de iniciar a microscopia.
3. Ligue a câmara de incubação do microscópio e o fornecimento de gás para obter uma temperatura de 37 °C e 5% de atmosfera de _CO2 .
4. Ligue o microscópio e o módulo de padronização a laser. Se necessário, reccalibe o laser UV-A no objetivo de ar de 20x usando o software Leonardo. Coloque a placa de 6 poços feita sob medida com as amostras no palco. Ajuste o foco na superfície do PA.
5. Configure o padrão de iluminação e marque as células de interesse. Refoce-se na superfície do hidrogel. Adquira a imagem das células no canal brightfield. Mude para o canal Cy5 (filtro vermelho distante, excitação de 650 nm, emissão de 670 nm) e tire uma imagem de contas no estado deformado.
6. Mude para o canal laser. Ligue o laser por 3 minutos. Em nossa configuração particular, isso correspondeu a uma dose leve de 6.000 mJ/^mm2.
7. Mude para o canal Cy5 e adquira uma imagem das contas no estado não deformado.
   NOTA: Para o experimento usando fibroblastos embrionários do camundongo, aguarde 15 minutos após a exposição para registrar a imagem referencial/não deformada (Consulte a seção Resultados Representativos ). Pode ser diferente para outros tipos de células. Repita os passos 4.5-4.7 novamente para outra célula(s) de interesse.
8. Para medir o estresse oxidativo elevado após a iluminação UV-A, use o reagente comercialmente disponível (CellRox). CellRox não é fluorescente no estado reduzido e, quando oxidado por espécies reativas de oxigênio, fluoresce com uma emissão máxima de ~665 nm.
9. De acordo com o protocolo fornecido, adicione 5 reagentes μM na mídia de imagem e incubar por 30 min a 37 °C/5% de _CO2. Em seguida, lave as células 3x com PBS quente de 1x e substitua a mídia de imagem. Registo o sinal Cy5 por imagens de fluorescência antes e depois da iluminação UV-A usando uma exposição semelhante à luz.

5. Processamento de imagem, velocimetria de imagem de partículas e cálculo de forças de tração

NOTA: As forças de tração celular são registradas pela análise do deslocamento de contas fluorescentes e calculadas utilizando ferramentas de análise de imagem baseadas na velocimetria de imagem de partículas.

1. Abra imagens fluorescentes, antes (ou seja, deformadas) e após o laser (ou seja, não deformadas) usando Fiji. Mescle duas imagens como uma pilha (imagem | Pilhas | Imagens para Stack).
2. Corrige a deriva lateral entre as duas imagens usando plugin StackReg (P. Thévenaz, Instituto Federal Suíço de Tecnologia lausanne). Alterar imagens para 8 bits (| de imagem Tipo | 8 bits) e redimensione para 1024 x 1024 pix (imagem | Escala). Salve como uma sequência de imagem (formato TIFF) com a imagem de referência sempre no início.
3. Adquira o campo vetorial de deslocamento utilizando uma técnica de correlação ^cruzada19 do campo PIV, conforme implementado no projeto OpenPIV.
   1. Certifique-se de que a imagem descontraída (não deformada) e a imagem deformada estejam cobertas com janelas de pesquisa de tamanho _wR e _wD em pixels. Para cada janela de pesquisa, defina uma função de correlação cruzada usando a seguinte fórmula:
      
      Aqui, R(i,j) e D(i,j) descrevem os campos de intensidade das duas imagens truncadas à janela de pesquisa selecionada e, posteriormente, espelham acolchoadas. e descrever seu valor médio. Os tamanhos das janelas são escolhidos para ser _wR = 32 e _wD = 32 e uma sobreposição de 70% é usada entre as janelas de pesquisa vizinhas.
   2. Para cada janela de pesquisa, determine um vetor de deslocamento que otimize a função de correlação cruzada e atribua à posição central da janela de pesquisa. A precisão do subpixel é obtida usando um ajuste gaussiano ao redor da região maxima como ^descrito20.
   3. Encontre e remova vetores de deslocamento ambíguos. Vetores de deslocamento correspondentes às janelas de pesquisa onde a razão entre duas máximas locais mais altas da função de correlação cruzada abaixo de um limiar de 1,5 são considerados ambíguos21.
   4. Descarte vetores de deslocamento que falham no teste mediano normalizado para um limiar residual de ^1.522.
   5. (Opcional) Corrija a deriva lateral restante subtraindo um vetor fixo de todos os deslocamentos. Isso é feito porque o deslocamento em uma área selecionada longe da célula desaparece.
   6. Interpolar o campo vetorial de deslocamento resultante para uma grade regular com espaçamento de 4 px das imagens de entrada usando uma interpolação polinomial cúbica. Os pontos de dados perdidos são preenchidos usando uma extrapolação suave de spline bivariado. Um vetor de deslocamento em pixels está relacionado a uma deformação local pela proporção de pixels da imagem (0,33 μm/px para lente de ar de 20x).
   7. (Opcional) Espelhar a imagem para reduzir os artefatos de toque na análise subsequente.
   8. Multiplique o campo de deformação por uma função de janela Tukey para eliminar o efeito de borda devido à correção de deriva, com um parâmetro de 0,2-0.3. Neste experimento, a área micropatterada que está no centro do FOV é de interesse.
4. Reconstrua a tração utilizando cytometria de tração de quatro e transformação regularizada (FTTC)¹⁸. Como regularização usamos a escolha mais simples e razoável, ou seja, a regularização tikhonov (L2) de ^0ª ordem 23,24,25. Um parâmetro de regularização ideal λ é escolhido de tal forma que minimize a função validação cruzada generalizada (GCV) definida por ²⁶:
   
   Aqui está um vetor empilhado contendo os componentes x e y do campo de tração reconstruído para o valor dado de λ para todos os modos de amostragem fourier e G é o operador linear mapeando campos de tração para seu campo de deslocamento correspondente, conforme definido para FTTC. A soma está passando por componentes vetoriais. _ui são os componentes x e y do campo de deslocamento para todos os modos de amostragem fourier. O GCV é amplamente utilizado no campo de problemas inversos mal colocados e é uma boa alternativa ao critério de curva L frequentemente utilizado no TFM. Um filtro Lanzcos é usado para reduzir os artefatos introduções devido ao espaço de frequência limitada e ao aumento da amostra de campo de deslocamento. O cálculo de tração depende do módulo young do PA (por exemplo, 11,3 kPa) e da razão de Poisson (por exemplo, para PA na faixa entre 0,2 e 0,5, dependendo da concentração de crosslinker).

Resultados

Os hidrogéis pa foram polimerizados em tampas de vidro metacrilatado, que apresentam grupos reativos para a ligação covalente do PA. Dessa forma, ao colocar os hidrogéis em uma solução aquosa, foi impedido seu descolamento do substrato (Figura 1A-D). Para obter uma alta densidade de marcadores fiduciários perto da superfície do hidrogel, desenvolvemos a preparação de um hidrogel pa de duas camadas. A camada inferior, sem contas fluorescentes, foi polimerizada na tampa metacrilatada. Posteriormente, outra camada contendo contas foi polimerizada em cima da camada inferior (Figura 1E-H), substituindo a necessidade de sedimentação, que é frequentemente usada para alcançar a distribuição de contas em um único plano focal e aumentar a densidade das contas. Para obter controle sobre a forma celular durante as medições de TFM, produzimos hidrogéis pa micropatterd através da transferência direta de microestruturas com padrão de fibronectina de um deslizamento de tampa de vidro para o PA pré-polimerizado (Figura 1F-F'). A adição de 1% de crosslinker não convencional (HEA oxidado) na solução de camada de hidrogel superior fornece grupos de aldeído que se ligam covalentemente a grupos de amina de fibronectina.

Preparamos hidrogéis pa, que têm aproximadamente 60 μm de espessura e contas fluorescentes confinadas na camada superior próxima à superfície do hidrogel. Este tipo de hidrogel é um substrato adequado para tração celular de imagem com microscópios invertidos e espesso o suficiente (espessura mínima para executar TFM foi relatado ser de 20-30 μm)¹⁸ para evitar qualquer impacto do substrato de vidro. A localização das contas fluorescentes foi imagem por microscopia confocal (Figura 1I). Para visualizar a transferência de proteínas no hidrogel, utilizamos proteínas ECM fluorescentes rotuladas e as visualizamos por microscopia de epifluorescência (Figura 1J). Preparamos círculos micropatterdados de fibronectina com um diâmetro de 100 μm (lado esquerdo) e 50 μm (lado direito) para permitir a adesão de grupos de células ou células únicas, como mostrado na sobreposição de imagens de campo brilhante de células aderentes, e contas fiduciárias fluorescentemente rotuladas e micropatterns fibronectinas. Em outra amostra, a resposta de adesão de células únicas à fibronectina micropagadora foi validada por microscopia de imunofluorescência indireta para imagem da localização de proteínas de adesão focal, como a paxillin (Figura 1K).

Tanto o revestimento de proteínas ECM quanto a rigidez do hidrogel são parâmetros cruciais para a adesão ^celular26. Para caracterizar as propriedades mecânicas de nossos hidrogéis pa, realizamos experimentos de nanoindentação por ^AFM27, juntamente com um microscópio de epifluorescência. Substratos de hidrogel de três rigidezs diferentes foram preparados e testados com a nossa configuração (Figura 2 e Tabela 1). Os cantilevers AFM em forma de esfera foram cíclicamente abordados e retraídos de hidrogéis pa não requebrados e fibrinogênio conjugados para áreas micropatteradas Alexa488, enquanto registravam curvas de distância de força. Posteriormente, a avaliação do ponto de contato e a aplicação do modelo Hertz nos permitiram estimar o módulo de Young (E) de cada amostra. A micropatterning ECM não alterou o módulo do Young, que permaneceu comparável a cada um dos hidrogéis pa não escaltterttered.

Para medir as forças de tração exercidas por células aderentes no substrato, desenvolvemos uma configuração experimental para TFM baseado em referência realizada em um microscópio de epifluorescência widefield equipado com módulo laser UV próximo (UV-A 6000 mJ/^mm2) para liberar trações celulares (Figura 3A). Como a iluminação do raio laser pode ser controlada temporalmente, não só é possível expor seletivamente uma única célula ou um aglomerado celular com uma alta dose de laser, mas também e mais importante, o passo intermediário disruptivo da remoção celular de toda a amostra usando uma enzima digestiva como a trippsina não é mais necessário. Células iluminadoras com uma dose laser tão alta induziram um estresse oxidativo elevado levando à morte celular (Figura 3B). A morte celular rendeu a liberação de trações do substrato, conforme indicado pelo deslocamento das contas (ilustrado na Figura 3A). Combinamos a iluminação UV-A com um módulo de padronização de luz para iluminar seletivamente regiões do tamanho de micron dos hidrogéis pa (Figura 3B-C). Desta forma, é possível liberar as traçãos de aglomerados de células micropatteradas (Figura 3C,F) ou células únicas (Figura 3B). É importante ressaltar que, em nosso tempo, as propriedades mecânicas dos hidrogéis padronizados do ECM não foram significativamente afetadas pela exposição uv (Figura 2C). O aumento do estresse oxidativo é mostrado na Figura 3D,E. As forças de tração foram reconstruídas utilizando-se fttc regularizado com parâmetro de regularização escolhido pela Validação Cruzada Generalizada (Figura 3B,F). A liberação de forças para células únicas ocorreu durante um período de 15 minutos, e o resultado do LUVI-TFM é comparável ao TFM baseado em trippsina (Figura 3G-H).

Figura 1: Esquema de preparação padronizada de fibronectina-substrato para TFM. (A) A solução para a camada inferior é pipetada em uma superfície metacrilatada. (B) Uma mancha de cobertura limpa menor é cuidadosamente colocada na gota. (C) O tempo de gelação é de 45 min. (D) O deslizamento superior é destacado. A camada inferior está pronta. (E) A solução para a camada superior é pipetada no hidrogel. (F) O deslizamento de cobertura padronizado é cuidadosamente colocado na gota. (F') O micropatterning de proteínas adesivas no vidro é produzido por sem máscara perto da litografia UV, e depois transferido de vidro para hidrogel pa. Os grupos livres de amina de proteínas adesivas, por exemplo, fibronectina, ligam-se covalentemente a grupos de aldeído na superfície da AF. (G) O tempo de gelação é de 45 min. (H) O deslizamento superior é destacado. O hidrogel pa padronizado está pronto. (I) Uma representação 3D de um micrografo xyz confocal mostrando uma alta densidade de contas fiduciárias perto da superfície. (J) Um micrografo de fibronectina fluorescente (magenta) na superfície da AF com contas fluorescentes incorporadas (verde), sobrepostas com uma imagem de campo brilhante das células. (K) Imagem indireta de microscopia de imunofluorescência de uma única célula aderindo a um micropattern de fibronectina em forma de círculo (100 μm). Núcleo (azul), paxillin (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Caracterização de propriedades mecânicas amostrais pela AFM. (A) Configuração experimental de nanoindação de nanoindentação AFM. Um cantilever em forma de esfera é usado para sondar micropatterns ECM antes ou depois do tratamento UV, e as regiões não padronizadas de duas camadas de PA (5% Acrilamida, 0,3% Bis-acrilamida) áreas. (B) Força representativa versus curva de recuo para micropattern ECM (preto). Hertz fit (vermelho) é usado para calcular o módulo do Young (E) da amostra. (C) Medições mecânicas para áreas de PA em camadas duplas não padronizadas (sem ECM), micropattern ECM e micropattern ECM após exposição UV-A. Os bares mostram ± S.E.M. (teste Brown-Forsythe e Welch ANOVA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. A iluminação UV-A local TFM (LUVI-TFM) permite medições locais de força de tração dentro de um grande campo de visão. (A) Esquema de iluminação UV-A local TFM. As células são tratadas com uma alta dose de laser UV-A para obter a imagem não deformada (referência). (B) A imagem de campo brilhante de uma única célula antes da iluminação laser UV-A. Meio: A imagem de campo brilhante de uma única célula após a iluminação laser UV-A. Direito: Força de tração de um único MEF aderindo a um hidrogel pa revestido de fibronectina (E = 5,74 kPa) iluminado com um feixe de luz UV de 50 μm de diâmetro (linha vermelha tracejada). (C) Esquerda: Registro de forças de tração de um aglomerado de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) aderindo à fibronectina micropatterada (círculo, 100 μm de diâmetro). O cluster foi iluminado com um feixe de luz UV de 200 μm de diâmetro (linha tracejada vermelha). Direito: Registro de forças de tração de um aglomerado de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) aderindo à fibronectina micropatterada (círculo, 300 μm de diâmetro). O cluster foi iluminado com um feixe de luz UV de 300 μm de diâmetro (linha tracejada vermelha). Barra de escala = 200 μm. (D,E) Um aumento do estresse oxidativo nas células indicada pelo aumento da intensidade do sinal Cy5 após uma alta dose de laser UV-A é detectada por microscopia de fluorescência. O estresse oxidativo leva à morte celular. Barra de escala = 200 μm. (F) Esquerda: O mapa de calor do estresse de um aglomerado de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) aderindo à fibronectina micropatterada (círculo, 100 μm de diâmetro). Direito: O mapa de calor de estresse de um aglomerado de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) aderindo à fibronectina micropatterada (círculo, 300 μm de diâmetro). (G) As células MEF que aderiram a micropatterns de fibronectina de 100 μm liberam lentamente suas trações após a exposição UV-A. A liberação completa é alcançada após 15 minutos (a imagem de referência foi então tirada 15 min após a exposição). (H) Uma comparação com a trippsina convencional baseada em TFM para células MEF aderindo a 300 μm de diâmetro padronizada-fibronectina. O resultado da iluminação UV-A (6.000 mJ/^mm2) seguido de 15 min de espera não é significativamente diferente do tratamento convencional de trippsina (ou seja, 0,05% para 20 min). Os bares mostram s.E.M. ( teste t-t de duas caudas do estudante, ****P < 0,0001, * P < 0,05, ns P ≤0,5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Acrilamida (%)	Biscrilamida (%)	Acrilamida de 40 % solução de estoque (ml)	Bis-acrilamida a partir de 2 % solução de estoque (ml)	Água (ml)	Módulo de Young (kPa)
4	0.1	1	0.5	8.5	5,74 ± 0,53
5	0.15	1.25	0.75	8	9,69 ± 0,68
5	0.3	1.25	1.5	7.25	11,33 ± 1,06

Tabela 1: Misturas de solução de estoque de hidrogel e elasticidade resultante

Todos os dados são depositados no Repositório de Dados de Acesso Aberto da Sociedade Max Planck (Edmond) e podem ser acessados através do seguinte endereço: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Discussão

Neste protocolo, descrevemos a preparação de hidrogéis de PA micropatterned contendo contas fluorescentes, que são usados como marcadores fiduciais para estudos de TFM. Nossa abordagem baseia-se em três passos: 1) preparação de hidrogéis pa de duas camadas; 2) micropatterning de proteínas ECM e sua transferência para a superfície do hidrogel; 3) uso de luz quase UV padronizada para TFM. A configuração experimental para analisar as trações celulares ao substrato requer o uso de materiais elásticos lineares com valores de rigidez conhecidos para calcular as forças relacionadas ao deslocamento das contas ^{fluorescentes26}. Hidrogéis pa são fáceis de preparar, a rigidez pode ser facilmente ajustada, e eles são comumente usados para detecção de rigidez e ^TFM18,28. No entanto, para obter tempos de polimerização reprodutível e polimerização homogênea de todo o hidrogel, deve-se prestar atenção ao armazenamento de condições e tempo para os reagentes, por exemplo, a APS deve ser mantida em um dessecante para evitar perder sua atividade; TEMED deve ser protegido contra luz direta. O uso de HEA oxidado permite a ligação covalente de proteínas matriciais na superfície do hidrogel, o que pode ser vantajoso para alcançar a formação de uma camada proteica completa e estável. A solução hea oxidada deve ser preparada fresca toda vez que os hidrogéis pa são fabricados. O hidrogel PA de duas camadas oferece três principais vantagens: 1) fornece uma maneira alternativa de obter uma distribuição homogênea de contas fiduciais perto da superfície do hidrogel, sem a necessidade de tornar o gel extremamente fino (ou seja, <20 μm). O controle sobre a espessura do hidrogel é crucial para obter medições precisas com tfm. Quando o substrato elástico é muito fino, células aderentes fortes, como os fibroblastos, podem sentir e responder mecanicamente ao substrato de vidro rígido ^{subjacente29,30}. Hidrogéis espessos tornam a aquisição de imagem para a reconstrução da força mais desafiadora. Além disso, muitos microscópios não terão espaço suficiente para acomodá-los, considerando a espessura adicional do substrato de vidro usado para anexar o hidrogel, a menos que lâminas de microscopia ultrafina sejam usadas. 2) No hidrogel pa de duas camadas, a distribuição homogênea de contas fiduciárias próximas à superfície do hidrogel PA é alcançada sem o uso de uma centrífuga, mas sim com uma simples incubação de quantidades precisas de soluções de hidrogel e contas fluorescentes. A alta densidade de contas é de vantagem significativa na realização da análise piv porque aumenta a resolução das forças de tração e a relação sinal-ruído sem a necessidade de microscopia confocal. 3) Confinar contas em uma camada fina próxima à interface de material celular permite a imagem de forças de tração com microscópios de epifluorescência, bem como microscópios confocal. Ao preparar o hidrogel, o usuário deve certificar-se de que ele adere firmemente ao vidro inferior antes de prosseguir com as etapas subsequentes do protocolo. Recomendamos seguir o tempo de incubação indicado para a polimerização das camadas de hidrogel, pois pode ser difícil remover o vidro em cima da superfície sem danificar a superfície do hidrogel.

As técnicas mais conhecidas para medir propriedades elásticas são AFM, nanoindentação, testes de tração e reometria. No entanto, o nanoindentation induz cepas muito altas sobre os materiais que podem afetar a determinação de propriedades elásticas. Testes de tração e reometria, por outro lado, são técnicas de medição macroscópica, enquanto as células interagem em escala microscópica31,32. A AFM permite medições na microescala com cepas reduzidas em condições fisiológicas. A confiabilidade das medições afm que podem ser afetadas negativamente se faltam detalhes experimentais (por exemplo, força de recuo e velocidade) ou dados insuficientes^. Huth et al. descreve um algoritmo para extrair o moduli de Young dos dados da AFM, que enfatiza manter os detalhes de medição ^constantes27. Este algoritmo oferece uma determinação precisa e confiável do moduli de Young e foi usado para nossos experimentos. Além disso, medimos muitas curvas em amostras fabricadas em dias diferentes e obedímos resultados muito semelhantes (variação dos valores médios de ca. 1-2 kPa). Isso mostra que a rigidez de nossos géis pode ser predito de forma confiável.

Neste protocolo, usamos um módulo de fotopatterning para criar regiões micropatteradas em vidro, que são então transferidas para as superfícies do hidrogel. O micropatterning mostrado neste protocolo é baseado na litografia quase-UV baseada em DMD (dispositivo micro-espelho digital) (λ = 375 nm)⁷. Um DMD consiste em um grande número de micromedes em um chip. Um único pixel corresponde a um único micro-espelho. O arquivo de imagem padrão pixelado de um computador é projetado através de DMD e focado na superfície usando uma lente objetiva. Para micropatterning de proteínas, a luz laser focada é usada para cortar pincéis de polímeros repelentes com a ajuda de um fotoinitidor. Posteriormente, as regiões expostas são preenchidas com proteínas ECM. Este método de ablação sem máscara oferece grande flexibilidade na concepção de novos padrões, pois não conta com o uso de uma máscara. Projetar e aplicar um padrão é muito fácil, pois leva apenas vários minutos usando um freeware como o Inkscape. No entanto, o número de padrões e amostras produzidos em um curto espaço de tempo é uma grande desvantagem, pois este método só pode ser usado para padronizar um único substrato cada vez. O módulo de fotopatterning usa uma fonte de laser de estado sólido UV que emite vários miliwatts. O raio laser não-liolegado é perigoso para os olhos e a pele. Luz refletida e dispersada e radiação também podem ser perigosas. O manuseio deve ser acompanhado por uma instrução de segurança dos oficiais laser. O passo mais crítico no protocolo ao usar um módulo de fotopatterning é garantir que durante a micropattering e a ablação o laser esteja devidamente focado na superfície. Uma dose de iluminação consistente (intensidade multiplicada pelo tempo) de luz UV durante a padronização depende de como o laser é focado na superfície. Uma intensidade fraca na superfície devido ao mau foco pode resultar na falha da transferência de ECM para a superfície do hidrogel, resultando em nenhuma célula presa ao hidrogel.

Nos experimentos TFM, após a imagem inicial das células aderentes e dos marcadores fiduciários, as células são liberadas do hidrogel pa por tratamento de trypsina para registrar seu estado relaxado. Uma desvantagem na realização desta etapa é o manuseio da amostra no estágio de microscopia. Sem uma câmara de perfusão, abrir a tampa do prato, aspirar a solução de tripla média, enxaguante e pipetting representam um desafio para iniciantes e usuários experientes. Na verdade, esses procedimentos são uma das principais fontes de deriva nos eixos xiz , resultando em perda de posição e foco. Nosso protocolo de iluminação local-UV torna a TFM uma técnica mais acessível para iniciantes. Deve-se notar que usamos um módulo de fotopatterning sem máscara à base de microscopia comercialmente disponível, mas, em princípio, qualquer sistema de iluminação UV-A poderia ser usado, eventualmente em combinação com uma máscara para proteger regiões dos substratos, onde as forças de tração celular não devem ser registradas. Expor células com uma dose significativa de luz visível de baixo comprimento de onda (por exemplo, a luz violeta que excita a emissão de DAPI) levará ao aumento do estresse oxidativo, o que pode resultar em fototoxicidade e morte celular. Portanto, essa técnica pode ser aplicada mesmo em um microscópio de epifluorescência sem um módulo laser UV. No entanto, como a intensidade é muito mais fraca, será muito mais fácil realizar tfm com o tratamento enzimático neste caso.

Com o LUVI-TFM é possível usar a mesma amostra para várias medidas devido ao descolamento local de células únicas ou pequenos grupos de células. No entanto, deve-se prestar atenção à seleção de células para se desprender, para evitar o registro de forças de células vizinhas. Assim, para medições de células únicas na ausência de micropatters, regiões lotadas devem ser evitadas; para medições em células micropatteradas únicas, os padrões devem ser projetados de tal forma que a distância entre estruturas únicas tenha pelo menos o dobro do diâmetro da área padronizada. Também recomendamos não usar células de padrões adjacentes em sequência, mas sim amostral-las de regiões distantes no substrato. Nossa medição é bem conduzida em um microscópio de epifluorescência equipado com um recurso de controle de foco e uma lente NA 40 x air = 0,9, onde a distância de trabalho da lente é suficientemente longa e o movimento rápido de um poço para outro é altamente incapaz. O destacamento direcionado de células para aplicações TFM é eficaz para medir a força celular de uma única célula ou de um aglomerado de células pequenas inteiras (por exemplo, até 300 μm de diâmetro). Usando nossa configuração, observamos arredondamento e descolamento de células para tratamento UV de células únicas (Figura 3A), enquanto o descolamento raramente ocorreu para pequenos aglomerados celulares. Isso pode levar a uma subestimação das forças de tração celular. Para aglomerados celulares maiores, recomenda-se o descolamento enzimático, uma vez que os usuários devem usar um objetivo de ar de 20x para visualizar todo o cluster e um recurso de controle de foco é necessário. Como a profundidade de foco da lente de ar 20x é muito maior, o manuseio não será tão crítico quanto o objetivo de ampliação mais alto. O usuário deve garantir que o foco esteja corretamente definido para a ablação das células, uma vez que a dose de iluminação depende do foco do laser na superfície. Embora estejamos cientes das possíveis limitações no uso do LUVI-TFM em coletivos celulares devido a possíveis interações mecânicas com células não tratadas vizinhas, esse aspecto pode realmente vir a ser útil para estudos sobre a mecânica da extrusão celular alvo, por exemplo, a partir de monocamadas epiteliais.

Em conclusão, com nossa abordagem TFM combinada com a liberação induzida pela luz de células micropatteradas, fornecemos um protocolo robusto e de alto rendimento para medir as forças de adesão celular. A versatilidade deste método poderia ser ainda mais explorada usando microscopia e configuração de imagem visando melhorar a resolução e a sensibilidade.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	#440159	Sigma Aldrich
Acetic acid	#33209	Honeywell
Acrylamide 40 %	#1610140	Bio-Rad	CAUTION : toxic, work under a fume hood
AFM cantilever	#CP-CONT-BSG-A-G	NanoAndMore	5 μm spherical tip
AFM system	#NanoWizard3	JPK	Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter
Ammonium persulfate	#A3678	Sigma
Bis-acrylamide 2 %	#1610142	Bio-Rad	CAUTION : toxic, work under a fume hood
Camera sCMOS	#C11440-42U30	Hamamatsu
Camera sCMOS	#ANDORZYLA4.2	Oxford Instrument
CellRox	#C10422	Thermo Fisher
Custom incubator chamber		EMBLEM
Dental glue	#1300 100	Picodent
DMEM	#41965	Thermo Fisher
Epifluorescence microscope	#Eclipse Ti2E	Nikon
Epifluorescence microscope	#Axiovert200	Zeiss
Ethanol	#9065.3	Carl Roth
FBS South America	#S181T	Thermo Fisher
Fibrinogen	#F13191	Invitrogen	Alexa488 conjugate
Fibronectin	#F1141	Sigma
Fluorescent beads 200 nm	#F8805	Invitrogen	Carboxylated (365/415)
Fluorescent beads 200 nm	#F8848	Invitrogen	Carboxylated (505/515)
Fluorescent beads 200 nm	#F8810	Invitrogen	Carboxylated (580/605)
Fluorescent beads 200 nm	#F8807	Invitrogen	Carboxylated (660/680)
Glass coverslip 15 mm round	#41001115	Assistent
Glass coverslip 24 mm round	#41001124	Assistent
Microscope Objective	#MRH08230	Nikon	20x air NA 0.45
Mouse Embryonic Fibroblasts	#CRL-2991	ATCC
mPEG-SVA	#MPEG-SVA-5000	Laysan Bio
N-Hydroxyethyl acrylamide	#697931	Aldrich
Plasma cleaner	#100-E	TePla
PLPP gel	#PLPPgel	Alveole
Poly-L-lysine	#P4823	Sigma Aldrich
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)	#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)	SuSoS
Sodium(meta) periodate	#S1878	Sigma Aldrich
TEMED	#17919	Thermo Scientific
UV Patterning module	#PRIMO	Alveole
UVO cleaner	#342-220	Jelight