Geração de um xenoenxerto ortotópico de células cancerígenas pancreáticas por injeção guiada por ultrassom

Resumo

Apresentamos um protocolo para gerar um modelo de câncer de pâncreas ortotópico minimamente invasivo por injeção guiada por ultrassom de células cancerígenas pancreáticas humanas e o subsequente monitoramento do crescimento tumoral in vivo por ultrassonografia.

Resumo

O câncer de pâncreas (PCa) representa um dos tipos de câncer mais mortais em todo o mundo. As razões para a malignidade da PCa dependem principalmente de seu comportamento maligno intrínseco e alta resistência a tratamentos terapêuticos. De fato, apesar de muitos esforços, tanto a quimioterapia padrão quanto as terapias-alvo inovadoras falharam substancialmente quando movidas da avaliação pré-clínica para o ambiente clínico. Nesse cenário, o desenvolvimento de modelos pré-clínicos de camundongos que imitassem melhor as características in vivo da PCa é urgentemente necessário para testar medicamentos recém-desenvolvidos. O presente protocolo descreve um método para gerar um modelo de PCa em camundongo, representado por um xenoenxerto ortotópico obtido por injeção guiada por ultrassom de células tumorais pancreáticas humanas. Usando um protocolo tão confiável e minimamente invasivo, também fornecemos evidências de enxerto in vivo e desenvolvimento de massas tumorais, que podem ser monitoradas por ultrassonografia (US). Um aspecto digno de nota do modelo de PCa aqui descrito é o lento desenvolvimento das massas tumorais ao longo do tempo, o que permite a identificação precisa do ponto de partida para tratamentos farmacológicos e um melhor monitoramento dos efeitos das intervenções terapêuticas. Além disso, a técnica aqui descrita é um exemplo de implementação dos princípios 3R, uma vez que minimiza a dor e o sofrimento e melhora diretamente o bem-estar dos animais em pesquisa.

Introdução

A PCa, e sua forma mais comum, o adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), é uma das causas mais comuns de morte relacionada ao câncer, com uma taxa de sobrevida de 1 ano inferior a 20% e uma taxa de sobrevida de 5 anos de 8%, independentemente do estágio ^1,2. A doença é quase sempre fatal, e sua incidência está prevista para crescer continuamente nos próximos anos, ao contrário de outros tipos de câncer, cuja incidência está em declínio³. Fatores como a detecção tardia do câncer, a tendência de rápida progressão e a falta de terapias específicas levam a um mau prognóstico da PCa⁴. Grandes avanços na pesquisa do câncer foram obtidos, graças ao desenvolvimento de modelos pré-clínicos mais precisos de camundongos. Os modelos forneceram insights apropriados para a compreensão do mecanismo molecular subjacente ao câncer e para o desenvolvimento de novos tratamentos⁵. Esses avanços se aplicam pouco à PCa, que, apesar dos grandes esforços recentes, permanece resistente às atuais terapias quimioterápicas¹. Por estas razões, o desenvolvimento de novas abordagens para melhorar as perspectivas dos doentes é obrigatório.

Ao longo dos anos, muitos modelos de camundongos PCa foram desenvolvidos, incluindo xenoenxertos, que são os modelos mais utilizados atualmente⁵. Os modelos de xenoenxerto são classificados em heterotópicos subcutâneos e ortotópicos, dependendo da localização das células tumorais implantadas. Os xenoenxertos heterotópicos subcutâneos são mais fáceis e baratos de serem realizados, mas perdem certas características da PCa (ou seja, o microambiente tumoral peculiar, caracterizado pelo acúmulo de tecido fibrótico, hipóxia, acidez e angiogênese)^6,7. Isso explica por que os xenoenxertos subcutâneos muitas vezes não fornecem dados robustos para tratamentos terapêuticos que levam a falhas quando traduzidos para o ambiente clínico⁸. Por outro lado, os xenoenxertos ortotópicos se assemelham mais ao microambiente tumoral, levando a uma melhor imitação do desenvolvimento natural da doença. Além disso, os xenoenxertos ortotópicos são mais adequados para estudar o processo metastático e as características invasivas da PCa, que quase não ocorrem em modelos subcutâneos⁹. De modo geral, os modelos ortotópicos de camundongos xenoenxertos são hoje preferidos para a realização de testes pré-clínicos de drogas ^9,10. Os xenoenxertos ortotópicos geralmente dependem de procedimentos cirúrgicos para implantar células ou pedaços de tecido tumoral muito pequenos no pâncreas. De fato, vários trabalhos baseados em modelos cirúrgicos de PCa têm sido publicados nas últimas décadas¹¹. No entanto, a qualidade e o resultado do procedimento cirúrgico para o estabelecimento de um modelo de tumor ortotópico dependem fortemente da habilidade técnica do operador. Outro ponto-chave para um xenoenxerto ortotópico de PCa bem-sucedido para uma abordagem clínica translacional é a possibilidade de estabelecer doença localizada com cinética de crescimento previsível.

Para resolver essas questões, aqui descrevemos um procedimento inovador para produzir um xenoenxerto ortotópico de PCa, explorando a injeção guiada por ultrassom (US) de células PCa humanas na cauda do pâncreas em camundongos imunodeficientes. Este procedimento gera um modelo de mouse PCa confiável. O crescimento do tumor é seguido in vivo por imagens de US .

Protocolo

O presente protocolo recebeu aprovação do Ministério da Saúde italiano com o número de autorização 843/2020-PR. A fim de garantir condições assépticas, os animais foram mantidos dentro da sala de barreira do biotério animal de pesquisa (Ce.S.A.L.) da Universidade de Florença. Todos os procedimentos foram realizados no mesmo espaço onde os camundongos foram alojados nas instalações do LIGeMA da Universidade de Florença (Itália).

1. Preparação da célula

1. Cultivar células PCa da linhagem celular PCa em uma placa de Petri de 100 mm contendo o Meio Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 2% de L-glutamina e 10% de Soro Fetal Bovino (FBS).
2. Incubar as células em normóxia a 37 °C com 5% de CO₂.
3. Desprenda as células com tripsina. Contar, e ressuspender 1 x 10⁶ células em 20 μL de PBS, 1 h antes da inoculação.

2. Preparação do rato para injeção guiada por ultrassom (US-GI)

NOTA: As etapas a seguir foram realizadas em condições estéreis. Todo o procedimento de injeção guiada por US, desde o início da anestesia até que o rato seja removido da plataforma animal, leva cerca de 10-12 min mais 5 min para a recuperação completa do rato.

1. Imediatamente antes da intervenção, administrar carprofeno (AINE) por via subcutânea (s.c.) numa dose final de 5 mg/kg ou tramadol numa dose final de 5 mg/kg utilizando uma seringa tuberculína com uma agulha de 27 G.
   NOTA: Para o presente protocolo, foram utilizadas 20 fêmeas de fêmea Athymic Nude-Foxn^1nu . Os ratos tinham 8 semanas de idade e pesavam 20-22 g.
2. Ligue o gerador de imagens e selecione Mouse (Small) Abdominal no menu de aplicação no painel do transdutor. Certifique-se de que a janela de imagem do Modo B (Modo de Brilho) seja exibida e que o sistema esteja pronto para adquirir dados do Modo B.
   NOTA: O modo B é o modo de imagem padrão do sistema. O sistema exibe ecos em uma visão bidimensional (2D), atribuindo um nível de brilho com base na amplitude do sinal de eco. O modo B é o modo mais eficaz para localizar estruturas anatômicas.
   1. Vá para o Navegador de Estudo.
   2. Selecione Novo Estudo e digite o nome e as informações do estudo, ou seja, a data do estudo, etc.
   3. Preencha todas as informações necessárias no Nome da Série, ou seja, estirpe animal, ID, data de nascimento, etc.
   4. Toque em Concluído; o programa está pronto para imagens de modo B.
3. Anestesiar o camundongo na câmara de indução anestésica utilizando isoflurano a 4% com fluxo gasoso de 2 L/min de O₂.
   NOTA: Aproximadamente 4 min são suficientes para a anestesia adequada (respirando em torno de 50-60 respirações por minuto).
4. Uma vez que o mouse esteja anestesiado, altere a conexão da máquina anestésica para direcionar o isoflurano em direção à mesa de manuseio do mouse.
5. Colocar o rato anestesiado no flanco direito sobre a mesa de manuseamento (aquecida a 37 °C) com o focinho num cone nasal para garantir que o rato é anestesiado com isoflurano a 2% com um fluxo de gás de 0,8 L/min de O₂ (Figura 1A).
6. Aplique uma gota de lágrimas artificiais nos olhos do rato para evitar a secura durante a anestesia.
7. Cole a mão direita, o pé direito e a cauda firmemente nas almofadas do eletrodo na plataforma animal com gaze adesiva.
   NOTA: A taxa de respiração do rato e o eletrocardiograma (ECG) são registados através das almofadas dos eléctrodos.

3. Injeção de células PANC1 no pâncreas pelo método US-GI

1. Higienize a pele do rato com etanol a 70% e mantenha a pele do flanco esquerdo esticada usando gaze adesiva.
   NOTA: Manter a pele esticada é importante para reduzir a resistência à inserção da agulha e prevenir deformações da agulha.
2. Aplique gel de ultrassom no abdômen e no flanco esquerdo do camundongo usando uma seringa de 20 mL (sem a agulha).
3. Usando o botão de controle de altura do transdutor US, abaixe o transdutor para tocar o flanco esquerdo do mouse e coloque-o transversalmente ao corpo do animal.
4. Mova o transdutor para visualizar o pâncreas na tela do transdutor usando imagens em modo B (Figura 1B).
5. Preparar uma seringa Hamilton de 50 μL, contendo 1 x 10⁶ células PANC1 suspensas em 20 μL de PBS, com uma agulha 28 G de 30 mm e colocar a seringa no suporte adequado (Figura 1C).
   NOTA: Antes de usar, higienize a agulha da seringa com etanol a 70% por um período de 5-10 minutos.
6. Utilizando o micromanipulador do suporte, abaixe a seringa até a pele do rato, com o bisel da agulha virado para cima e no mesmo plano do transdutor de ultrassom, formando um ângulo de 45° com o transdutor (Figura 1D).
   NOTA: A partir desta etapa, prossiga monitorando a imagem dos EUA na tela.
7. Usando o micromanipulador, perfurar a pele e inserir a agulha da seringa no pâncreas e observar a imagem de US no visor, para acompanhar sua trajetória (Figura 1E).
   NOTA: Antes da injeção, tome a cauda do pâncreas como uma referência que está localizada atrás do baço e perto do rim esquerdo.
8. Uma vez que a agulha é inserida no pâncreas, injete um bolo de 20 μL contendo as células diretamente no pâncreas, aplicando pressão constante no êmbolo da seringa (Figura 1F).
   NOTA: O procedimento de injeção correto é verificado pela presença de uma pequena bolha no pâncreas e pelo fluxo de líquido hipoecogênico, que é pouco visível da ponta da agulha.
9. Deixe a agulha no lugar por 5-10 s após a injeção de todo o bolo e, em seguida, retire-a lentamente.
10. Remova o transdutor de US, limpe o gel do flanco e coloque o rato sozinho numa nova gaiola. Observe o animal até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.

4.3D US para monitoramento de tumores pancreáticos em camundongos

NOTA: A avaliação do desenvolvimento tumoral foi realizada a partir de 8 dias após a injeção celular, utilizando-se o mesmo instrumento utilizado para a injeção guiada por US ( listado na Tabela de Materiais). Assim, alguns procedimentos, como a ignição do sistema (etapa 2.2.), a anestesia (etapas 2.3. - 2.6.) e a colocação do rato na plataforma animal (etapa 2.7.), correspondem plenamente ao que foi descrito acima no protocolo.

1. Antes de iniciar a geração de imagens dos EUA, configure a estação de trabalho como mostra a Figura 2A.
2. Fixe o transdutor no sistema motor 3D (Figura 2A).
3. Ative o gerador de imagens e selecione Novo Estudo no Navegador de Estudo.
4. Coloque o rato na câmara de indução da anestesia (isoflurano a 4%).
5. Colocar o rato anestesiado no flanco direito sobre a mesa de manuseamento aquecida a 37 °C com o focinho no tubo anestésico e reduzir o isoflurano para 2% (Figura 2B).
   NOTA: É importante que o rato seja colocado na mesma posição que a injeção guiada por US, para manter as mesmas referências anatómicas.
6. Aplique uma gota de pomada veterinária nos olhos do rato.
7. Aplique uma camada de gel de ultrassom no abdômen e no flanco esquerdo do rato.
8. Posicione o transdutor de 55 MHz na orientação transversal para tocar a pele do flanco esquerdo de modo que o pâncreas esteja aproximadamente centrado (Figura 2C).
9. Use o motor 3D para adquirir imagens de todo o pâncreas na orientação transversal, idealmente reunindo 90-100 quadros por aquisição (o número de quadros pode variar dependendo da escolha pessoal).
   1. Selecione a Posição do motor 3D no touchpad do gerador de imagens.
   2. Indique a distância de varredura movendo o cursor para adquirir imagens de todo o pâncreas de ambas as extremidades.
   3. Selecione Digitalizar quadros e inicie a aquisição 3D.
10. Uma vez que a imagem 3D é feita, remova o transdutor, limpe o gel da pele e coloque o mouse sozinho em uma nova gaiola para recuperação. Observe o animal até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.

Resultados

Seguindo o protocolo descrito acima, os camundongos foram primeiramente anestesiados em uma câmara de isoflurano e colocados na plataforma animal (Figura 1A). O pâncreas foi visualizado por ultrassonografia (Figura 1B). Uma seringa Hamilton de 50 μL foi carregada com 1 x 10⁶ células PANC1 suspensas em 20 μL de PBS e colocada no suporte da agulha (Figura 1C). O ângulo ótimo entre a seringa e o transdutor US foi de 4...

Discussão

Embora o uso de US imaging seja difundido na clínica, o desenvolvimento tumoral em muitos modelos pré-clínicos de camundongos é geralmente descrito usando imagens bioluminescentes¹¹. Este último é uma maneira indireta de avaliar o enxerto e a expansão do tumor e também não fornece uma cinética de crescimento tumoral confiável. No presente estudo, aplicamos a US imaging para a realização de injeção celular, bem como para o monitoramento do desenvolvimento tumoral. O protocolo que des...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157