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Resumo

Apresentamos um método de injeção celular através da tecnologia de jato de água livre de agulhas, juntamente com uma sequência de investigações pós-entrega em termos de viabilidade celular, proliferação e medidas de elasticidade.

Resumo

A incontinência urinária (UI) é uma condição altamente prevalente caracterizada pela deficiência do músculo esfíncter uretral. Os ramos da medicina regenerativa, particularmente a terapia celular, são novas abordagens para melhorar e restaurar a função de esfíncter uretral. Embora a injeção de células funcionais ativas seja realizada rotineiramente em ambientes clínicos por agulha e seringa, essas abordagens têm desvantagens e limitações significativas. Neste contexto, a tecnologia de jato d'água livre de agulhas (WJ) é um método viável e inovador que pode injetar células viáveis por cistoscopia guiada visual no esfíncter uretrais. No presente estudo, utilizamos o WJ para fornecer células estromais derivadas do tecido adiposo porcina (pADSCs) em tecido uretral cadavérico e, posteriormente, investigamos o efeito da entrega de WJ no rendimento e viabilidade celular. Também avaliamos as características biomecânicas (ou seja, elasticidade) por medições de microscopia de força atômica (AFM). Mostramos que o WJ entregou pADSCs foram significativamente reduzidos em sua elasticidade celular. A viabilidade foi significativamente menor em relação aos controles, mas ainda está acima de 80%.

Introdução

A incontinência urinária (UI) é uma doença generalizada com prevalência de 1,8 - 30,5% nas populações europeias1 e caracteriza-se principalmente pelo mau funcionamento do esfíncter uretral. Do ponto de vista clínico, o tratamento cirúrgico é frequentemente oferecido aos pacientes quando terapias conservadoras ou fisioterapia não conseguem abordar e aliviar os sintomas emergentes.

A terapia celular para o potencial reparo regenerativo do mau funcionamento do complexo esfíncter vem surgindo como uma abordagem vanguardista para o tratamento da patologia da interfacedo usuário 2,3. Seus principais objetivos são substituir, reparar e restaurar a funcionalidade biológica do tecido danificado. Em modelos animais para interface do usuário, o transplante de células-tronco tem mostrado resultados promissores em desfechos uroddinâmicos 2,4,5. As células-tronco surgem como candidatos celulares ideais, pois têm a capacidade de se submeter à autoconexão e diferenciação multipotente, auxiliando assim a regeneração tecidual afetada6. Apesar do próximo potencial regenerativo, o uso prático da terapia celular permanece dificultado, pois o parto minimamente invasivo das células ainda enfrenta vários desafios em relação à precisão da injeção e à cobertura do alvo. Embora a abordagem atual usada para o parto celular seja a injeção através de um sistema de seringaagulha 7, geralmente resulta em um déficit geral de células viáveis, com viabilidades relatadas tão baixas quanto 1%- 31% pós-transplante8. Além disso, a entrega de células por injeção de agulha também tem sido demonstrada para afetar a colocação, a taxa de retenção, bem como a distribuição de células transplantadas no tecido alvo 9,10,11. Uma abordagem viável e nova que supera a limitação acima mencionada é a entrega de células livres de agulhas através da tecnologia de jatos d'água.

A tecnologia waterjet (WJ) está emergindo como uma nova abordagem que permite a entrega de alta throughput de células por cistoscópio sob controle visual no esfíncter uretral12,13. O WJ permite a entrega de células em diferentes pressões (E = efeitos na barra) que variam de E5 a E8013. Na primeira fase, a solução isotônica (fase de penetração tecidual) é aplicada com alta pressão (ou seja, E60 ou E80) a fim de afrouxar a matriz extracelular em torno do tecido direcionado e abrir pequenas micro-lacunas interligadas. Na segunda fase (fase de injeção), a pressão é reduzida dentro de milissegundos (ou seja, até E10) a fim de entregar suavemente as células no tecido alvo. Após esta aplicação em fase de duas etapas, as células não são submetidas a pressão adicional contra o tecido quando ejetadas, mas estão flutuando em um fluxo de baixa pressão em uma área cavernosa cheia de líquido13. Em uma configuração modelo ex vivo onde as células-tronco foram injetadas via WJ em tecido uretra cadavérico, as células viáveis poderiam ser posteriormente aspiradas e recuperadas do tecido e expandidas in vitro13. Embora um estudo de 2020 da Weber et al. tenha demonstrado a viabilidade e aplicabilidade do WJ para fornecer cardiomiócitos sem pegada no miocárdio14, é preciso ter em mente que a tecnologia WJ ainda está em fase de protótipo.

O protocolo a seguir descreve como preparar e rotular células estromais derivadas de tecido suíno (pADSC) e como entregá-las em tecido fluido de captura e cadavérico através da tecnologia WJ e agulhas de cistoscopia williams (WN). A injeção pós-celular, a vitalidade celular e a elasticidade via microscopia de força atômica (AFM) são avaliadas. Por meio de instruções passo a passo, o protocolo oferece uma abordagem clara e concisa para adquirir dados confiáveis. A seção de discussão apresenta e descreve as principais vantagens, limitações e perspectivas futuras da técnica. A entrega de células wj, bem como as análises de pós-tradução sequela relatadas aqui estão substituindo a injeção padrão da agulha e fornecem uma estrutura de entrega de células sólidas para cicatrização regenerativa do tecido alvo. Em nossos estudos recentes, fornecemos evidências de que o WJ forneceu células com mais precisão e pelo menos viabilidade comparável quando comparadas às injeções de agulha15,16.

Protocolo

As amostras de tecido adiposo porcina foram obtidas do Instituto de Cirurgia Experimental da Universidade de Tuebingen. Todos os procedimentos foram aprovados pelas autoridades locais de bem-estar animal sob o número de experimento animal CU1/16.

1. Isolamento de células estromais derivadas do tecido adiposo suíno

  1. Use tecido adiposo porcino entregue do Instituto de Cirurgia Experimental em um tubo de centrífuga de 50 mL para o laboratório.
  2. Transfira o tecido para uma placa de Petri estéril sob o banco estéril e pique-o com dois bisturis (Nº 10) para pequenos fragmentos e mingau.
    NOTA: A tesoura também pode ser usada para obter pequenos fragmentos. Quanto menores forem os fragmentos, melhor para a digestão seguinte.
    1. Transfira os pequenos fragmentos/mush em um tubo centrífuga de 50 mL e incuba-o com 5 mL de solução homogeneizadora por 30 min a 37 °C em um shaker. A solução homogeneizadora é a PBS com 1% de gândice de soro bovino (BSA) (solução de estoque: 1 % (w/v) BSA na PBS) e 0,1% colagenase tipo I.
      NOTA: Prepare sempre a solução de homogeneizador de forma recente. O agitador tem um movimento de agitação circular a uma velocidade lenta de 25-500 rpm.
  3. Para parar a incubação, adicionar 10 mL de mídia de crescimento [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - baixa glicose (DMEM-LG), 2,5% solução de sal de sódio HEPES (1 M), 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% L-Glutamina (200 mM), 1% Penicilina-Estreptomicina (1000 U/mL Penicillina; Streptomicina 10.000 μg/mL) e 1% Anfotericina B (250 μg/mL)].
    NOTA: A mídia de crescimento pode ser preparada com antecedência. Antibióticos e antifúngicos são necessários na preparação da mídia de crescimento para a cultura celular para proteger as células de contaminações.
  4. Incubar os tubos de centrífuga por 10 minutos à temperatura ambiente.
  5. Aspire a fração com adipócitos, que é mais leve e, portanto, nadando em cima do líquido, com uma pipeta de 10 mL e descarte-a.
  6. Filtre a fração estromal restante através de uma peneira celular de 100 μm com uma membrana de tereftalato de polietileno (PET) livre de metais pesados para reter fragmentos de tecido adiposo e recuperar apenas a suspensão celular.
  7. Centrifugar a suspensão celular filtrada por 7 min a 630 x g em temperatura ambiente.
  8. Resuspense a pelota celular em 2 mL de PBS para lavar as células uma vez.
  9. Centrifugar novamente a suspensão celular por 7 min a 630 x g em temperatura ambiente.
  10. Após centrifugação e ressuspensão repetida da pelota celular em 10 mL de mídia de crescimento por frasco, células de sementes em frascos de cultura celular de 75 cm2 .
    NOTA: Dependendo do tamanho da pelota celular após a etapa de lavagem com PBS, células de sementes em um a quatro frascos.

2. Cultivo celular de células estéticas derivadas do tecido suíno

  1. Células de colheita e passagem quando atingem 70% de confluência.
  2. Lave as células com 10 mL de PBS duas vezes e aspire a PBS completamente.
    NOTA: Esta etapa é necessária para remover a mídia de crescimento restante, que é complementada por 10% de FBS. FBS possui vários inibidores de protease que podem dificultar a função da tentainização a seguir.
  3. Adicione 3 mL de 0,05%-Trypsin-EDTA por frasco para desprender as células.
  4. Incubar frascos por 3 min a 37 °C.
  5. Verifique sob o microscópio se as células estão separadas.
    NOTA: Às vezes leva mais tempo para desprender as células. Neste caso, incubar frascos para máxima de 5 min a 37 °C.
  6. Para parar o processo de incubação e desapego, adicione 3 mL de mídia de crescimento.
    NOTA: Como observado acima, a mídia de crescimento é complementada por 10% de FBS que contém inibidores de protease.
  7. Transfira as células separadas para um tubo de centrifugação e centrífuga por 7 min a 630 x g em temperatura ambiente.
  8. Resuspenda as células em 10 mL de mídia de crescimento e contá-las com um hemótmetro.
  9. Células de sementes com densidade de inoculação de 3 x 105 células por frasco de 75 cm2 .

3. Rotulagem de células com calcein-AM

NOTA: As células que são injetadas em tecidos cadavéricos estão manchadas com uma mancha de célula viva permeável de membrana verde-fluorescente e um indicador de viabilidade de membrana-impermeável de membrana vermelha-fluorescente para verificar se as células extraídas são as mesmas das células injetadas e não fragmentos teciduais da uretra.

  1. Lave as células duas vezes com 10 mL de PBS.
  2. Adicione 5 mL de solução de corante por frasco de 75 cm2 . A solução de corante consiste em mídia de crescimento com 2 μM do corante de células vivas verde-fluorescente permeável e 4 μM de viabilidade de membrana-impermeável.
  3. Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
  4. Aspire e descarte a solução de corante.
  5. Lave as células novamente duas vezes com 10 mL de PBS.
  6. Adicione mídia de crescimento e documente o sinal de fluorescência verde e vermelha por microscopia de fluorescência.
    1. Coloque o frasco de 75 cm2 na tabela do microscópio, use o objetivo de 10x, selecione nenhum filtro de fluorescência e certifique-se de que o caminho da luz transmitida esteja ativo.
      NOTA: Estas etapas são todas executadas manualmente no microscópio.
    2. Paralelamente à etapa 3.6.1, abra o programa de software.
    3. Pressione o botão Viver sob a guia Localizar para obter uma imagem ao vivo das células no frasco sobre a mesa e concentre-se neles com os drives de ajuste grosseiro e fino.
      NOTA: À vista certa, a imagem ao vivo aparecerá assim que o botão Live for ativado.
    4. Nos componentes do microscópio de subse, selecione o objetivo correto (10x).
    5. Na câmera de sub-guia, aplique uma marca de verificação para Exposição Automática.
    6. Pressione o botão Pressione o botão Pressione a primeira foto com a luz transmitida.
    7. Insira a barra de escala usando a guia Gráficos na barra de menu e selecionando a Barra de Escala.
    8. Salve a imagem usando a guia Arquivos na barra de menu e selecionando Salvar como czi.
    9. Para as imagens de fluorescência, altere o filtro para aquele específico para fluorescência verde ou vermelha e selecione o caminho da luz refletida.
      NOTA: Essas alterações devem ser feitas manualmente no microscópio.
    10. Pressione novamente o botão Viver sob a guia Localizar para obter uma imagem ao vivo das células.
    11. Pressione o botão Clique para tirar a segunda foto com fluorescência verde ou vermelha.
    12. Insira a barra de escala usando a guia Gráficos na barra de menu e selecionando a Barra de Escala.
    13. Salve a imagem usando a guia Arquivos na barra de menu e selecionando Salvar como czi.
    14. Repetir passos 3.6.9 a 3.6.13 com o outro canal de fluorescência.

4. Prepare amostras de tecido uretral para injeções

  1. Dissecar a uretra e a bexiga conectada do porco.
    NOTA: Foram utilizadas amostras de tecido uretral de amostras cadavéricas frescas de suínos adultos de terra fêmeas para os experimentos.
  2. Transporte para o laboratório em sacos em gelo molhado.
    NOTA: As amostras devem ser deixadas no gelo até um processamento mais aprofundado. Nenhum aditivo foi adicionado às amostras.
  3. Coloque a uretra com a bexiga sobre uma esponja, que imita a elasticidade do assoalho pélvico inferior.
    1. Use a bexiga para determinar a orientação (proximal, distal, dorsal e ventral) da uretra. Isso é possível devido à localização dos ureteres e dos três ligamentos que fixam a bexiga na cavidade abdominal e pélvica. Os três ligamentos são os dois ligamentos vesicae lateralia nas laterais da bexiga e o medianum vesicae, que surge da superfície ventral da bexiga (Figura 1).
  4. Abra a uretra longitudinalmente no lado dorsal com auxílio de um cateter.
  5. Injete as células na uretra aberta, conforme descrito nos capítulos seguintes.

5. Injeções de células através de uma agulha Williams em fluidos e amostras de tecido

  1. Células de colheita descritas na etapa 2.
  2. Em contraste com a etapa 2.9, ajuste a densidade celular para injeções para 2,4 x 106 células por mL.
    NOTA: Para injeções em amostras de tecido, rotule as células com uma célula viva permeável de membrana verde-fluorescente.
  3. Aspire a suspensão celular com uma seringa e aplique a agulha de injeção cistoscópica williams (WN) nela.
  4. Segure a agulha logo acima dos 2 mL de mídia de crescimento em um tubo de centrifugação de 15 mL ou insira a agulha no tecido uretra aberto. Em ambos os casos, injete 250 μL de células manualmente.
    NOTA: As células injetadas na uretra cadavêmica formam uma cúpula de injeção.
  5. Coletar células injetadas na mídia diretamente por centrifugação por 7 min a 630 x g em temperatura ambiente.
  6. Para células injetadas na uretra cadavírica, aspire-as para fora da cúpula de injeção com uma agulha 18G aplicada em uma seringa.
  7. Transfira as células injetadas e aspiradas em um tubo de centrifugação e centrífuga por 7 minutos a 630 x g em temperatura ambiente comparativamente com as células injetadas na mídia.
  8. Após a centrifugação, resuspende as células em 4 mL de mídia de crescimento em ambos os casos.
  9. Determine o rendimento celular e a viabilidade por auxílio da exclusão de corante azul Trypan com um hemócito.
    1. Misture 20 μL de suspensão celular completamente com 20 μL de azul Trypan.
    2. Encha 10 μL desta mistura em cada câmara do hemócito.
      NOTA: Ambas as câmaras são preenchidas e contadas para obter otimização estatística dobrando a amostragem.
    3. Sob um microscópio, conte células em todos os quatro quadrados de canto.
      NOTA: As células de contagem brilhando em branco (não manchadas) como células viáveis, enquanto as células que brilham azul (manchadas) são contadas como células mortas.
    4. Para calcular o número de celular por mL, calcule a média das duas câmaras, divida esse número por dois e multiplique-o com 104.

6. Injeções de células via jato de água em fluidos e amostras de tecido

  1. Células de colheita descritas na etapa 2.
  2. Em contraste com as etapas 2.9 e 5.2, ajuste a densidade celular para injeções para 6 x 106 células por mL.
    NOTA: Para injeções em amostras de tecido, use células rotuladas com uma célula viva permeável de membrana verde-fluorescente.
  3. Encha a suspensão da célula na unidade de dosagem do dispositivo WJ.
  4. Segure o bocal de injeção logo acima dos 2 mL de mídia de crescimento em um tubo de centrifugação de 15 mL ou logo acima do tecido de uretra aberto.
  5. Em ambos os casos, injete 100 μL de células pelo dispositivo usando uma alta pressão para penetração tecidual seguida de uma fase de baixa pressão para injeções celulares. Use as configurações de pressão E60-10.
    NOTA: As células injetadas na uretra cadavêmica formam uma cúpula de injeção.
  6. Coletar células injetadas na mídia diretamente por centrifugação por 7 min a 630 x g em temperatura ambiente.
  7. Para células injetadas na uretra cadavírica, aspire-as para fora da cúpula de injeção com uma agulha 18G aplicada em uma seringa.
  8. Transfira as células injetadas e aspiradas em um tubo de centrifugação e centrífuga por 7 minutos a 630 x g em temperatura ambiente comparativamente com as células injetadas na mídia.
  9. Após a centrifugação, resuspend as células em 4 mL de mídia de crescimento em ambos os casos.
  10. Determine o rendimento e a viabilidade celular por auxílio da exclusão de corante azul Trypan com um hemócito, conforme descrito em detalhes em 5.10.

7. Avaliação biomecânica da elasticidade celular por microscopia de força atômica (AFM)

  1. Preparação de amostras
    NOTA: As células recuperadas após a injeção estão agora sujeitas a novas análises pela AFM. Além disso, as células que não foram injetadas são usadas como controles.
    1. Células de sementes em pratos de cultura tecidual com uma densidade de 5 x 105 células por prato.
      NOTA: Semente um prato de cultura de tecido por condição. As condições são controles, ADSCs injetados por WJ ou WN em mídia e ADSCs injetados por WJ ou WN em tecido cadavérico.
    2. Incubar células em pratos de cultura tecidual por 3 h a 37 °C.
      NOTA: Para evitar variâncias devido às células na fase G1 e durante a mitose, realizamos medições afm 3 h após a etapa de semeadura celular.
    3. Logo antes da medição com o AFM substituir a mídia de crescimento por 3 mL da mídia L-15 de Leibovitz sem L-glutamina.
    4. Coloque a placa de cultura tecidual no suporte de amostra do dispositivo AFM e ligue o aquecedor de placa de Petri a 37 °C.
  2. Preparação da AFM e calibração cantilever
    1. Use um bloco de vidro especificado para medições em líquidos e ajuste-o no suporte AFM.
      NOTA: A superfície superior do bloco de vidro deve ser reta e paralela ao suporte AFM.
    2. Coloque cuidadosamente o cantilever na superfície do bloco de vidro. A ponta A deve estar sobre o plano óptico polido.
      NOTA: Não arranhe a superfície óptica polida do bloco de vidro porque arranhões podem levar a interferências nas medições. A ponta A deve se projetar sobre o plano óptico polido porque, caso contrário, o reflexo do laser do AFM para o fotodetetor não é possível.
    3. Para estabilizar a cantilever no bloco de vidro, adicione uma mola metálica com o auxílio de pinças.
    4. Quando o cantilever estiver fixado no bloco de vidro coloque o bloco na cabeça AFM e bloqueie o mecanismo de bloqueio integrado.
    5. Monte a cabeça AFM no dispositivo AFM.
      NOTA: A mola deve enfrentar o lado esquerdo para ser colocada corretamente. Se este não for o caso, corrija a posição do bloco de vidro e ajuste novamente a cabeça AFM.
    6. Inicialize a configuração do software e abra o software juntamente com a janela de alinhamento a laser e as configurações do parâmetro de aproximação. Além disso, ligue o motor do estepe, a luz laser e a câmera CCD.
    7. Identifique a ponta cantilever A usando a câmera CCD.
    8. Abaixe o cantilever até que esteja totalmente mergulhado no meio. Use a função do motor do estepe para atingir este objetivo.
    9. Uma vez que o cantilever esteja totalmente coberto por meio, o laser é alinhado em cima do cantilever usando os parafusos de ajuste. O feixe refletido deve cair no centro do fotodetetor e a soma dos sinais deve ser de 1 V ou mais. As deflexões laterais e verticais devem ser próximas de 0.
      NOTA: Se o centro for atingido pode ser monitorado na função de alinhamento do laser, bem como nos valores do sinal. Se os valores do sinal não estiverem corretos, novos ajustes ão necessários.
    10. Execute agora o scanner Abordagem com os parâmetros de aproximação (Tabela 1).
    11. Retraia o cantilever por 100 μm quando chegar à parte inferior pressionando o botão Retrair .
      NOTA: Certifique-se de que nenhuma célula está anexada nesse campo se a abordagem for feita porque isso falsificaria a calibração.
    12. Configure os parâmetros de Execução de acordo com as seguintes especificações: Setpoint 1 V, Pull Length 90 μm, Velocity: 5 μm/s, Taxa de amostra: 2000 Hz e como modo de atraso: Força Constante.
    13. Inicie a curva de velocidade de calibração medindo pressionando o botão Executar.
      NOTA: Clicando no botão Executar no software, uma curva de distância de força é obtida.
    14. Selecione a região de ajuste linear da curva retraída no software na curva de distância de força de calibração obtida. Calcule a medição constante da mola pelo software.
    15. Calibrar a cantilever seguindo os parâmetros e passos exatos descritos por Danalache et al.17.
  3. Medindo a elasticidade das células individuais
    1. Identifique visualmente uma célula e foque nela. Coloque o mouse do computador no meio da célula. Para melhorar a precisão das medições, posicione a ponta AFM diretamente acima do núcleo celular.
      NOTA: O mouse do computador é usado como marcador visual para identificar o local alvo do recuo.
    2. Agora concentre-se no cantilever e mova-o no mouse do computador.
    3. Inicie a medição com run com os parâmetros apresentados na Tabela 2.
      NOTA: O parâmetro de ponto de configuração obtido pela calibração do cantilever é utilizado. Além disso, uma célula é medida três vezes. Meça pelo menos 50 células.
  4. Processamento de dados
    1. Processe os dados seguindo as etapas exatas e parâmetros descritos anteriormente por Danalache17.
    2. Salve e exporte o arquivo.

8. Análise estatística

  1. Abra o software estatístico.
  2. Escolha a seleção do Novo Conjunto de Dados.
    NOTA: Dois arquivos são abertos. Um é o "DataSet" e o outro é o arquivo "Saída".
  3. Selecione o arquivo DataSet e abra a guia Exibição variável .
  4. Insira as variáveis numéricas para injeção no local (fluido de captura ou tecido cadavérico), categoria (controle, injeção de WJ, injeção de WN) e elasticidade.
  5. Insira os dados de elasticidade medidos com a injeção do local correspondente e o número da categoria na guia Data View .
  6. Analise os dados selecionando a guia barra de menu Analisar | Estatísticas descritivas e escolha análise de dados exploratórios.
  7. Como variável dependente, selecione Elasticidade e lista de fatores selecionar Categoria.
    NOTA: Os resultados são exibidos no arquivo "Saída", incluindo um plot de caixa que é usado para a seção resultados.
  8. Para realizar um teste estatístico, selecione as Amostras Independentes dentro do Teste Não Paramétrico na guia barra de menu Analisar.
  9. No novo arquivo aberto mantenha as configurações na guia Objetivo e Configurações.
  10. Abra a guia Campos e escolha Elasticidade como Campos de Teste e Categoria como Grupos.
  11. Pressione Run.
    NOTA: Os resultados são exibidos no arquivo "Saída". Para estas análises é realizado um teste Mann-U-Whitney.
  12. Inclua o resultado do teste não paramétrico no gráfico da caixa da análise de dados exploratórios.
  13. Salve os arquivos selecionando Arquivo na barra de menu e escolhendo Salvar.

Resultados

Após a entrega de células através das duas abordagens, a viabilidade das células entregues através da WN (97,2 ± 2%, n=10, p<0,002) foi maior quando comparada às injeções por WJ utilizando as configurações E60-10 (85,9 ± 0,16%, n=12) (Figura 2). Os resultados da avaliação biomecânica mostraram que: as injeções de WN de células em fluido de captura não apresentaram diferença significativa em relação ao moduli elástico (EM; 0,992 kPa) quando comparado com os controles (1...

Discussão

No presente estudo, demonstramos e apresentamos uma abordagem passo a passo para o procedimento de entrega de células WJ e empregamos uma sequência de investigações quantitativas para avaliar o efeito da entrega de WJ em características celulares: viabilidade celular e características biomecânicas (ou seja, EM). Após a injeção de WJ, 85,9% das células colhidas eram viáveis. Em termos de injeção de WN, 97,2% das células mantiveram sua viabilidade após a injeção. Assim, a abordagem do WJ preenche um requi...

Divulgações

Os autores J.K., M.D., T.A., A.S., W.K.A. não têm nada a revelar. Os autores W.L. e M.D.E. são funcionários da ERBE Medizintechnik Tenente Tübingen, produtora do ERBEJet2 e do protótipo WJ empregado neste estudo.

Agradecimentos

Agradecemos aos nossos coautores das publicações originais pela ajuda e apoio.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL centrifuge tubeGreiner BioOne227261
1 mL BD Luer-LokTM SyringeBD Plastik Incn.a.
100 µm cell sieveGreiner BioOne542000
15 mL centrifuge tubeGreiner BioOne188271
75 cm2 tissue culture flaskCorning Incorporated353136
AFM head(CellHesion 200) JPKJPK00518
AFM processing softwareBrukerJPK00518
AFM softwareBrukerJPK00518
AFM system Cell Hesion 200BrukerJPK00518
All-In-One-Al cantileverBudget SensorsAIO-10tip A, Conatct Mode, Shape: Beam
Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m)
Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz)
Length: 500 µm (490 - 510 µm)
Width: 30 µm (35 - 45 µm)
Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm)
Amphotericin B solutionSigmaA2942250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, GermanyJPK00518
BD Microlance 3 18GBD304622
bovine serum albuminGibcoA10008-01
Cantilever All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, BulgariaAIO-TL-10tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometerNanoEnTek631-1098
centrifuge: Rotina 420RHettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powderGibco17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucoseSigmaD5546
Feather disposable scalpel (No. 10)Feather02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)SigmaF7524
HEPES sodium salt solution (1 M)SigmaH3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, GermanyL201306_03
laboratory bagsBrand759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamineMerckF1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)F1315
L-glutamineLonzaBE 17-605C1200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity KitInvitrogen by Thermo Fisher ScientificL3224Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6Zeiss
Microscope: AxioVertA.1Zeiss
Nelaton-Catheter femaleBicakcilar19512051
Penicillin-StreptomycinGibco15140-12210000 U/ml Penicillin
10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFMBrukerT-05-0117
Petri dish heater associated with AFMJPK Instruments AG, Berlin, GermanyT-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22IBM
Sterile Petri dish - CellStarGreiner BioOne664160
Tissue culture dishesTPP AGTPP93040
Tissue culture dishesTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SwitzerlandTPP93040
Trypan Blue 0.4%
0.85% NaCl		Lonza17-942E
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
Waterjet: ERBEJET2 deviceErbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection NeedleCook MedicalG1422023G, 5.0 Fr, 35 cm

Referências

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