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Resumo

Este protocolo tem como objetivo isolar mRNAs ribossomais de tradução específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP.

Resumo

A heterogeneidade celular coloca desafios para a compreensão da função de tecidos complexos em um nível de transcriptoma. O uso de RNAs específicos do tipo celular evita possíveis armadilhas causadas pela heterogeneidade dos tecidos e desencadeia a poderosa análise do transcriptoma. O protocolo descrito aqui demonstra como usar o método Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) para isolar RNAs ligados a ribossomos de uma pequena quantidade de células que expressam EGFP em um tecido complexo sem classificação celular. Este protocolo é adequado para isolar RNAs específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP recentemente disponível e também pode ser usado para isolar RNAs de quaisquer células que expressem EGFP.

Introdução

Abordagens de alto rendimento, incluindo sequenciamento de RNA (RNA-seq) e microarray, tornaram possível interrogar perfis de expressão gênica no nível de todo o genoma. Para tecidos complexos, como coração, cérebro e testículos, os dados específicos do tipo celular fornecerão mais detalhes comparando o uso de RNAs de todo o tecido 1,2,3. Para superar o impacto da heterogeneidade celular, o método Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) vem sendo desenvolvido desde o início da década de 20104. O TRAP é capaz de isolar RNAs ligados a ribossomos de tipos celulares específicos sem dissociação tecidual. Este método tem sido utilizado para análise de translatomos (mRNAs que estão sendo recrutados para o ribossomo para tradução) em diferentes organismos, incluindo a segmentação de uma população extremamente rara de células musculares em embriões de Drosophila5, o estudo de diferentes células radiculares na planta modelo Arabidopsis thaliana6 e a realização de análise de transcriptoma de células endoteliais em mamíferos7.

O TRAP requer uma modificação genética para marcar o ribossomo de um organismo modelo. Evan Rosen e seus colegas desenvolveram recentemente um modelo de rato chamado Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP)mouse 8, que está disponível no Jackson Laboratory desde 2017. Ao cruzar com uma linha de camundongo Cre, os pesquisadores podem usar este modelo de camundongo NuTRAP para isolar RNAs ligados a ribossomos e núcleos celulares de células que expressam Cre sem classificação celular. Em células que expressam Cre que também carregam o alelo NuTRAP , o ribossomo marcado com EGFP/L10a permite o isolamento de mRNAs de tradução usando ensaios pulldown de afinidade. Na mesma célula, a membrana nuclear marcada com peptídeo de reconhecimento de ligase de biotina (BLRP), que também é mCherry positivo, permite o isolamento nuclear usando purificação baseada em afinidade ou fluorescência. A mesma equipe de pesquisa também gerou uma linha de camundongo semelhante na qual a membrana nuclear é marcada apenas com mCherry sem biotina8. Essas duas linhagens de camundongos geneticamente modificados dão acesso para caracterizar perfis epigenômicos e transcriptômicos emparelhados de tipos específicos de células em interesse.

A via de sinalização do ouriço (Hh) desempenha um papel crítico no desenvolvimento tecidual9. GLI1, um membro da família GLI, atua como um ativador transcricional e medeia a sinalização Hh. As células Gli1+ podem ser encontradas em muitos órgãos secretores de hormônios, incluindo a glândula adrenal e o testículo. Para isolar DNAs e RNAs específicos do tipo celular de células Gli1+ usando o modelo de camundongo NuTRAP, camundongos Gli1-CreERT2 foram cruzados com os camundongos NuTRAP. Camundongos Shh-CreERT2 também foram cruzados com os camundongos NuTRAP com o objetivo de isolar células expressivas de ouriço sônico (Shh). O protocolo a seguir mostra como usar o Gli1-CreERT2; Camundongos NuTRAP para isolar RNAs ligados a ribossomos de células Gli1+ em testículos de camundongos adultos.

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Protocolo

Todos os experimentos em animais realizados seguiram os protocolos aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Auburn.

NOTA: O protocolo a seguir usa um testículo (cerca de 100 mg) em P28 de Gli1-CreERT2; Camundongos NuTRAP (Mus musculus). Os volumes de reagentes podem precisar ser ajustados com base nos tipos de amostras e no número de tecidos.

1. Coleta de tecidos

  1. Eutanasiar os ratos usando uma câmara de CO2 , higienizar a superfície do abdômen com etanol a 70%.
  2. Abra o abdômen inferior com uma tesoura e remova os testículos. Use nitrogênio líquido (LN2) para congelar os testículos imediatamente.
  3. Armazenar amostras na fase de vapor do LN2 até o uso.

2. Preparação de reagentes e contas

  1. Preparar a solução-mãe de homogeneização: Adicionar 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 e 1 mg/mL de heparina. Conservar a solução a 4 °C até à utilização (até 1 mês).
  2. Preparar o tampão de trabalho de homogeneização da solução-mãe (passo 2.1) imediatamente antes da utilização: Adicionar TDT (concentração final: 1 mM), cicloheximida (concentração final: 100 μg/ml), ribonuclease recombinante (concentração final: 200 unidades/ml) e cocktail inibidor de protease (concentração final: 1x) à solução-mãe de homogeneização para obter a quantidade necessária do tampão de trabalho de homogeneização. Armazenar o tampão de trabalho recém-preparado no gelo até à utilização.
  3. Prepare os tampões de lavagem com baixo teor de sal e alto teor de sal:
    1. Para preparar tampão de lavagem com baixo teor de sal, misture 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl e 1% NP-40. Adicionar TDT (concentração final: 1 mM) e cicloheximida (concentração final: 100 μg/ml) antes de utilizar.
    2. Para preparar tampão de lavagem com alto teor de sal misture 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Adicionar TDT (concentração final: 2 mM) e cicloheximida (concentração final: 100 μg/ml) antes de utilizar.
  4. Prepare as contas de proteína G (Tabela de Materiais):
    1. Cada amostra precisará de 50 μL de esferas de proteína G. Coloque a quantidade necessária de contas em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e separe as contas da solução usando um rack magnético, deixando o tubo no rack por 30-60 s.
    2. Remova o sobrenadante por pipetagem. Lave as contas três vezes com 1 mL de tampão de lavagem gelado com baixo teor de sal de cada vez.

3. Lise tecidual e homogeneização

  1. Adicionar 2 ml de tampão de trabalho de homogeneização gelado (preparado na hora a partir do passo 2.2) a um conjunto de moedores de tecido de vidro. Coloque rapidamente a amostra congelada no moedor e homogeneize o tecido com 30 golpes no gelo usando um pilão solto.
  2. Transferir o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de 2 ml e centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  3. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL. Salve 100 μL em um tubo de 1,5 mL como a "entrada".
  4. Incubar o sobrenadante no tubo de 2 ml com o anticorpo anti-GFP (5 μg/ml; 1:400) a 4 °C num rotador end-over-end (24 rpm) durante a noite.

4. Imunoprecipitação

  1. Transfira a mistura homogeneizada/anticorpo para um novo tubo de fundo redondo de 2 ml contendo as esferas de proteína G lavadas a partir do passo 2.4. Incubar a 4 °C num rotador de ponta a ponta (24 rpm) durante 2 h.
  2. Separe as contas magnéticas do sobrenadante usando um rack magnético. Salve o sobrenadante como a "fração negativa". A fração negativa contém (1) RNAs em células EGFP-negativas e (2) RNAs em células EGFP-positivas que não estão ligadas aos ribossomos.
  3. Adicione 1 mL de tampão de lavagem com alto teor de sal às contas e faça um breve vórtice do tubo para lavar as contas. Coloque o tubo em um rack magnético.
  4. Remova o tampão de lavagem. Repita a etapa de lavagem mais duas vezes. As contas agora contêm o complexo de RNA de contas ribossomo-RNA de células positivas para EGFP.

5. Extração de RNA

NOTA: As etapas a seguir são adaptadas do kit de isolamento de RNA (Tabela de Materiais). Trate cada fração (ou seja, entrada, positiva e negativa) como uma amostra independente e isole os RNAs de forma independente.

  1. Incubar as esferas da etapa 4.4 com 50 μL de tampão de extração (do kit de isolamento de RNA) em um bifrutificador (42 °C, 500 rpm) por 30 min para liberar RNAs de contas.
  2. Separe as contas com um rack magnético, transfira o sobrenadante que contém o complexo contas-ribossomo-RNA para um tubo de 1,5 mL.
  3. Centrifugar o tubo a 3000 x g durante 2 min e, em seguida, pipetar o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Este tubo contém a "fração positiva" da etapa TRAP.
    NOTA: Para a entrada e as frações negativas, extrair RNA de 25 μL de amostras usando 1 mL de tampão de extração. Incubar numa betoneira (42 °C, 500 rpm) durante 30 min.
  4. Pré-condicione a coluna de purificação de ARN: Pipeta 250 μL de tampão de condicionamento para a coluna de purificação. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Centrifugar a coluna a 16.000 x g durante 1 min.
  5. Pipetar volume igual de 70% de EtOH para o sobrenadante a partir do passo 5.3 (em torno de 50 μL de 70% de EtOH para a fração positiva e 1 mL de EtOH de 70% para a entrada e as frações negativas). Misture bem pipetando para cima e para baixo.
  6. Pipetar a mistura para a coluna a partir do passo 5.4.
  7. Centrifugar a coluna a 100 x g durante 2 min para permitir a ligação do ARN à membrana na coluna e, em seguida, continuar a centrifugar a 16.000 x g durante 30 s imediatamente. Descarte o fluxo.
    NOTA: Para a entrada e as fracções negativas, adicionar 250 μL da mistura à coluna de cada vez. Repetir os passos 5.6 e 5.7 até que todas as misturas sejam utilizadas.
  8. Pipetar 100 μL de tampão de lavagem 1 (W1) para a coluna e centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.
  9. Pipeta 75 μL de solução de DNase misturada diretamente na membrana da coluna de purificação. Incubar no RT por 15 min.
  10. Pipetar 40 μL de W1 para a coluna e centrifugar a 8.000 x g durante 30 s. Descarte o fluxo.
  11. Pipetar 100 μL de tampão de lavagem 2 (W2) para a coluna e centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.
  12. Pipetar 100 μL de W2 para a coluna e centrifugar a 16.000 x g durante 2 min. Descarte o fluxo. Recentrífuga da mesma coluna a 16.000 x g durante 1 min para remover todos os vestígios de tampão de lavagem antes da etapa de eluição.
  13. Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  14. Pipetar 12 μL de água isenta de RNase directamente sobre a membrana da coluna de purificação. A ponta da pipeta não deve tocar a membrana. Incubar a RT durante 1 min e centrifugar a 1000 x g durante 1 min. Em seguida, continue a centrifugação a 16.000 x g por 1 min para eluir o RNA.

6. Concentração e qualidade do RNA

  1. Use um bioanalisador para avaliar a qualidade e a quantidade do RNA10 extraído.

7. Armazenamento e análise posterior

  1. Armazene o RNA a -80 °C (até 1 ano) até uma análise mais aprofundada (por exemplo, microarray, PCR quantitativa (qPCR) e RNA-seq, etc.).
    NOTA: Para obter detalhes da análise de qPCR, incluindo a síntese de cDNA, consulte Lyu et al.11. Os primers para qPCR estão listados na Tabela de Materiais.

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Resultados

O rato Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) foi cruzado pela primeira vez com o rato repórter NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) para gerar ratos com dupla mutação. Camundongos portadores de ambos os alelos genéticos geneticamente modificados (ou seja, Gli1-CreERT2 e NuTRAP) foram injetados com tamoxifeno uma vez por dia, a cada dois dias, para três injeções. As amostras de tecido foram coletadas no 7º dia após o1º dia da i...

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Discussão

A utilidade da análise do transcriptoma de todo o tecido pode ser atenuada, especialmente quando se estuda tecidos heterogêneos complexos. Como obter RNAs específicos do tipo celular torna-se uma necessidade urgente para liberar a poderosa técnica de RNA-seq. O isolamento de RNAs específicos do tipo celular geralmente depende da coleta de um tipo específico de células usando micromanipulação, classificação celular ativada por fluorescência (FACS) ou microdissecção por captura a laser (LCM)...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo NIH R00HD082686. Agradecemos à Endocrine Society Summer Research Fellowship a H.S.Z. Também agradecemos ao Dr. Yuan Kang por criar e manter a colônia de ratos.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
ActbeurofinsqPCR primersATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
BioanalyzerAgilent2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMillipore11836170001
cycloheximideMillipore239764-100MG
Cyp11a1eurofinsqPCR primersCTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTPThermo Fisher ScientificR0191
DTT, DithiothreitolThermo Fisher ScientificP2325
DynaMag-2 magnetThermo Fisher Scientific12321D
Falcon tubes 15 mLVWR89039-666
GFP antibodyAbcamab290
Glass grinder setDWK Life Sciences357542
heparinBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
Hsd3beurofinsqPCR primersGACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KClBiosciencesR005
MgCl2BiosciencesR004
Microcentrifuge tubes 2 mLThermo Fisher Scientific02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarraysThermo Fisher ScientificMicroarray service
NP-40Millipore492018-50 Ml
oligo (dT)20Invitrogen18418020
PicoPure RNA Isolation KitThermo Fisher ScientificKIT0204
Protein G DynabeadThermo Fisher Scientific10003D
RNase-free watergrowcellsNUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease InhibitorThermo Fisher Scientific10777019
Sox9eurofinsqPCR primersTGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptaseInvitrogen18090050
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155
Sycp3eurofinsqPCR primersGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
TrisAlfa AesarJ62848

Referências

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