Visualizando e quantificando compostos farmacêuticos dentro da pele usando imagens coerentes de dispersão de Raman

Resumo

Uma metodologia coerente de imagem de dispersão raman para visualizar e quantificar compostos farmacêuticos dentro da pele é descrita. Este artigo descreve a preparação do tecido da pele (humano e camundongo) e a aplicação da formulação tópica, aquisição de imagens para quantificar perfis de concentração esposteis e análises farmacocinéticas preliminares para avaliar a entrega de medicamentos tópicos.

Resumo

Farmacocinética cutânea (cPK) após a aplicação da formulação tópica tem sido uma área de pesquisa de particular interesse para cientistas reguladores e de desenvolvimento de medicamentos para entender mecanicamente a biodisponibilidade tópica (BA). Técnicas semi-invasivas, como descascamento de fitas, microdiálise dérmica ou microperfusão de fluxo aberto dérmico, todas quantificam a macroescala cPK. Embora essas técnicas tenham proporcionado vasto conhecimento de CPK, a comunidade carece de uma compreensão mecanicista da penetração e permeação de ingredientes farmacêuticos ativos (API) no nível celular.

Uma abordagem não invasiva para abordar a microescala cPK é a imagem de dispersão raman coerente (CRI), que tem como alvo seletivamente vibrações moleculares intrínsecas sem a necessidade de rótulos extrínsecos ou modificações químicas. O CRI tem dois métodos principais de dispersão anti-Stokes Raman (CARS) e estimulado a dispersão de Raman (SRS) - que permitem quantificação sensível e seletiva de APIs ou ingredientes inativos. Os CARROS são normalmente utilizados para obter informações estruturais da pele ou visualizar contraste químico. Em contraste, o sinal srs, que é linear com concentração molecular, é usado para quantificar APIs ou ingredientes inativos dentro de estratificações de pele.

Embora o tecido do camundongo tenha sido comumente utilizado para cPK com CRI, BA tópico e bioequivalência (BE) devem, em última análise, ser avaliados em tecido humano antes da aprovação regulatória. Este artigo apresenta uma metodologia de preparação e imagem da pele ex vivo a ser utilizada em estudos cri farmacocinéticos quantitativos na avaliação da BA e DO tópicos. Essa metodologia permite quantificação de API confiável e reprodutível na pele humana e do rato ao longo do tempo. As concentrações dentro de compartimentos ricos em lipídios e lipídios, bem como a concentração total de API ao longo do tempo são quantificadas; estes são utilizados para estimativas de BA micro e macroescala e, potencialmente, BE.

Introdução

Metodologias para avaliar a PP após a aplicação de produtos medicamentos tópicos se expandiram a partir de estudos clássicos de permeação in vitro (IVPT) ^{estudos 1,2,3,4,5} e tape-stripping ^6,7,8 para metodologias adicionais como microperfusão de fluxo aberto ou microdiálise dérmica ^9,10,11, 12,13,14. Existem potencialmente vários locais de ação terapêutica dependendo da doença de interesse. Assim, pode haver um número correspondente de metodologias para avaliar a taxa e até que ponto uma API chega ao local de ação pretendido. Embora cada uma das metodologias acima mencionadas tenha suas vantagens, a maior desvantagem é a falta de informações de microescala cPK (ou seja, a incapacidade de visualizar para onde a API vai e como ela permeia).

Uma metodologia não invasiva de interesse para estimar ba tópico e BE é o CRI, que pode ser dividido em duas modalidades de imagem: CARS e microscopia SRS. Estes métodos coerentes de Raman permitem imagens quimicamente específicas de moléculas através de efeitos raman não lineares. No CRI, dois trens de pulso laser são focados e escaneados dentro de uma amostra; a diferença de energia entre as frequências de laser é definida como alvo de modos vibracionais específicos das estruturas químicas de interesse. Como os processos CRI não são lineares, um sinal só é gerado no foco do microscópio, permitindo imagens tomográficas farmacocinéticas tridimensionais do tecido. No contexto do cPK, o CARS tem sido utilizado para obter informações estruturais teciduais, como a localização de estruturas de pele ricas em^{lipídios 15}. Em contraste, o SRS tem sido utilizado para quantificar a concentração molecular, pois seu sinal é linear com concentração. Para amostras de pele ex vivo , é vantajoso realizar CARROS na epidireção¹⁶ e SRS no modo de transmissão¹⁷. Portanto, amostras de tecido finas permitirão a detecção e quantificação de sinais SRS.

Como um tecido modelo, a orelha do mouse nu apresenta várias vantagens com pequenas desvantagens. Uma vantagem é que o tecido já está ~200-300 μm de espessura e não requer mais preparação da amostra. Além disso, várias estratificação da pele são vistas por focalização por meio de um campo de visão (por exemplo, corneum estrato, glândulas sebáceas (Gs), adipócitos e gordura subcutânea)^16,18. Isso permite uma estimativa pré-clínica preliminar de vias cutâneas de permeação e estimativas tópicas da BA antes de se mudar para amostras de pele humana. No entanto, o modelo de mouse nude apresenta limitações como a dificuldade na extrapolação para cenários in vivo devido a diferenças na estrutura^{da pele 19}. Enquanto a orelha de rato nu é um excelente modelo para obter resultados preliminares, o modelo de pele humana é o padrão-ouro. Embora tenha havido vários comentários sobre a adequação e aplicabilidade da pele humana congelada para recapitular com precisão cinética de permeação in vivo ^20,21,22, o uso de pele humana congelada é um método aceito para a avaliação da cinética de permeação in vitro ^{API 23,24,25} . Este protocolo visualiza várias camadas de pele em camundongos e pele humana, quantificando concentrações de API em estruturas ricas em lipídios e lipídios.

Embora o CRI tenha sido utilizado em vários campos para visualizar especificamente compostos dentro dos tecidos, houve esforços limitados investigando o cPK de produtos medicamentos aplicados topicamente. Para avaliar a BA/BE atual dos produtos tópicos utilizando o CRI, é necessário primeiro ter um protocolo padronizado para fazer comparações precisas. Esforços anteriores usando CRI para entrega de medicamentos na pele demonstraram variabilidade dentro dos dados. Por se trata de uma aplicação relativamente nova do CRI, estabelecer um protocolo é fundamental para obter resultados confiáveis 18,26,27. Esta abordagem visa apenas um número específico de ondas na região biológica silenciosa do espectro Raman. No entanto, a maioria das APIs e ingredientes inativos têm mudanças raman dentro da região de impressão digital. Isso já apresentou desafios devido ao sinal inerente decorrente do tecido na região das impressões digitais. Os recentes avanços a laser e computacional removeram essa barreira, que também pode ser utilizada em combinação com a abordagem apresentada aqui²⁸. Esta abordagem aqui apresentada permite a quantificação de uma API, que tem uma mudança de Raman na região silenciosa (2.000-2.300 ^cm-1). Isso não se limita às propriedades fisioquímicas da droga, o que pode ser o caso de algumas metodologias de monitoramento de cPK mencionadas anteriormente²⁹.

O protocolo deve reduzir a variabilidade amostral na espessura da pele para várias preparações, uma vez que amostras de pele humana grossa produzirão sinal mínimo após a aplicação do produto medicamentoso devido à dispersão de luz pela amostra espessa. O objetivo deste manuscrito é apresentar uma metodologia de preparação tecidual que garanta padrões de imagem reprodutíveis. Além disso, o sistema CRI é configurado como descrito para reduzir possíveis fontes de erro, bem como minimizar o sinal-ruído. No entanto, este artigo não discutirá os princípios norteadores e os méritos técnicos do microscópio CRI, uma vez que este já foi previamente coberto³⁰. Finalmente, o extenso procedimento de análise de dados é explorado para permitir a interpretação dos resultados para determinar o sucesso ou fracasso de um experimento.

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Protocolo

O uso de tecido de orelha de rato nu foi aprovado pelo Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), enquanto o uso de tecido de pele humana foi aprovado pelo Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). De acordo com os protocolos da IACUC, camundongos recém-eutanásiados foram obtidos de colaboradores com colônias de ratos nus. O tecido humano foi adquirido a partir de procedimentos eletivos de abdominoplastia no Hospital Geral de Massachusetts através de um protocolo aprovado. Além disso, tipos específicos de tecidos diferentes da pele abdominal foram adquiridos por meio de uma autoridade de doação corporal, também por meio de um protocolo aprovado pelo IRB.

1. Preparação do tecido

1. Preparação de tecido de pele de orelha de rato nu
   1. Depois de adquirir corpos de camundongos nus recém-colhidos, remova as orelhas usando fórceps e tesouras microcirúrgicas. Coloque uma orelha em uma pequena placa de Petri (ou seja, 35 mm x 10 mm). Coloque o corpo do rato nu em uma bolsa de risco biológico para ser eliminado de acordo com os protocolos locais da IACUC.
   2. Enxágüe cada orelha do rato com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) e bata suavemente com um limpador de tarefas. Repita duas vezes para remover qualquer sujeira residual ou detritos na orelha que possam afetar a qualidade da imagem (ver Figura 1).
   3. Se o ouvido for usado dentro de 24h, coloque-o em uma pequena placa de Petri (ou seja, 35 mm x 10 mm) com PBS fresco em uma geladeira (2-8 °C). Se a orelha for usada após 24h de colheita, coloque-a em uma placa de Petri (35 mm x 10 mm) sem PBS, cubra a placa com parafilm e coloque-a em um congelador de -20 °C.
2. Preparação do tecido da pele humana
   1. Após a aquisição de tecido humano, coloque-o em uma grande placa de Petri (ou seja, 60 mm x 15 mm) em uma capa biológica para permitir espaço suficiente para a preparação da amostra.
   2. Coloque o lado do cândano estrato voltado para baixo de tal forma que a gordura subcutânea seja acessível.
   3. Usando fórceps e tesouras microcirúrgicas, comece a remover cuidadosamente a gordura subcutânea. Uma vez que a gordura subcutânea não pode mais ser removida com a tesoura, mude para um bisturi descartável de 10 lâminas (ou equivalente) para remover a gordura subcutânea restante. Use o bisturi em um ângulo de 45° para a pele enquanto segura a pele parada com fórceps (ver Figura 1).
      NOTA: Para ter imagens srs de transmissão de alta qualidade, as amostras precisam ser o mais finas possível sem serem perfuradas.

Figura 1: Imagens de espessura ideal para imagem de camundongo e pele humana. (A) Pele da orelha do rato sustentada à luz, que pode visivelmente deixar a luz passar. (B) Pele humana ideal mantida à luz após a preparação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Sele a pele humana em pedaços de 1 cm x 1 cm.
   NOTA: A pele fresca pode ser usada por até 24 horas sem o uso de uma cama de gel de agarose, como descrito anteriormente³¹. No entanto, a pele fresca pode ser utilizada por mais tempo se mantida em uma cama de gel agarose. Se a pele for usada mais tarde, a pele é colocada em um saco de transporte de espécimes e, em seguida, colocada em um congelador de -20 °C. A pele congelada precisa ser descongelada usando o procedimento abaixo para obter resultados ótimos (ver passo 3.1.2).

2. Configuração de laser e microscópio

1. Aproximadamente 30 minutos antes da imagem, ligue o laser ultrarrápido amplamente tírico (doravante chamado de laser) e permita que ele aqueça. Habilite o sistema de sinalização/bloqueio a laser para notificar o pessoal fora do risco potencial na entrada.
   NOTA: Os óculos adequados devem ser sempre usados quando se trabalha com lasers classe IV. Para o laser específico usado aqui, o óculos adequado recomendado é OD ≥ 6 para a faixa de trabalho do laser 800-1.300 nm.
2. Enquanto o laser estiver aquecendo, habilite o hardware restante para controle de microscópio, detecção de CARROS e detecção de SRS.
3. Alinhe o microscópio corretamente para garantir a imagem ideal. Na janela Controle de Aquisição de Imagens no software de controle de microscópio (software MC do futuro), clique na lâmpada de transmissão para permitir que a luz venha da lâmpada de transilluminação do microscópio.
4. Certifique-se de corrigir a iluminação de Köhler para alinhar o microscópio ao longo do eixo vertical: feche a íris para baixo para que uma quantidade mínima de luz seja vista através da peça ocular³².
5. Ao olhar através da ocular, abra a íris para ver se o polígono toca todos os lados simultaneamente. Ajuste a altura do condensador se uma forma de polígono não puder ser vista antes de abrir a íris.
6. Se a forma do polígono não tocar em todos os lados ao mesmo tempo, ajuste a posição de alinhamento de abertura usando os botões de ajuste.
   NOTA: Consulte Sanderson et ^al.33 para uma configuração de microscópio aprofundado.
7. Coloque um slide de microscópio com um deslizamento de tampa e espaçador adesivo de dupla lateral contendo uma amostra de óleo (por exemplo, azeite de oliva, como há muitas ligações -CH₂ dentro dos óleos) no suporte do estágio do microscópio.
8. Na janela de configurações de aquisição do Software MC, encontre o menu de dropdown do microscópio e defina o objetivo do microscópio em 20x.
9. Verifique se o filtro de detecção CARS (645 nm/50 nm) está em posição de visualizar e medir o sinal epiCARS ao longo do tubo fotomultiplier da porta lateral do microscópio.
   NOTA: Este filtro específico é selecionado para lipídios de imagem como o sinal anti-Stokes CARS gerado a 652 nm para um comprimento de onda de bomba de 803 nm e um comprimento de onda Stokes de 1.040 nm (ver Eq. (1)).
   (1)
   Onde as variáveis λ têm unidades de nm; A_bomba λ é o comprimento de onda do feixe da bomba; e λ_Stokes é o comprimento de onda do feixe stokes.
10. Olhe através da ocular para encontrar a borda da amostra de óleo, que será usada para verificar o alinhamento do sistema.
11. Certifique-se de que a borda está em foco Z usando os botões de foco no microscópio e ajuste o controlador de palco para obter foco XY.
12. Depois que o laser tiver aquecido, ajuste o feixe da bomba para 803 nm com a sintonia fina do motor definida para 50,0 na interface gráfica do usuário do laser. A sintonia fina exata do motor usada pode diferir da configuração para a configuração.
    NOTA: O feixe da bomba é o único feixe com comprimento de onda ajustável neste laser, pois o comprimento de onda do feixe de Stokes é fixado em 1.040 nm. Esta configuração tem como alvo a vibração CH em 2850 ^cm-1 (ver Eq. (2) para calcular o comprimento de onda da bomba para o alvo do número de ondas).
    (2)
    Onde tem unidades de número de onda relativa (cm⁻¹), e variáveis λ têm unidades em cm.
13. Verifique o alinhamento do laser no microscópio antes da imagem; ver Figura 2 para a representação do caminho laser. Durante a configuração inicial do microscópio, instale duas íris no caminho do feixe como guias para o alinhamento correto no microscópio. Como o caminho óptico do laser pode flutuar ao longo do tempo, certifique-se de que os caminhos do raio laser atravessem o centro das íris para que entrem corretamente no microscópio.
14. Usando o visualizador IR, feche todas as íris completamente e certifique-se de que o feixe está centrado em ambos: primeiro na íris mais próxima do laser e, finalmente, na porta de entrada do microscópio.
15. Primeiro, verifique o feixe da bomba para garantir que o feixe esteja indo direto para o microscópio. Uma vez que a bomba esteja alinhada, verifique se o feixe de Stokes também entra corretamente no microscópio.
    1. Se as vigas não estiverem alinhadas através das íris, caminhe iterativamente as vigas através das íris usando os botões de ajuste x e y das duas montagens espelho para a bomba e os feixes de Stokes.
16. Uma vez que as manchas de feixe estejam sobrepostas antes de entrar no microscópio, verifique se eles estão atravessando o microscópio corretamente.
    1. Na janela controle de aquisição de imagens do software MC, clique no canal TD para transmissão, ALG1 (canal analógico 1) para o canal coerente anti-Stokes Raman e ALG2 (canal analógico 2) para o canal de dispersão Raman estimulado. Use as seguintes configurações (como neste protocolo): ganho de 1 e compensação de -1 para ALG1, ganho de 1,25 e compensação de -2 para ALG2.
       NOTA: Dependendo da configuração do sistema, os canais analógicos podem ter numeração diferente para canais individuais de imagem. Se o detector SRS estiver no local, não haverá sinal de transmissão, pois nenhuma luz pode passar (ou seja, não se pode visualizar imagens com TD e ALG2 simultaneamente nesta configuração).

Figura 2: Layout esquemático para um caminho coerente de imagem a laser raman. Os feixes são condicionadas independentemente para o tamanho do ponto e combinadas através do estágio de atraso de tempo para gerar dispersão raman coerente em amostras para a frequência de sintonia desejada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

17. Ligue o medidor de energia e, usando um sensor de energia térmica de alta potência, meça a potência da bomba e stokes feixes individualmente para o experimento.
    NOTA: Neste exemplo específico, a potência do feixe da bomba era de 80 mW, enquanto a potência do feixe de Stokes era de 180 mW antes da entrada do microscópio.
18. Na janela Controle de Aquisição de Imagens , clique no botão Focus x2 para visualizar a imagem no Software MC.
19. Na janela de configurações de aquisição , certifique-se de que a razão de pixels e o tempo de moradia sejam definidos para os parâmetros desejados para o experimento.
    NOTA: Uma relação de 1.024 x 1.024 pixels e um tempo de moradia de 2 μs/pixel foram utilizados neste protocolo.
20. Confirme o alinhamento do laser em relação ao microscópio desbloqueando o feixe da bomba e olhando para o canal TD .
    NOTA: O laser está alinhado corretamente se o feixe for visto centrado na imagem com as configurações corretas do detector.
21. Caso contrário, use botões de ajuste X e Y no periscópio para reposicionar o feixe para o centro da imagem.
22. Confirme o alinhamento do laser e do microscópio vendo a mesma imagem nos canais CARS e SRS.
23. Para adquirir a imagem de alinhamento, clique no botão de digitalização XY na janela Controle de Aquisição de Imagens com o conjunto de modo de filtro apropriado (por exemplo, Kalman Line 3).
24. Salve este conjunto de imagens com um nome de arquivo descritivo para comparar ao longo do tempo e confirmar o desempenho/alinhamento do sistema.

3. Imagem lipídica

1. Orelha de rato e tecido humano
   1. Se usar tecido fresco, pule a etapa 3.1.2.
   2. Retire a pele da orelha do rato do congelador -20 °C e coloque-a em uma câmara de incubação (32 °C) por 10 minutos. Remova a orelha do rato da câmara de incubação.
      NOTA: Veja o passo 1.1.2. para preparação da pele da orelha do rato. O manuseio áspero ou raspagem do tecido pode resultar em degradação mecânica, destruição ou ruptura do tecido, especialmente o córnea estrato.
   3. Se usar uma orelha de rato nua, coloque a porção anterior da orelha voltada para o fundo de vidro de um prato de 35 mm, nº 0. Se usar a pele humana, coloque-a com o estrato corneum voltado para baixo, pois isso permitirá quantificação de drogas das camadas superficiais para as camadas mais profundas (Figura 1).
      NOTA: A parte posterior da orelha do rato nu é mais propensa a imperfeições da carcaça. Se a pele humana não for colocada com o lado do corneum estrato voltado para baixo no microscópio invertido, não será possível ver além da derme, pois há uma boa quantidade de luz espalhada, e a droga que permeia no estrato corneum não pode ser vista.
   4. Uma vez que o tecido tenha sido centrado no fundo do vidro, use um aplicador de ponta de algodão para garantir que a pele é plana e tenha contato completo com a superfície do deslizamento de tampas do prato de fundo de vidro.
      NOTA: Este é um passo que pode causar dificuldade ao fotografar a pele se ela não estiver completamente plana.
   5. Coloque uma arruela em cima da pele para evitar qualquer movimento durante a imagem. Certifique-se de que o tecido esteja visível através do orifício central da arruela para detecção de transmissão srs.
   6. Remova a inserção do slide e substitua-a pela câmara de incubação, que tem a única inserção da antena.
   7. Coloque o prato de fundo de vidro com o tecido da pele no único acessório de prato da câmara de incubação.
      NOTA: Alternativamente, use uma placa de 6 poços para imagem de várias amostras de pele e formulações ao mesmo tempo.
   8. Diminua a proporção de pixels na janela Configurações de Aquisição do software MC (por exemplo, de 1.024 x 1.024 para 512 x 512) para uma velocidade de varredura de galvo mais rápida enquanto a profundidade Z é alterada para encontrar o corneum estrato (ver Figura 3A para mouse ou Figura 3E para humano).
   9. Após a descoberta do estrato corneum, registre essa posição axial como a posição zero na janela Configurações de Aquisição e altere a razão de pixels para cada experimento específico (por exemplo, 1.024 x 1.024).

Figura 3: Exemplo de profundidades de pele obtidas utilizando SRS. O conjunto superior de imagens são de pele de orelha de rato nu representando o seguinte: (A) estrato corneum, (B) glândulas sebáceas, (C) adipócitos, (D) gordura subcutânea. O conjunto inferior de imagens são obtidos da pele humana representando o seguinte: (E) estrato corneum, (F) derme papilar e (G) uma glândula sebácea. Barras de escala = 100 μm. Tanto as imagens de pele humana quanto o de camundongos foram adquiridas usando um objetivo de 20x em 1024 pixels x 1024 pixels; o SG humano foi tomado em 512 x 512 pixels. Abreviaturas: SRS = dispersão estimulada de Raman; SG = glândula sebácea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Aplicação da formulação tópica

1. Pipeta a dose de formulação predeterminada na pele (por exemplo, 10 μL/cm²).
   NOTA: A viscosidade da formulação desempenhará um papel na escolha da pipeta. Recomenda-se o uso de uma pipeta de deslocamento positiva para formulações viscosas, como cremes ou géis, e uma pipeta de deslocamento de ar para soluções. Neste experimento, o ruxolitinibe foi o composto modelo em uma solução simples de propilenoglicol (propano-1,2-diol).
2. Usando a ponta do êmbolo de uma seringa, ou um dedo enluvado, esfregue a formulação em um movimento no sentido horário para 30 s. Observe o momento em que a formulação é aplicada para análise cPK posterior (ver etapas 6.15-6.17 abaixo).
   NOTA: A duração da aplicação depende do experimento; cada um pode ser diferente.
3. Após o tempo atribuído para a formulação permear, remova o excesso de formulação e coloque a pele com o lado da formulação voltado para o prato de fundo de vidro.
   NOTA: A formulação é removida usando um delicado limpador de tarefas ou um pequeno (~1 polegada) rodo impresso em 3D em uma única direção (por exemplo, de norte a sul).

5. Configuração experimental para quantificação de medicamentos

1. Coloque o feixe da bomba em 803 nm. Verifique os poderes da bomba e do feixe de Stokes com o fotodiodo para garantir que eles sejam os poderes desejados para o experimento. Desbloqueie cada feixe individualmente para medir a potência e bloquear as vigas.
   NOTA: Neste exemplo específico, a potência do feixe da bomba foi de 100 mW, enquanto a potência do feixe de Stokes foi de 180 mW.
2. Coloque o prato de fundo de vidro em uma câmara de incubação com uma inserção para um prato de fundo de vidro. Fixar o prato com clipes para evitar movimento durante a imagem.
3. Ligue a lâmpada de transmissão no Mc Software. Olhando através da ocular, ajuste o foco axial com o botão de ajuste para garantir que o tecido esteja dentro do foco.
4. Desbloqueie as vigas da bomba e do Stokes. Certifique-se de que os canais ALG1 e ALG2 estejam ativados e clique em Focus x2 no software MC para visualizar a pele nos canais CARS e SRS. Certifique-se de que o fotodiodo SRS esteja em posição acima do condensador.
5. No menu suspenso do dispositivo, clique em Multi Area Time Lapse (MATL). Procure um aviso de estágio XY para aparecer; quando o estágio se mover para encontrar sua origem mecânica, clique em OK.
6. No módulo MATL , vá para Exibir e clique em Lista de pontos registrada dentro do software MC. Comece a adicionar 1) profundidades específicas dentro da pele (ou seja, corneum estrato, SGs, adipócitos, gordura subcutânea como determinada durante a imagem ao vivo com contraste lipídudo) ou 2) posições XY se pilhas de profundidade inteiras forem tomadas. Consulte a Figura 3 para exemplos.
   1. Uma vez identificado o câneo estrato, role através do foco axial (ou z-focus) para identificar estratificações específicas de tecido mencionadas acima. Veja a Figura 3 para exemplos dentro da pele humana e do rato.
   2. No caso de profundidades específicas de imagem em oposição a pilhas de profundidade Z completas, para cada estratificação da pele, clique em Registrar Ponto para adicioná-lo à fila MATL. Para obter pilhas de profundidade total, clique em Registrar Ponto para cada posição XY com seleção de profundidade na janela de parâmetros de aquisição .
   3. Uma vez que todas as posições XY (pilhas de profundidade Z completas) ou XYZ (estratificações específicas da pele) tenham sido registradas dentro do software MATL, altere o diretório de arquivos e o nome de forma consistente ao longo dos experimentos para análises de imagem e cPK (ver etapas 6.15- 6.17).
7. Defina o número de repetições para 1 no módulo MATL e clique em Pronto. Aguarde que o Play mude de cinza para uma seta preta, indicando que o software está pronto. Pressione Play para começar a imagem da pilha lipídica preliminar (imagens lipídicas do futuro).
   NOTA: Este será usado para separar regiões ricas em lipídios e lipídios de estratificações de tecidos individuais durante a análise. O ciclo e o tempo total são indicados no canto inferior direito da lista de pontos registrados.
8. Uma vez que o ciclo tenha sido concluído, bloqueie as vigas da bomba e de Stokes. Altere o comprimento de onda na interface do usuário gráfico laser para o comprimento de onda desejado com base no número de ondas ou vibração de Raman.
   NOTA: Por exemplo, 843 nm para o feixe da bomba é usado para atingir 2.250 ^cm-1 usando Eq. (2), e a melodia fina do motor é alterada para 50,1. A droga de exemplo apresentada aqui, ruxolitinibe, contém um nitrito que pode ser direcionado a 2.250 ^cm-1. O número de ondas direcionado para a estrutura da pele será sempre o mesmo (2.850 ^cm-1); no entanto, o número de ondas para uma API pode ser qualquer número de ondas, mas deve ser conhecido ou calculado a priori.
9. Ajuste o estágio de atraso de tempo manual (Figura 2) para garantir a sobreposição a tempo do novo comprimento de onda e da potência do feixe da bomba. Certifique-se de que os mesmos poderes são usados tanto para imagens lipídicas quanto de API, que são estabelecidas a priori.
10. Use a duração por ciclo para calcular o número total de repetições necessárias por experimento. Basta dividir o tempo total desejado do experimento pelo da duração do ciclo.
    NOTA: A duração do ciclo é uma função do tamanho da imagem, do tempo de permanência dos pixels, da média de Kalman e do número de imagens por ciclo. A otimização desses parâmetros reduzirá o tempo de ciclo, aumentando assim a resolução temporal.
11. Uma vez escolhida a repetição total do ciclo, desbloqueie o feixe da bomba, verifique a energia usando o fotodiodo e certifique-se de que ele corresponde ao da potência desejada. Finalmente, desbloqueie o feixe de Stokes para permitir imagens.
12. Pressione Play para iniciar a imagem automatizada dos set-points.
13. Depois que a imagem MATL tiver sido concluída, mude o feixe da bomba de volta para 803 nm e ajuste a energia de volta à potência original de imagem lipídica usada na etapa 5.1.
14. Como nas etapas anteriores, altere o nome do arquivo para ser consistente para postar imagens de experimento ao longo do estudo.
15. Defina o número de repetições para 1.
16. Clique em pronto | Reproduza botão para adquirir uma pilha lipídica pós-curso e certifique-se de que não houve movimento tecidual durante a imagem (Figura 4).

Figura 4: Movimento tecidual na pele do ouvido do rato nu demonstrado pela visualização de glândulas ambíceas. Exemplo de movimento limitado do tecido é retratado em A e B, enquanto movimento substancial de tecido é retratado em C e D. (A) mostra as glândulas sebáceas no momento da aplicação da formulação e (B) a mesma profundidade em 120 min após a aplicação. (C) Glândulas sebáceas de rato no momento da aplicação da formulação e (D) 120 min após a aplicação da formulação; as glândulas sebáceas são pouco visíveis, o que é uma indicação de que este experimento não estava medindo a absorção nas glândulas sebáceas durante toda a duração experimental. Barras de escala = 100 μm. As imagens são de 1024 pixels x 1024 pixels. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Análise de dados

1. Adquira imagens como . OIB (ou . OIR dependendo dos tipos de arquivos microscópio e mc) com cada posição XYZ tendo uma subpasta separada.
2. Compile imagens lipídicas com imagens de canais de API renomeando imagens lipídicas com o seguinte final _lipid.oib.
3. Realize as etapas a seguir com cada estratificação de pele (demonstrada aqui usando apenas a estratificação SG por causa da simplicidade; ver Figura 3B).
   1. Importe uma imagem lipídica SG em ImageJ (ou Fiji)³⁴ e verifique a caixa rotulada Split Channels para dividir o arquivo nos canais CARS e SRS.
      NOTA: Fiji dividirá o arquivo no número de imagens adquiridas durante o experimento em vários canais.
   2. Abra o gerente da região de interesse (ROI) clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente do ROI.
   3. Usando o canal SRS (por exemplo, C = 1), demarcar um SG na imagem.
      NOTA: Os SGs são os locais brilhantes devido à vibração alvo -CH₂.
   4. Adicione isso ao gerenciador de ROI clicando em Adicionar [t] no gerenciador de ROI ou pressionando t no teclado. Repita este processo para cada SG dentro da imagem.
   5. Para mascarar regiões ricas em lipídios, selecione cada ROI e clique na guia Mais | OU (Combinar) | Adicione ao gerente do ROI.
   6. Para mascarar regiões pobres em lipídios, use a ferramenta retângulo no menu FIJI e desenhe um quadrado em torno de toda a imagem. Adicione isso ao gerente do ROI.
   7. Clique no ROI quadrado recém-adicionado, além do ROI que seleciona todas as regiões ricas em lipídios no gerenciador de ROI. Em More, selecione XOR para gerar uma máscara das regiões pobres em lipídios e adicioná-la ao gerenciador de ROI.
4. Carregue as imagens da API em Fiji.
5. Concatenar as imagens em ordem numérica (ou seja, Image0001, Image0002, Image0003, etc.) usando a seguinte sequência de menu: Imagem | Pilhas | Ferramentas | Concatenato.
   1. Alternativamente, importe essas imagens carregando uma das imagens para Fiji e, em seguida, selecionando uma opção chamada arquivos do Grupo com nomes semelhantes na página de configuração .
      NOTA: Isso fornece a capacidade de importar todas as imagens com um nome de arquivo semelhante e concatena-las automaticamente.
6. Enquanto estiver com a imagem concatenada ativa, vá até o gerenciador de ROI, selecione as regiões ricas em lipídios (ou seja, o SG), clique em Mais e selecione Multi-medida. Aguarde que a janela resultados apareça.
7. Procure área, Média, Min, Max e Mediana nas configurações de medição padrão. Se forem desejadas outras métricas para análise, habilite essas opções verificando a caixa de seleção relevante na janela Definir medidas (Analisar | Definir medidas...).
8. Exporte os dados da janela Resultados para uma planilha e adicione uma coluna intitulada Região.
9. Adicione lipídios ricos em cada linha de dados para as regiões ricas em lipídios. Adicione lipídios a regiões que estavam fora dos lipídios.
10. Adicione uma camada intitulada coluna e adicione a respectiva camada que foi analisada (Tabela Suplementar S1).
11. Repita as etapas 6.5 - 6.7 para as regiões com poucos lipídios enquanto o ROI apropriado é selecionado.
12. Para visualizar os dados, salve a planilha e importe-os tanto no JupyterLab (pacote matplotlib)³⁵ ou em R (pacote ggplot2)³⁶. Plote os dados em função do número de imagem versus intensidade média para estimar os dados de tempo de concentração. (Figura 5).
13. Importe a planilha em RStudio para realizar análises não-compartimentais (NCA) para a análise farmacocinética dos dados CRI.
14. Adicione uma coluna intitulada time.
15. Para Image0001, calcule a duração entre o aplicativo de formulação e a primeira imagem.
    NOTA: Este é o primeiro ponto de tempo. A duração do ciclo é usada para calcular as imagens restantes (e, portanto, pontos de tempo) que aumentam ao longo do tempo. Por exemplo, se o tempo desde a aplicação for de 30 min, Image0001 terá um ponto de tempo de 30 min e com uma duração de ciclo de 8 min, Image0002 terá um ponto de tempo de 38 min, Image0003 terá um ponto de tempo de 46 min e assim por diante.
16. Execute a NCA no RStudio (usando o pacote NonCompart)³⁷ nos dados de tempo de intensidade importados da planilha, com a seguinte chamada para uma camada/região:
    sNCA(x = tempo, y = média, dose = 1, timeUnit = "s", doseUnit ="mg")
    Quando x se refere a pontos de tempo, y refere-se à intensidade, e a dose pode ser deixada como uma, calculada como a dose mM da droga na formulação ou na dose do produto.
    NOTA: A saída NCA fornecerá parâmetros como C_max e AUC_. No entanto, como se trata de ex vivo skin, esses parâmetros são, de fato, fluxo de J_max e AUC_.
17. Compare as métricas_{de fluxo} J_max e AUC visualmente, plotando-as (Figura 6), além de comparações estatísticas em condições experimentais. Veja a Figura 6 como exemplo da análise dos estudos ex vivo CRI.
    NOTA: Os testes estatísticos apropriados estão condicionados a cada conjunto de dados específico. Também é importante notar que todos os parâmetros farmacocinéticos são distribuídos normalmente, e quaisquer comparações devem usar os dados transformados em log (log natural ou log10).

Figura 5: Intensidade versus perfis de tempo. (A) Um exemplo de perfis de fluxo que atingiram a saturação e, portanto, apenas uma diminuição na intensidade é visto. Cada ROI tem um perfil de fluxo diferente para demonstrar a heterogeneidade nos dados que se pode adquirir. (B) Um exemplo de concentrações que aumentam após o início da imagem. Cada ROI é um campo de visão diferente (indicado pelos diferentes traços de cores) dentro do mesmo tecido do mesmo experimento. Além das concentrações globais, há a capacidade de elucidar qual ambiente local uma API/formulação prefere como indicado por regiões ricas em lipídios e lipídios. Os perfis apresentados em A indicam que não há absorção de droga no tecido, pois a API já permeou e começou a deixar o tecido assim que a imagem começar. No entanto, em B, o tecido não atingiu a saturação, e ainda há absorção da API seguida de eliminação. A segmentação de imagens em lipídios ricos e lipídes-pobres ajudará na elucidação da localização da API (ou inativas) e nas vias de permeação na pele (ou seja, corneum estrato). Uma maior concentração dentro das regiões ricas em lipídios indica que a API localiza dentro da estrutura lipídica da camada sob investigação, o que auxilia nas informações de entrega de medicamentos direcionadas. Abreviaturas: ROI = região de interesse; API = ingrediente farmacêutico ativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

A imagem é considerada bem sucedida se o tecido não tiver se movido significativamente tanto no axial (<10 μm) quanto na direção lateral após a conclusão do experimento (Figura 4). Esta é uma indicação imediata se a medição srs para a API de interesse não é representativa da profundidade inicial, para a qual a quantificação é específica de camada. Isso é mitigado por pilhas z de imagem para cada posição de interesse XY, com a compensação sendo a resolução temporal. S...

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Discussão

A avaliação da BA/BE atual é uma área de pesquisa que requer uma abordagem multifacetada, pois nenhum método único pode caracterizar totalmente in vivo cPK. Este protocolo apresenta uma metodologia para a avaliação da BA/BE de um produto de medicamentos tópicos com base em imagens raman coerentes. Um dos primeiros pontos que podem ser negligenciados é o quão finas as amostras de pele devem ser, especialmente para a transmissão quantitativa de imagens srs. Se a pele é muito grossa (ou seja, ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Preparation
Autoclavable Biohazard Bags	FisherBrand	22-044562	As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Corning	MT21030CV	As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv
Disposable Scalpels	Exel International	14-840-00	As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-132	As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Kimberly-Clark Professional Kimtech Science	06-666	As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Bemis	13-374-12	As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petri Dish (35 mm x 10 mm)	Fisherbrand	FB0875711YZ	As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Petri Dish (60 mm x 15 mm)	Fisherbrand	FB0875713A	As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Surgical Scissors	Roboz	NC9411473	As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC
Laser/microscope
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock		As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter)
Control box IX2-UCB	Olympus		As refered to in text: Control Box
D700/30m	Chroma		As refered to in text: CARS filter - deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight	Spectra-Physics		As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console	ThorLabs	PM100D	As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Software	Olympus		As refered to in text: Microscope Control software
Frosted Microscope Slides	FisherBrand		As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000	Olympus		As refered to in text: Microscope
Incubation Chamber	Tokai Hit	GM-800	As refered to in text: incubation chamber
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S142C	As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Power supply FV31-PSU	Olympus		As refered to in text: Power Supply
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator	BK Precision		As refered to in text: function generator
ProScan – Precision Microscope Automation	Prior Scientific Instruments		As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal Imaging Spacers	Grace Biolabs	654004	As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS Detection Kit	APE		As refered to in text: SRS detector
UPLSAPO 20X NA:0.75	Olympus		As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Drug Imaging
35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter	MatTek Corporation	NC9711297	As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Cotton-tipped applicators	FisherBrand		As refered to in text: Cotton-tipped applicator
Distriman Postive Displacement Pipette	Gilson		As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Postive Displacement Pipette Tips	Gilson		As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Data Analysis
FIJI	Open-source		As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab	open-source		As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/
Rstudio	Open-source		As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/