Plataforma microfluídica pneumática para concentração de micropartículas

Resumo

O presente protocolo descreve uma plataforma microfluidica pneumática que pode ser usada para uma concentração eficiente de micropartículas.

Resumo

O presente artigo introduz um método para fabricar e operar uma válvula pneumática para controlar a concentração de partículas usando uma plataforma microfluidica. Esta plataforma possui uma rede tridimensional (3D) com canais de fluido curvo e três válvulas pneumáticas, que criam redes, canais e espaços através da replicação duplex com polidimetilsiloxano (PDMS). O dispositivo opera com base na resposta transitória de uma taxa de fluxo de fluido controlada por uma válvula pneumática na seguinte ordem: (1) carregamento amostral, (2) bloqueio amostral, (3) concentração amostral e (4) liberação da amostra. As partículas são bloqueadas pela fina deformação da camada de diafragma da placa da válvula de peneira (Vs) e se acumulam no canal microfluido curvo. O fluido de trabalho é descarregado pela atuação de duas válvulas de entrada/desliga. Como resultado da operação, todas as partículas de várias ampliações foram interceptadas e desengajadas com sucesso. Quando esta tecnologia é aplicada, a pressão operacional, o tempo necessário para concentração e a taxa de concentração podem variar dependendo das dimensões do dispositivo e da ampliação do tamanho das partículas.

Introdução

Devido à importância da análise biológica, as tecnologias microetroecânicas microfluidicas e biomédicas (BioMEMS) ^1,2 são utilizadas para desenvolver e estudar dispositivos para a purificação e coleta de micromateriais ^2,3,4. A captura de partículas é categorizada como ativa ou passiva. Armadilhas ativas têm sido usadas para forças dieletéricas externas⁵, magnetoforéticas⁶,^{auditivas 7}, visuais⁸ ou^{térmicas 9} que atuam em partículas independentes, permitindo o controle preciso de seus movimentos. No entanto, é necessária uma interação entre a partícula e a força externa; assim, o rendimento é baixo. Nos sistemas microfluidos, controlar a vazão é muito importante porque as forças externas são transmitidas para as partículas alvo.

Em geral, os dispositivos microfluidos passivos possuem micropillars em microcanais ^10,11. As partículas são filtradas através da interação com um fluido fluindo, e esses dispositivos são fáceis de projetar e baratos de fabricar. No entanto, eles causam entupimento de partículas em micro-pilares, por isso dispositivos mais complexos foram desenvolvidos para evitar o entupimento de partículas¹². Dispositivos microfluidos com estruturas complexas são geralmente adequados para o gerenciamento de um número limitado de partículas 13,14,15,16,17,18.

Este artigo descreve um método para fabricar e operar uma plataforma microfluidica pneumática para grandes concentrações de partículas que superam as deficiências¹⁸ como mencionado acima. Esta plataforma pode bloquear e concentrar partículas por deformação e atuação da fina camada de diafragma da placa da válvula de peneira (Vs) que se acumula em canais microfluidos curvos. As partículas se acumulam em canais microfluidos curvos, e as partículas concentradas podem se separar descarregando o fluido de trabalho através da atuação de duas vedações PDMS sobre/desliga¹⁸ válvulas. Este método torna possível processar um número limitado de partículas ou concentrar um grande número de pequenas partículas. Condições operacionais como a magnitude da taxa de fluxo e a pressão de ar comprimido podem evitar danos celulares indesejados e aumentar a eficiência da captura celular.

Protocolo

1. Projetando a plataforma microfluidica para concentração de partículas

1. Projete a plataforma microfluida pneumática constituída por uma válvula pneumática para fluxo de fluidos na rede de fluxo 3D e três válvulas pneumáticas para a operação da válvula peneira (Vs), fluido (Vf) e partícula (Vp) (Figura 1).
   NOTA: Os blocos vs concentram partículas do líquido, e Vf e Vp permitem a liberação de fluidos e partículas após a concentração. Três portas pneumáticas fornecem ar comprimido da camada de alimentação fluida/pneumática (normalmente aberta) e da saída de luz da válvula pneumática para acionar a válvula. A rede de canais microfluidos é projetada com um programa CAD^18,19.
2. Projete o canal para ser uma camada de alimentação pneumática e uma camada de rede de canais 3D (Figura 2).
   NOTA: A rede de fluidos é interligada com os canais curvos na parte anterior e a câmara retangular na região posterior. Vs bloqueiam a entrada, e as partículas se acumulam na área de coleta do canal de fluidos curvos. Os fluidos livres de partículas (líquidos livres de partículas) são saídas através da saída Qf e das partículas concentradas através da saída Qp (Figura 3).
3. De acordo com as condições acima, prepare quatro tipos de moldes SU-8.
   NOTA: Os quatro moldes incluem um molde que permite que a válvula seja controlada via pneumática, dois moldes que criam canais fluidos e um molde limpo sem forma (Figura 4 e Tabela 1). Os quatro tipos de moldes mencionados são fabricados utilizando processos de fotolitografia padrão. Esta fabricação de molde consiste em um molde SU-8 em um wafer de silício, conforme relatórios publicados anteriormente^18,19. A figura 5 mostra o chip do dispositivo.

2. Fabricação da plataforma microfluidica para concentração de partículas

NOTA: A Figura 6 ilustra a fabricação de uma plataforma microfluidica que concentra partículas.

1. Replicou a camada PDMS usando um molde SU-8 do canal pneumático preparado (etapa 1.3) para controlar pneumaticamente a válvula.
   1. Despeje 10 mL de PDMS líquido e 1 mL de agente de cura (ver Tabela de Materiais) em um molde de canal de válvula pneumática preparado (passo 1.3) e aque o calor a 90 °C por 30 min.
   2. Após a cura das estruturas PDMS, separe o molde SU-8 da etapa 2.1.1.
   3. Bata três portas pneumáticas de 1,5 mm (Vs, Vf e Vp) no canal da válvula pneumática fabricado de acordo com a etapa 2.1.2 usando uma punção de 1,5 mm (ver Tabela de Materiais).
   4. Despeje 10 mL de PDMS líquido e 1 mL de agente de cura em um molde SU-8 limpo preparado preparado preparado na etapa 1.3 e spin-coat a 1.500 rpm por 15 s usando um revestimento de spin (ver Tabela de Materiais). Em seguida, aque o calor é de 90 °C por 30 min.
   5. Após a cura das estruturas PDMS, separe o molde SU-8 da etapa 2.1.4.
      NOTA: A camada de diafragma da válvula controla o fluxo de fluidos de acordo com a pressão pneumática.
   6. Trate o plasma atmosférico (ver Tabela de Materiais) para as estruturas PDMS preparadas nas etapas 2.1.3 e 2.1.5 para 20 s.
   7. Alinhe diretamente estruturas PDMS tratadas com plasma a partir da etapa 2.1.6 de acordo com a estrutura do canal, verificando com um microscópio.
   8. Unifique as estruturas PDMS alinhadas preparadas na etapa 2.1.7 por aquecimento a 90 °C por 30 min.
   9. Perfurar um orifício de 1,5 mm de diâmetro na entrada do canal fluido (Qfp) e saídas de canal de fluido (Qf e Qp) dentro da parte pneumática do canal à qual a fina camada de diafragma é ligada, usando uma punção de 1,5 mm.
2. Replique ambos os lados da camada PDMS usando dois moldes SU-8 para fazer um canal microfluido. Use um molde de canal microfluido curvo e retangular na frente e um molde de canal de interconexão microfluidic na parte traseira.
   1. Despeje 10 mL de PDMS líquido e 1 mL de agente de cura no molde de canal microfluido curvo e retangular e spin-coat a 1.200 rpm por 15 s. Em seguida, crie moldes para a câmara de fluido curvo e canais fluidos por ativação térmica a 90 °C por 30 min (Figura 6A).
   2. Separe a camada PDMS na qual o canal microfluido é formado, em seguida, faça um molde ativado pelo calor cobrindo a parede de ventilação selada, ligando-se ao wafer de vidro, tratando o plasma atmosférico por 20 s (Figura 6B).
   3. Despeje 3 mL de PDMS líquido no canal de interconexão do molde SU-8 (Figura 6C).
   4. Disponha a estrutura fabricada na etapa 2.2.2 com o molde do canal de interconexão em PDMS líquido no molde do canal de interconexão microfluida e seque a estrutura sobreposta a 130 °C por 30 min (Figura 6D).
      NOTA: Ao curar a estrutura traseira, o molde PDMS fabricado na etapa 2.2.2 é inflado pela pressão térmica da camada de ar, e a camada PDMS deformada é ativada termicamente (Figura 6E)¹⁶.
   5. Após a cura, remova o molde SU-8 dianteiro da camada de rede de canais microfluidos e retire cuidadosamente o molde PDMS traseiro (Figura 6F).
      NOTA: A camada de rede fluidic 3D permite a criação de uma câmara de fluidos curvos anteriores e canais microfluidos.
   6. Despeje 10 mL de PDMS líquido e 1 mL de agente de cura em um molde SU-8 limpo. Em seguida, aque o calor é de 90 °C por 30 min.
   7. Depois que as estruturas PDMS forem curadas, separe o molde SU-8.
      NOTA: Esta etapa cria a camada de vedação adicional.
   8. Trate o plasma atmosférico às estruturas PDMS preparadas nas etapas 2.2.3 e 2.2.7 para 20 s.
   9. Alinhe diretamente as estruturas PDMS tratadas com plasma de acordo com a estrutura do canal, verificando com um microscópio.
   10. Unindo as estruturas PDMS alinhadas aquecendo a 90 °C por 30 min.
3. Alinhe as estruturas PDMS preparadas nas etapas 2.1 e 2.2 de acordo com a estrutura do canal e uni-las tratando plasma atmosférico para 20 s.

3. Configuração do dispositivo

NOTA: A Figura 7 mostra a fabricação de uma plataforma microfluidica que concentra partículas.

1. Encha manualmente o canal microfluido com água desmineralizada sem bolhas usando uma seringa de 10 mL.
2. Para controlar a P_Qfp e as três válvulas pneumáticas (P_Vs, P_Vf e P_Vp) que controlam o fluxo de microesferas, insira um controlador de pressão de precisão com quatro ou mais canais de saída (ver Tabela de Materiais) para o fluido de trabalho (Qfp) na plataforma microfluida.
   NOTA: Um controlador de pressão de precisão com quatro canais de saída pode ser substituído por múltiplos controladores de pressão de precisão. Neste experimento, a pressão operacional de P_Qfp foi de 10 kPa, P_Vs foi de 15 kPa, e P_Vf e P_Vp foram ambos de 18 kPa (Figura 8 e Tabela 2). A Figura 8 mostra a taxa de fluxo de fluido de trabalho ao longo do tempo, pois as partículas estão concentradas pela plataforma microfluida com P_Vs de 15 kPa, e a Tabela 2 mostra os resultados de atuação de acordo com as válvulas pneumáticas.
3. Prepare partículas de teste de poliestireno carboxíl de vários tamanhos em água destilada (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Os tamanhos de partículas utilizados neste experimento foram de 24,9, 8,49 e 4,16 μm; partículas de vários tamanhos podem ser usadas dependendo da pressão de P_Vs.
4. Para controlar a vazão do fluido de trabalho, encha uma garrafa de vidro meio cheia com água (fluido de trabalho) e conecte a tampa da garrafa de vidro ao canal de saída do controlador e microvalve.
   NOTA: Conecte um tubo à microválvula para receber ar comprimido do controlador e do outro tubo para injetar água.
5. Observe a operação da plataforma através de um microscópio invertido para todas as operações da plataforma e meça a taxa de fluxo operacional ao longo do tempo na tomada por um medidor de fluxo líquido (ver Tabela de Materiais).

4. Funcionamento do dispositivo

1. Injete a mistura de partículas/fluidos sob pressão na entrada (Qfp) com Vp (Figura 9A).
   NOTA: O fluxo de partículas e o fluido limpo da tomada através dos canais interligados são controlados via Vp e Vf, respectivamente (Tabela 2).
2. Aplique pressão em Vs a 15 kPa e Vp a 18 kPa para acionar a válvula.
   NOTA: Neste momento, o diafragma está deformado, as partículas do fluido Qfp são bloqueadas no espaço de contato entre o canal de fluido curvo e o cantilever fluido curvo, e o fluido Qfp indesejado é liberado através do Qf aberto (Figura 9B,C).
3. Quando as partículas estiverem concentradas, aplique pressão apenas em Vf.
   NOTA: Neste momento, quando a pressão é aplicada apenas ao Vf, as partículas entupidas são liberadas através de Qp (Figura 9D).

Resultados

A Figura 8 mostra a taxa de fluxo das taxas de fluido para uma operação de plataforma de quatro estágios, conforme mencionado na Tabela 2. A primeira etapa é o estado de carga (estado). A plataforma foi fornecida com fluido com todas as válvulas abertas, e o fluido de trabalho (Qf) e partículas (Qp) são quase idênticos, pois a rede de canais microfluidos exibe simetria estrutural. No segundo estágio (estado b), o ar comprimido foi transportado para Vs para bloquear ...

Discussão

Esta plataforma fornece uma maneira simples de purificar e concentrar partículas de vários tamanhos. As partículas são acumuladas e liberadas através do controle pneumático da válvula, e nenhum entupimento é observado porque não há estrutura passiva. Usando este dispositivo, a concentração de partículas de três tamanhos é apresentada. No entanto, a pressão operacional, o tempo necessário para concentração e a taxa podem variar dependendo das dimensões do dispositivo, ampliação do tamanho das partíc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mm puncture	Self procduction	Self procduction	This puncture was made by requesting a mold maker based on the Miltex® Biopsy Punch with Plunger (15110-15) product.
4 inch Silicon Wafer/SU-8 mold	4science	29-03573-01	4 inch (100) Ptype silicon wafer/SU-8 mold
Carboxyl Polystyrene Crosslinked Particle(24.9 μm)	Spherotech	CPX-200-10	Concentrated bead sample1
Flow meter	Sensirion	SLI-1000	Flow measurement
High-speed camera	Photron	FASTCAM Mini	Observation of concentration
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL/Syringe	Koreavaccine	22G-10ML	Fill the microfluidic channel with bubble-free demineralized water.
Laboratory Conona treater/Atmospheric plasma	Electro-Technic	BD-20AC	Chip bonding/atmospheric plasma
Liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
Microscope	Olympus	IX-81	Observation of concentration
PEEK Tubes	SAINT-GOBAIN PPL CORP.	AAD04103	Inject or collect particles
Polystyrene Particle(4.16 μm)	Spherotech	PP-40-10	Concentrated bead sample3
Polystyrene Particle(8.49 μm)	Spherotech	PP-100-10	Concentrated bead sample2
Pressure controller/μflucon	AMED	μflucon	Control of air pressure
Spin coater	iNexus	ACE-200	spread the liquid PDMS on SU-8 mold