Monitorização da Pressão Intracraniana em Modelo de Roedor de Hemorragia Intraventricular Não Traumática

Resumo

O monitoramento da pressão intracraniana em modelos de roedores de hemorragia intraventricular não traumática não é comum na literatura atual. Neste trabalho, demonstramos uma técnica para medir a pressão intracraniana, a pressão arterial média e a pressão de perfusão cerebral durante hemorragia intraventricular em um modelo animal de rato.

Resumo

Sobreviventes de hemorragia intraventricular são frequentemente deixados com comprometimento significativo da memória de longo prazo; assim, pesquisas utilizando modelos animais de hemorragia intraventricular são essenciais. Neste estudo, buscamos formas de medir a pressão intracraniana, a pressão arterial média e a pressão de perfusão cerebral durante hemorragia intraventricular não traumática em ratos. O delineamento experimental incluiu três grupos de Sprague Dawley: sham, hemorragia intraventricular padrão de 200 μl e grupos controle de veículos. Com a introdução de um sensor de pressão de fibra óptica intraparenquimatoso, foram obtidas medidas precisas de pressão intracraniana em todos os grupos. As pressões de perfusão cerebral foram calculadas com o conhecimento da pressão intracraniana e dos valores médios da pressão arterial. Como esperado, os grupos hemorragia intraventricular e controle de veículos experimentaram um aumento na pressão intracraniana e subsequente declínio na pressão de perfusão cerebral durante a injeção intraventricular de sangue autólogo e líquido cefalorraquidiano artificial, respectivamente. A adição de um sensor de pressão de fibra óptica intraparenquimatosa é benéfica no monitoramento de mudanças precisas de pressão intracraniana.

Introdução

A hemorragia intraventricular (IVH), um tipo de hemorragia intracraniana (HIC), é uma doença devastadora que carrega mortalidade e morbidade significativas. A IVH é caracterizada como o acúmulo de hemoderivados no interior dos ventrículos intracranianos. A IVH isolada é incomum e geralmente ocorre em adultos¹. Pode estar associada a hemorragia hipertensiva, ruptura de aneurisma intracraniano ou outra malformação vascular, tumores ou trauma¹. A IVH leva à lesão cerebral secundária, bem como ao desenvolvimento de hidrocefalia². Os sobreviventes de IVH são frequentemente deixados com deficiências funcionais, de memória e cognitivas significativas após a lesão. Esses déficits cognitivos e de memória de longo prazo são relatados em até 44% dos sobreviventes de HIC³. Na hemorragia subaracnóide (HAS), outro tipo de HIC, sabe-se que aproximadamente metade dos sobreviventes terá déficits de memória e, para aqueles que apresentam IVH, além da HAS, os desfechos tendem a ser significativamente piores ^4,5,6.

Os mecanismos subjacentes de disfunção da memória após a IVH ainda precisam ser elucidados. Pesquisas in vivo utilizando modelos animais de IVH não traumáticos com disfunção funcional e de memória são essenciais para descobrir potenciais alvos terapêuticos para esses pacientes. Modelos animais com memória mais grave e disfunção funcional após IVH seriam os melhores para estudar essas mudanças. O laboratório do autor sênior também tem investigado especificamente o papel da alta pressão intracraniana (PIC) no desenvolvimento de déficits de memória em modelos de ratos IVH. Assim, métodos para medir com precisão as PIC durante a IVH foram importantes para investigar. Neste documento, relatamos métodos de medição precisa de PIC em um modelo de rato IVH. Embora o monitoramento de PIC tenha sido utilizado anteriormente em modelos animais de ICH traumática e hemorragia subaracnóide, o monitoramento de PIC em modelos espontâneos de roedores de IVH não é tão comumente relatado na literatura ^7,8. Assim, o delineamento experimental aqui apresentado incluiu três grupos de ratos Sprague Dawley: simulação, hemorragia intraventricular padrão de 200 μl e controle veicular. Para o grupo IVH, foi utilizado um modelo autólogo de injeção intraventricular de sangue. Para os animais controle veiculares, foi utilizada a injeção intraventricular de solução estéril de Ringer Lactado. As PIC, as pressões arteriais médias (PAM) e as pressões de perfusão cerebral (PCCs) foram registradas no intraoperatório, e os resultados são relatados neste documento.

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Protocolo

Todos os métodos de pesquisa e cuidados/manutenção dos animais foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade da Califórnia, Davis. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Davis, aprovou todos os protocolos de uso de animais e procedimentos experimentais (protocolo IACUC # 21874).

1. Alojamento de animais

1. Obtenha ratos Sprague-Dawley de 8-10 meses de idade. Antes de qualquer procedimento experimental, abrigue os ratos em um biotério e aguarde pelo menos 1 semana para adaptação geral em suas gaiolas após um ciclo claro/escuro de 12 horas com comida e água ad libitum.

2. Anestesia e procedimentos pré-operatórios

1. Anestesiar o rato com isoflurano a 4% por 4 min. Pendurar o rato pelos dentes em decúbito dorsal sobre uma plataforma de intubação e intubar endotraquealmente usando uma cânula endotraqueal e laringoscópio.
2. Coloque o rato anestesiado e entubado em um ventilador (isoflurano a 2% e gás transportador de O2/N2). O rato é adequadamente anestesiado se não for observada resposta a um estímulo doloroso, como uma pitada na pata traseira.
3. Insira um termômetro retal para monitorar continuamente a temperatura.
4. Realizar todos os procedimentos operatórios utilizando técnica estéril. Prenda o cabelo na cabeça e na região femoral e prepare a pele com três esfoliantes alternados de Betadine e álcool a 70% antes da cirurgia.
5. Aspirar quaisquer secreções respiratórias acumuladas removendo temporariamente o rato do ventilador e aspirando as secreções com tubos PE-50 conectados a uma seringa de 10 mL.
6. Proteja os olhos do rato com pomada de olho de lágrimas artificiais estéreis.
7. Injete bupivacaína local (~0,1 ml de solução a 0,25%) na pele e nos tecidos subcutâneos antes da incisão no couro cabeludo.

3. Protocolo cirúrgico

1. Colocação de agulha intraventricular e monitor de pressão intracraniana (PIC)
   1. Coloque o rato em posição prona em uma estrutura estereotáxica e corte a orelha do rato.
   2. Faça uma incisão no couro cabeludo de 1,5 cm ao longo da linha média com um bisturi de 15 lâminas.
   3. Aplique pressão leve com gaze para hemostasia.
   4. Usando um aplicador de ponta de algodão estéril, separe o periósteo do crânio até que o ponto de referência do bregma seja visível.
   5. Localizar e demarcar o bregma usando estereotáxis e marcar a localização de dois orifícios bilaterais de rebarbas, 1,4 mm laterais e 0,9 mm posteriores ao bregma.
   6. Usando uma broca de mão, crie esses dois pequenos furos de rebarbas cranianas (até 2 mm) nos hemisférios direito e esquerdo. Irrigue qualquer excesso de lascas ósseas com solução estéril de gengibre lactado.
   7. No hemisfério direito, posicione uma cânula guia 22-G ao nível do orifício da rebarba para inserir a agulha 28-G através da cânula até a profundidade do ventrículo lateral direito (4,6 mm em relação ao bregma), a fim de criar IVH.
   8. Conecte o sensor de pressão de fibra óptica à unidade de leitura. Ligue a unidade de leitura e verifique se as unidades selecionadas estão em mmHg. Em seguida, prima o sensor submergindo sua ponta em um pequeno copo com a solução de Lactated Ringer até que a unidade de leitura leia zero. Uma vez zerado na solução de Lactated Ringers, está tudo pronto para ser inserido.
   9. No hemisfério esquerdo, insira suavemente o sensor de pressão a 2-3 mm de profundidade no córtex para monitoramento de ICP em tempo real.
2. Monitorização da canulação da artéria femoral e inserção da pressão arterial média (PAM)
   1. Após a inserção do monitor de PIC, gire o tronco inferior do rato para facilitar o acesso à área da coxa esquerda e da virilha.
   2. Após a preparação estéril e a administração local de bupivacaína, faça uma incisão cutânea de 1,5 cm sobre o membro posterior com um bisturi de 15 lâminas.
   3. Dissecar a artéria femoral esquerda primeiro superficialmente com um hemostático e, em seguida, camadas mais profundas usando pinça com pontas finas sob um microscópio. Identifique a veia femoral azul profunda para ajudar a localizar a artéria adjacente.
   4. Amarre a artéria femoral distal usando sutura de seda 3-0 e coloque um clipe de metal temporário na porção proximal da artéria femoral.
   5. Tenha um segundo sensor de pressão de fibra óptica conectado à unidade de leitura já preparada. Insira o sensor de pressão na tubulação de polietileno (PE-50), que é inserida em um Tuohy Borst que é então fechado. Conecte o Tuohy Borst a uma torneira de 3 vias conectada a uma seringa de 1 mL em uma extremidade e a uma agulha de 22 G com tubo PE-50 na outra extremidade.
   6. Sob o microscópio, faça uma arteriotomia femoral de 2 mm com micro tesoura e canule-a com tubo PE-50 conectado ao resto da configuração.
3. Injeção intraventricular
   1. Aspirar 500 μL de sangue utilizando uma seringa de 1 ml e virar a torneira de 3 vias para que o sensor de pressão leia MAP.
   2. Prima a agulha intraventricular 28-G conectada ao tubo PE-50 com o sangue aspirado para animais IVH e Lactated Ringer's para os animais controle do veículo. Em seguida, insira esta agulha na cânula guia até a profundidade do ventrículo lateral direito.
   3. Usando uma taxa de 100 μL/min, injete o sangue ou a solução estéril de Lactated Ringer (200 μL) no ventrículo lateral direito, bombeando a seringa de 1 mL com o polegar. Antes disso e durante a injeção intraventricular, monitore e registre a PIC, a pressão arterial e a temperatura retal.
   4. Monitore e registre os valores de ICP e MAP pós-injeção.
4. Encerramento
   1. Após a conclusão da injeção intraventricular, retire o tubo PE-50 contendo o sensor de pressão que foi inserido na artéria femoral e aplique o clipe temporário na artéria femoral para evitar sangramento.
   2. Amarre a porção proximal da artéria femoral usando a sutura de seda 3-0.
   3. Feche a incisão femoral de forma interrompida usando seda 3-0.
   4. Remova a cânula guia com a agulha intraventricular e o monitor de PIC.
   5. Sele os orifícios da rebarba com cera óssea.
   6. Feche a incisão craniana com sutura de seda 3-0 de forma interrompida.
   7. Aplicar bupivacaína tópica na incisão e injetar 0,35 mL de carprofeno (5 mg/kg) no pós-operatório. Não deixe os animais sozinhos até que eles tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
   8. Permita que os ratos se recuperem totalmente após a cirurgia sob supervisão e devolva-os às gaiolas de casa com acesso gratuito a alimentos e água após a recuperação.

4. Manejo pós-operatório

1. Verificar todos os animais no pós-operatório diariamente durante sete dias de pós-operatório para monitorar sua recuperação, estado neurológico, comportamento, peso e incisões.
2. Administrar 0,35 mL de carprofeno (5 mg/kg) por injeção subcutânea no momento da cirurgia e no 1º e^2º dias de pós-operatório.
3. Retirar as suturas no^7º dia de pós-operatório de forma estéril.

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Resultados

Pressões de perfusão intracraniana, arterial média e cerebral
Tanto as PIC quanto as PAM foram monitoradas no intraoperatório em todos os animais (Figura 1). Os ratos tinham entre 8 e 10 meses de idade, com um peso médio de 495 ± 17 g. Também foram coletados gráficos de PIC em tempo real (Figura 2). Excluindo-se o grupo simulado, as PIC aumentaram significativamente durante a injeção intraventricular na IVH, bem como nos gr...

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Discussão

Este estudo investigou mecanismos para medir PIC, PAM e CPPs em um modelo animal de rato IVH não traumático. Os resultados foram registrados nos seguintes grupos: animais simulados, VH 200 μL e controle veicular (injeção intraventricular de líquido cefalorraquidiano artificial). Este delineamento experimental foi escolhido para investigar como as PIC podem ser monitoradas durante a injeção de IVH, pois levantamos a hipótese de que o pico de ICPs pode contribuir para a lesão cerebral secundária mais significati...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% bupivacaine	Hospira, Inc.	409115901
1 mL syringe	Covetrus	60734
10% providine iodine solution	Aplicare	MSD093947
20 mL syringe	Covidien	8881520657
22 G needles	Becton Dickinson	305155
28 G intraventricular needles	P technologies	8IC313ISPCXC	C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection
3-0 silk suture	Henry Schein, Inc.	SP116
3-way-stopcock	Merti Medical Systems	M3SNC
4% paraformaldehyde	Fisher Chemical	30525-89-4
AnyMaze software	Any-Maze behavioral tracking software		Stoelting CO, USA
Artificial ointment	Covetrus	48272
Blood collection vials with EDTA	Becton Dickinson	367856
Bone wax	CP Medical, Inc.	CPB31A
Carprofen	Zoetis, Inc.	54771-8507-1
Centrifuge	Beckman	BE-GS6R	Model GS-6R
Cotton tip applicators	Covetrus	71214
Drill	Dremel	1600A011JA
Fiberoptic pressure sensors with readout units	Opsens Medical	OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC	Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system
Forceps		11923-13, 11064-07
Gauze	Covetrus	71043
Guillotine	World Precision Instruments	51330
Heating pad with rectal thermometer	CWE, Inc.	08-13000 ,08-13014	TC1000 Temperature controller
Hemostats		13013-14,  13008-12
Isoflurane	Covetrus	29405
Lactated ringers	Baxter Healthcare Corp.	Y345583
Laryngoscope	American Diagnostic Corporation	4080
Metal clip	Fine Scientic Tools	18056-14
Micro scissors	Fine Scientic Tools	15007-08
Microscope	Leica	model L2
Needle driver		12003-15
Polyethylene tubing	Thermo Fisher Scientific	14-170-12B	PE-50 tubing
Rats	Envigo		Sprague Dawley rats 8–10 months old
Scalpel		10010-00
Scissors		14090-11
Stereotaxic instrument	Kopf instruments		Model 940 with ear bars
Syringe pump	KD Scientific	780100	Model 100 series
Tuohy Borst	Abbott	23242
Ventilator	Harvard rodent ventilator	55-0000	Model 683