Quantificação de espécies reativas de oxigênio usando 2′,7′-Sonda diacetato de diclorofluoresceína e flução-citometria em células gliais Müller

Resumo

Aqui, propomos um protocolo sistematizado, acessível e reprodutível para detectar espécies de oxigênio reativa celular (ROS) usando uma sonda diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) em células gliais Müller (MGCs). Este método quantifica os níveis ros celulares totais com um citómetro de fluxo. Este protocolo é muito fácil de usar, adequado e reprodutível.

Resumo

O balanço redox tem um papel importante na manutenção da homeostase celular. O aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) promove a modificação de proteínas, lipídios e DNA, o que finalmente pode levar a alterações na função celular e morte celular. Portanto, é benéfico para as células aumentar sua defesa antioxidante em resposta a insultos prejudiciais, seja ativando uma via antioxidante como Keap1/Nrf2 ou melhorando os catadores de redox (vitaminas A, C e E, β-caroteno, e polifenóis, entre outros). Inflamação e estresse oxidativo estão envolvidos na patogênese e progressão de retinopatias, como retinopatia diabética (DR) e retinopatia da prematuridade (ROP). Uma vez que as células gliais Müller (MGCs) desempenham um papel fundamental na homeostase do tecido neural da retina, elas são consideradas um modelo ideal para estudar esses mecanismos de proteção celular. Nesse sentido, quantificar os níveis ros com um método reprodutível e simples é essencial para avaliar a contribuição de caminhos ou moléculas que participam do mecanismo de defesa celular antioxidante. Neste artigo, fornecemos uma descrição completa dos procedimentos necessários para a medição do ROS com sonda DCFH-DA e citometria de fluxo em MGCs. Etapas-chave para o processamento de dados de citometria de fluxo com o software são fornecidas aqui, para que os leitores possam medir os níveis DE ROS (meios geométricos do FITC) e analisar histogramas de fluorescência. Essas ferramentas são altamente úteis para avaliar não apenas o aumento do ROS após um insulto celular, mas também para estudar o efeito antioxidante de certas moléculas que podem fornecer um efeito protetor sobre as células.

Introdução

A retina neural é um tecido muito organizado que apresenta camadas neuronais bem definidas. Nestes, os neurônios (gânglios, amacrinas, bipolares, horizontais e fotorreceptoras) estão interligados entre si e também com células gliais Müller (MGCs) e astrócitos, levando à fototransdução e processamento adequados de informações visuais ^1,2. Os MGCs são conhecidos por terem um papel importante na manutenção da homeostase da retina porque atravessam toda a seção da retina e, assim, podem interagir com todos os tipos celulares que modulam múltiplos processos de proteção. Foi relatado que as MGCs possuem diversas funções importantes para a manutenção e sobrevivência dos neurônios da retina, incluindo a glicólise para fornecer energia aos neurônios, a remoção de resíduos neuronais, a reciclagem de neurotransmissores e a liberação de fatores neurotróficos, entre outros ^3,4,5.

Por outro lado, inflamação, estresse oxidativo e nitrosativo estão envolvidos na patogênese e progressão de muitas doenças humanas, incluindo retinopatias 6,7,8,9,10,11. O equilíbrio redox nas células depende de uma regulação rigorosa dos níveis de ROS. As ROS são constantemente geradas em condições fisiológicas como resultado da respiração aeróbica principalmente. Os principais membros da família ROS incluem radicais livres reativos, como o ânion superóxido (O₂₀₀₉^•−), radicais hidroxílicos (^•OH), vários peróxidos (ROOR′), hidroperóxidos (ROOH) e o peróxido de hidrogênio não radical (H₂O₂)^12,13. Nos últimos anos, tornou-se evidente que a ROS desempenha um importante papel de sinalização nas células, controlando processos essenciais. Os MGCs possuem forte defesa antioxidante pela ativação do fator nuclear transcricional fator 2 (Nrf2) e pela subsequente expressão de proteínas antioxidantes para eliminar a produção excessiva de ROS sob condições patológicas 14,15,16. Quando as células perdem o equilíbrio de redox devido a uma produção exagerada de ROS ou uma capacidade defeituosa de remover ROS, o acúmulo de estresse oxidativo promove modificações nocivas em proteínas, lipídios e DNA, levando ao estresse celular ou à morte. O aumento do sistema de defesa antioxidante da retina melhora a resolução e prevenção de retinopatias, como ROP e RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Portanto, a medição da produção de ROS em tempo real é uma ferramenta poderosa e útil.

Existem vários métodos para medir a produção de ROS ou estresse oxidativo nas células. Entre elas, a sonda diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) é uma das técnicas mais utilizadas para quantificar diretamente o estado de redox de uma célula 25,26,27,28. Esta sonda é lipofílica e não fluorescente. A difusão desta sonda através da membrana celular permite seu decote por esterases intracelulares nas duas ligações éster, produzindo um produto relativamente polar e de membrana celular impermeável, 2′,7′-diclororesceína (H₂DCF). Esta molécula não fluorescente acumula-se intracelularmente, e a oxidação subsequente pela ROS produz o produto altamente fluorescente DCF. A oxidação da sonda é o produto da ação de múltiplos tipos de ROS (peroxito, radicais hidroxil, óxido nítrico ou peróxido), que pode ser detectada por citometria de fluxo ou microscopia concórdia (emissão a 530 nm e excitação a 485 nm). A limitação desta técnica é que o superóxido e o peróxido de hidrogênio não reagem fortemente com H₂DCF^25,29. Neste artigo, usamos a sonda DCFH-DA para medir e quantificar a ROS por citometria de fluxo. Por essa razão, induzimos a produção de ROS estimulando MGCs com indutor ROS, A ou B, antes de carregar as células com a sonda fluorescente. Além disso, usamos um composto antioxidante. Finalmente, mostramos dados representativos e confiáveis obtidos usando este protocolo.

Protocolo

NOTA: Para composições tampão, consulte a Tabela 1.

1. Preparação da cultura celular

NOTA: Descrita aqui é a preparação cultural das células MIO-M1, uma linha celular gliana humana espontâneo (Moorfield/Instituto de Oftalmologia- Müller 1). Use sempre a técnica asséptica adequada e trabalhe em uma coifa de fluxo laminar.

1. Prepare o meio completo do médio (DMEM) modificado da Águia (DMEM) modificado de Dulbecco. Para DMEM contendo 4,5 g/L D-glicose e 110 mg/L piruvanato de sódio, adicionar FBS inativados a calor de 10%, 10 mM 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES), 2 mM L-glutamina e 50 U/mL penicilina/estreptomicina. Prepare o meio fresco, no dia em que as células MIO-M1 serão descongeladas.
2. Descongele as células MIO-M1 congeladas no primeiro dia.
   1. Para isso, remova o criovial contendo 5 x 10⁵ células MIO-M1 em FBS com 10% de DMSO do armazenamento de nitrogênio líquido e coloque-o imediatamente em um banho de água de 37 °C.
      NOTA: Use sempre uma máscara facial ou óculos de segurança, uma vez que os criovials armazenados em nitrogênio líquido apresentam risco de explosão quando descongelados.
   2. Descongele as células MIO-M1 rapidamente (em menos de 1 minuto) aquecendo o frasco no banho de água de 37 °C até que haja apenas um pequeno pedaço de gelo deixado no frasco.
   3. Limpe o exterior do frasco com 70% de etanol e transfira-o para um capô de fluxo laminar.
   4. Transfira as células descongeladas do frasco para um tubo estéril de 15 mL e, em seguida, adicione 6 mL de dMEM médio dMEM completo pré-aquecido.
   5. Centrifugar a suspensão celular a aproximadamente 600 x g por 5 min. Após a centrifugação, um supernatante claro e uma pelota completa serão visualizados. Descarte o supernatante com uma pipeta sem perturbar a pelota celular.
   6. Dissociar suavemente a pelota e resuspensar as células em 10 mL de meio DMEM completo. Transfira esta suspensão celular para uma placa de cultura de tecido de 100 mm de diâmetro e incubar a placa por aproximadamente 2 dias a 37 °C, 5% DE CO₂.
3. Quando as células MIO-M1 se tornarem 80%-90% confluentes no dia 4, execute as seguintes etapas.
   1. Transfira a placa para um capô de fluxo laminar da incubadora. Remova cuidadosamente o supernasciente e lave 2x com 5 mL de PBS estéril e pré-aquecido. Aspire a PBS.
   2. Dispense 1 mL de solução Trypsin-EDTA de 0,5% e incuba a 37 °C na incubadora de CO₂ por 3-5 min para desprender as células.
   3. Adicione 7 mL do meio DMEM completo para inibir a ação de trippsina. Desagregar MGCs agrupados com trippsinizados, pipetando lentamente para cima e para baixo (P1000). Colete a suspensão da célula em um tubo de 15 mL.
   4. Centrifugar a 600 x g por 5 min. Descarte o supernatante. Levemente resuspenque a pelota de célula em 2 mL de mídia DMEM completa. Transfira 1 mL desta suspensão celular para uma placa de 100 mm contendo 9 mL de meio DMEM completo pré-aquecido.
   5. Repita a ação com outra placa de 100 mm. Incubar a placa por aproximadamente 1 dia a 37 °C em uma incubadora de CO₂ de 5%.
4. Quando ambas as placas se tornarem 80%-90% confluentes (no dia 6), transfira a placa para um capô de fluxo laminar. Siga o passo 1.3. para obter uma pelota de célula.
5. Dissocia suavemente a pelota e resuspenque as células em 5 mL de mídia DMEM completa. Conte as células MIO-M1 usando uma solução hemocitrótrócicra (câmara de Neubauer) e trypan blue seguindo os passos abaixo.
   1. Coloque a tampa de vidro na área central da câmara de Neubauer. Coloque a câmara sobre uma superfície plana (por exemplo, uma mesa ou bancada).
   2. Misture um volume igual de mancha azul trypan com as células. Por exemplo, misture 60 μL de azul trypan com 60 μL de células para uma diluição de 1:2.
   3. A partir desta mistura, carregue 10 μL com uma micropipette em uma câmara de Neubauer.
   4. Coloque a câmara de Neubauer carregada no palco do microscópio. Em seguida, acenda a luz e ajuste o brilho.
   5. Mova o estágio do microscópio para uma posição ideal e ajuste o foco até que uma imagem nítida das células seja obtida.
   6. Conte as células dentro dos quatro quadrados (subdivididos em 16) localizados na esquina do hemótmetro (volume: 0,1 mm³ cada ).
   7. Calcule a concentração celular usando as equações abaixo.
      Concentração = (Número de células x 10.000)/Número de quadrados
      Concentração = (Número de células x 10.000)/4
      Concentração = Número de células x 2500
      NOTA: Se for realizada a diluição celular, a concentração obtida deve ser convertida na concentração original antes da diluição.
      Concentração = (Número de células x 2500 x 2) = (Número de células x 5000 células/mL)
   8. Ajuste a suspensão celular para 1 x 10⁵ células/mL em meio DMEM completo e placa 2 mL desta suspensão celular em uma placa de 6 poços (2 x 10⁵ células/bem). Agite a placa suavemente para distribuir as células de forma homogênea. Incubar a placa de 6 poços durante a noite a 37 °C em uma incubadora de CO₂ de 5%.

2. Condições e controles de ensaio

1. Inclua os seguintes controles experimentais para cada experimento:
   1. Controle de autofluorescência (células sem sonda DCFH-DA, controle para definir os parâmetros do citômetro de fluxo).
   2. Controle basal (células não estimuladas).
   3. Controle positivo (células tratadas com indutor ROS, A ou B).
   4. Controle negativo (células tratadas com composto antioxidante)
   5. Amostra (células tratadas com composto antioxidante e indutor ROS, A ou B).

3. Executando o ensaio

NOTA: O ensaio é realizado no dia 7. Use sempre a técnica asséptica adequada e trabalhe em um capô de fluxo laminar, a menos que seja instruído de outra forma.

1. Prepare dMEM de baixo soro. Suplemento DMEM contendo 4,5 g/L D-glicose e 110 mg/L piruvato de sódio com FBS inativado por calor de 0,5%, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina e 50 U/mL penicilina/estreptomicina. Prepare o meio fresco no dia em que o MIO-M1 será tratado.
2. Transfira a placa de 6 poços (60%-70 % de confluência) para uma coifa de fluxo laminar da incubadora. Aspire o supernasciente e lave as células 1x com PBS. Adicione 2 mL do DMEM de baixo soro por poço e incubar a placa de 6 poços por 2h a 37 °C, 5% de CO₂. Isso é feito para matar as células de fome.
3. Depois de passar fome, trate as células com o composto antioxidante por 6 h.
   1. Aspire o supernasce e adicione 2 mL do estoque diluído às seguintes condições: controle negativo (células tratadas com composto antioxidante) e amostra (células tratadas com composto antioxidante e indutor ROS, A ou B).
   2. Incubar a placa de 6 poços por 6h a 37 °C, 5% de CO₂.
      NOTA: Se usar outro composto antioxidante ou inibidor ROS, padronize o tempo e concentração ideal para os estímulos.
4. Após 6h de incubação, trate as células com indutor ROS, A ou B, por 30 min.
   1. Adicione os estímulos às seguintes condições: controle positivo (células tratadas com indutor ROS, A ou B) e poços de amostra (células tratadas com composto antioxidante e indutor ROS, A ou B).
      NOTA: Mantenha as soluções de estoque no gelo.
   2. Incubar a placa de 6 poços por 30 min a 37 °C, 5% de CO₂.
      NOTA: Se usar outro indutor ROS, padronize corretamente o tempo e a concentração ideal para os estímulos.
5. Carregue as células com a sonda DCFH-DA.
   1. Aspire o supernasciente e lave as células na placa 3x de 6 poços com PBS para remover todos os estímulos.
   2. Desligue a luz do capô de fluxo laminar e trabalhe no escuro. Prepare uma diluição de 1:1000 da solução de estoque de sonda DCFH-DA de 5 mM para obter uma concentração final de 5 μM DCFH-DA em DMEM sem fenol vermelho em um tubo de 15 mL.
   3. Misture suavemente usando um vórtice e adicione 1 mL desta solução aos seguintes poços: controle basal (células não estimuladas), controle positivo (células tratadas com um indutor ros), controle negativo (células tratadas com composto antioxidante) e poços de amostra (células tratadas com composto antioxidante, e indutor ROS, A ou B).
   4. Adicione 1 mL de DMEM sem fenol vermelho às células de controle de autofluorescência.
   5. Incubar a placa de 6 poços por 30 min a 37 °C, 5% de CO₂.
      NOTA: A sonda é sensível à luz. Descarte toda a solução de sonda nãousada.

4. Preparação celular para citometria de fluxo

1. Depois das 6h, mantenha a placa no gelo. A partir deste passo, não é necessário usar a técnica asséptica adequada e trabalhar em uma coifa de fluxo laminar.
2. Lave as células 3x com 2 mL de PBS frio por poço. Adicione 0,5 mL de tampão de desprendimento a frio a cada poço. Colher as células gentilmente tubos para cima e para baixo usando uma pipeta P1000.
3. Colecione-os em tubos rotulados de 1,5 mL e centrífuga a 600 x g por 5 min a 4 °C.
   NOTA: Ao colher as células, evite a formação de bolhas definindo a pipeta P1000 para 0,4 mL. Deste passo em diante, trabalhe rápido.
4. Quando a centrifugação terminar, coloque tubos de 1,5 mL rotulados com as células no gelo. Descarte o supernatante cuidadosamente e dissociar suavemente a pelota da célula com toques.
5. Adicione 1 mL de tampão FACS a cada tubo de 1,5 mL rotulado para lavar as células. Se necessário, use um vórtice em sua intensidade mais baixa para a dissociação completa da pelota celular. Centrifuá-los a 600 x g por 5 min a 4 °C. Repita estes passos 2x mais. (Realizar três lavagens no total).
6. Quando a última lavagem terminar, rotule tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (tubos de citometria de fluxo) para todas as condições experimentais (ver passo 2.).
7. Quando a centrifugação termina, resuspensa as pelotas de célula em 200 μL de tampão FACS. Dissocia suavemente a pelota em cada tubo de 1,5 mL usando um vórtice. Transfira para tubos de fundo redondo de 5 mL rotulados. Mantenha os tubos no gelo até que sejam analisados no citómetro de fluxo.

5. Aquisição de dados em um citômetro de fluxo

1. Usando o software de citometria de fluxo, crie um novo experimento. Para fazer isso, na barra menu vá para Experimentar e clique em Novo Experimento (Ctrl+E).
2. Além disso, na barra menu, vá para Exibir e clique nas seguintes opções: Barra de ferramentas, barra de status, navegador, citómetro, inspetor, planilha, painel de aquisição e editor biexponencial para ver essas janelas no espaço de trabalho.
3. À esquerda do software, clique no Specimen_001 . Isso abrirá uma lista de tubos (Tube_001, Tube_002, etc.). Para rotular os tubos para os controles e diferentes condições experimentais, clique duas vezes Tube_001, Tube_002, etc. e renomeie-os (ver passo 2.).
4. Selecione os canais/parâmetros a serem analisados (FSC, SSC, FITC e APC ou qualquer outro fluorocromático para ver o quadrante) no primeiro tubo a partir das configurações do Cítmetro do experimento.
5. Clique no ícone De ponteiro do tubo atual para selecionar o tubo, e o ícone será para verde. Coloque o tubo de "controle de autofluorescência" no braço aspirador, movendo a base cuidadosamente apenas para a esquerda.
   1. Para executar a amostra de "controle de autofluorescência", vá para a janela Painel de Aquisição e clique em Adquirir dados. Abra um gráfico de pontos para FSC (no eixo x) versus SSC (no eixo y).
   2. Ajuste a tensão de dispersão para a frente e para o lado rapidamente, a fim de garantir que os eventos apareçam no gráfico. Na janela Painel de Aquisição clique em Parar de adquirir. Neste experimento, foram utilizadas as seguintes configurações de tensão: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
6. Para definir a tensão FITC, execute o "controle positivo (células tratadas com um indutor ROS, A ou B)". Ajuste a tensão para que todos os eventos apareçam em um histograma de FITC. Neste caso, use uma tensão de 280 V. Na janela Painel de Aquisição, clique em Parar de Adquirir.
7. Coloque novamente o tubo de "controle de autofluorescência" no braço aspirador. Na janela Painel de Aquisição, clique em Adquirir dados e, em seguida, regise dados e selecione as condições de parada desejadas (por exemplo, 50.000 eventos). Desenhe um portão ao redor das células de interesse, excluindo células mortas e detritos.
   NOTA: Estes são observados como eventos muito menores do que a população celular principal e aparecem no lado inferior esquerdo da trama.
8. Quando a aquisição terminar, remova o tubo do braço do aspirador. O equipamento vai se lavar sozinho. Na janela Painel de Aquisição, clique no Next Tube e execute o controle Basal (células não estimuladas)." Clique em Adquirir Dados e, em seguida, registo dados.
   1. A partir do portão inicial (portão que exclui as células mortas e detritos), crie outro gráfico de ponto de FITC (no eixo x) versus APC (no eixo y). Desenhe um portão do quadrante e ajuste as coordenadas para visualizar os eventos no quadrante inferior esquerdo do gráfico FITC versus APC.
9. Para registrar as próximas amostras, remova o tubo e clique no tubo Next > adquira dados > dados de registro.
   NOTA: O citómetro de fluxo utilizado aqui (ver Tabela de Materiais) registra um máximo de 1 x 10⁶ eventos por tubo.
10. Quando a gravação de todos os tubos terminar, exporte os dados para o disco D. Para fazer isso clique em Arquivo > Exportar > arquivos FCS > Selecionar versão 3.0 ou 3.1.
    NOTA: Embora a aquisição de dados usando um software (ver Tabela de Materiais) seja descrita detalhadamente neste protocolo, qualquer outro software de citometria de fluxo pode ser usado. Os parâmetros de aquisição (FSC, SSC e FITC) podem ser definidos da mesma forma para obter os resultados.

6. Análise dos dados adquiridos

1. Abra o software e adicione as amostras usando o botão adicionar amostras de ação; ele está localizado na barra de tarefas ou na banda Navigate.
   1. Clique em Adicionar amostras.
   2. Usando o navegador de arquivos, navegue até a pasta Experimental.
   3. Selecione a pasta Experimental e clique em Escolher.
      NOTA: Os arquivos de amostra carregam como parte do grupo "Todas as amostras" no espaço de trabalho.
2. Clique duas vezes na primeira amostra no espaço de trabalho: Controle de autofluorescência.
   NOTA: Esta ação abre um gráfico de plotagem de janelas ao longo de dispersão para a frente (FSC-A no eixo x) versus dispersão lateral (SSC-A no eixo y).
3. Desenhe um portão de polígono para isolar as células de interesse, excluindo células mortas e detritos.
   1. Clique na ferramenta Polygon Gate .
   2. Clique dentro do enredo para compor o portão do polígono. Faça quantos lados precisar.
   3. Clique duas vezes no último ponto para fechar o polígono e criar o portão desejado.
   4. Forneça um nome para o portão, como "células MIO-M1", e pressione OK.
      NOTA: Uma nova janela de gráficos aparece exibindo apenas os eventos MIO-M1 sem células mortas e detritos.
   5. Repita com todas as amostras para analisar.
4. Mude o enredo para um histograma. Para isso, clique no rótulo do parâmetro do eixo X e selecione FITC-A. Clique no rótulo do parâmetro do eixo Y e selecione Histograma. Isso muda o enredo para um histograma unidimensional.
5. Adicione estatísticas usando a janela adicionar estatística.
   1. Abaixo do gráfico histograma, clique em Adicionar estatísticas. O programa abrirá uma nova janela estatística.
   2. À esquerda da nova janela selecione as estatísticas Média Geométrica.
   3. Selecione as células POPULAÇÃO MIO-M 1.
   4. Na lista de parâmetros disponíveis, selecione FIT-C.
   5. Clique no botão Adicionar para aplicá-los à análise.
      NOTA: Isso cria as novas estatísticas "média geométrica: FITC" na árvore de gating de amostra, e seus valores são exibidos em seu espaço de trabalho.
6. Coloque esses valores geométricos médios em um programa estatístico e analise.
7. Clique no ícone L para abrir o Editor de layout; este ícone está na guia Menu na área de trabalho. Posicione a janela Espaço de Trabalho e o Editor de Layout lado a lado.
   NOTA: O Editor de layout é uma janela de espaço de trabalho separada com ferramentas para exibir várias parcelas e estatísticas de gráficos em um simples relatório gráfico. Isso pode ser exportado com o arquivo de extensão que você preferir, como PDF ou JPG, entre outros.
   1. Da árvore de gating de uma amostra na janela Workspace, arraste a população de células MIO-M 1 para o Editor de Layout.
   2. Certifique-se de que um gráfico histograma contendo os eventos no portão seja exibido no Editor de Layout. Informações básicas adicionais serão detalhadas em uma caixa de texto abaixo.
   3. Arraste todas as amostras para compará-las no mesmo gráfico. O programa vai sobrepor-los.
   4. Clique com o botão direito do mouse no gráfico do histograma e selecione Propriedades. O programa abrirá uma nova janela de definição de gráfico. Esta janela tem quatro guias (Anotar, Fontes, Lenda e Especificar). Clique na guia Especificar e altere o eixo y de Auto para Modal. Clique em Aplicar.
   5. Clique com o botão direito do mouse na amostra e altere coloração, estilo de linha, peso da linha, etc. para personalizar o gráfico.
   6. Para exportar a imagem, clique na guia Arquivo e, imediatamente após, selecione Salvar imagem na faixa Documento. Escolha o tipo preferido de arquivo de imagem (por exemplo, PDF).
      NOTA: Uma caixa de diálogo de salvamento é aberta, solicitando que você selecione um local de salvamento. Clique em Salvar.
8. Salve a análise como um arquivo de espaço de trabalho (.wsp).
   1. No canto superior esquerdo, clique no ícone análise de citometria e selecione Salvar Como.
   2. Escolha Salvar como Espaço de Trabalho (WSP) para salvar o documento com dados e análises.
   3. Digite um nome para o arquivo da área de trabalho.
   4. Clique em Salvar.

Resultados

Como descrito na seção de protocolo, mostramos dados representativos e quantitativos demonstrando a detecção de citometria de fluxo da produção de ROS com a sonda de fluorescência DCFH-DA de células MIO-M1 estimuladas com indutor ROS, A ou B. Como esperado, observamos alterações na fluorescência fitc em células não estimuladas acima dos níveis de autofluorescência (Figura 1A, compare "controle basal" vs. "controle de autofluorescência", gráfico de gráficos de pontos). Isso ...

Discussão

Várias condições patológicas, como câncer, doenças inflamatórias, isquemia/reperfusão, doença isquêmica do coração, diabetes e retinopatias, e também situações fisiológicas como o envelhecimento, levam à superprodução ROS 6,7,8,9,10,11. Portanto, a detecção, a medição e a compreensão do caminho envolvi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-DCFH-DA	Sigma	35845-1G
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco by life technologies	15630-080
BD FACSCanto II flow cytometer	BD Biosciences	FACSCanto
BD FACSDiva software	BD Biosciences
Cell Culture Dishes 100x20 mm	Cell Star- Greiner Bio-One	664 160
Centrifuge	Thermo	Sorvall legend micro 17 R
Centrifuge Tubes (15 ml)	BIOFIL	CFT011150
Centrifuge Tubes (50 ml)	BIOFIL	CFT011500
Cryovial	CRYO.S - Greiner Bio-One	126263
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387520-1KG
Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate	Merck	106575
DMEM without phenol red	Gibco by life technologies	31053-028
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco by life technologies	11995065
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate	Merck	324503
Fetal Bovine Serum	Internegocios
FlowJo v10 Software	BD Biosciences
Glucose	Merck	108337
hemocytometer, Neubauer chamber	BOECO,Germany
Laminar flow hood	ESCO	AC2-6E8
L-glutamine (GlutaMAX)	Gibco by life technologies	A12860-01
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
Penicillin/Streptomycin	Gibco by life technologies	15140-122
Potassium Chloride	Merck	104936
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	4878
Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)	Falcon - Corning	BD-352008
Sodium Azide	Merck	822335
Sodium Chloride	Merck	106404
Sodium Hydroxide	Merck	106462
SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml	Tarson	500010-N
Tissue Culture Plate 6 well	BIOFIL	TCP011006
Trypan Blue	Merck	111732
Trypsin-EDTA 0.5% 10X	Gibco by life technologies	15400-054
Vortex Mixer	Labnet International, Inc.