Geração e Expansão das Linhas tumorais primárias e malignas do mesotelioma

Resumo

O objetivo deste artigo método é demonstrar uma metodologia robusta e reprodutível para o enriquecimento, geração e expansão das linhas celulares tumorais primárias a partir de mesotelioma pleural ressecado cirurgicamente.

Resumo

As metodologias atuais para a expansão das linhas primárias de células tumorais de tipos raros de tumores estão em falta. Este protocolo descreve métodos para expandir as células tumorais primárias a partir de mesotelioma pleural ressecado cirurgicamente e maligno (MPM), fornecendo uma visão geral completa do processo desde a digestão até o enriquecimento, expansão, criopreservação e caracterização fenotípica. Além disso, este protocolo introduz conceitos para a geração de tumores que podem ser úteis para vários tipos de tumores, como a trippsinização diferencial e o impacto dos métodos de dissociação na detecção de marcadores de superfície celular para caracterização fenotípica. A maior limitação deste estudo é a seleção de células tumorais que se expandirão em um sistema de cultura bidimensional (2D). Variações neste protocolo, incluindo sistemas de cultura tridimensional (3D), suplementos de mídia, revestimento de placas para melhorar a adesão e métodos alternativos de desagregação, poderiam melhorar essa técnica e a taxa de sucesso geral do estabelecimento de uma linha de tumor. No geral, este protocolo fornece um método base para estabelecer e caracterizar células tumorais a partir deste tumor raro.

Introdução

O mesotelioma pleural maligno (MPM) é um tumor raro altamente associado à exposição ao amianto. Embora as abordagens baseadas em imunoterapia tenham mostrado resultados encorajadores, há uma escassez de opções de tratamento disponíveis para os pacientes que desenvolvem essa doença, e a taxa geral de sobrevivência de 5 anos é baixa^{de 1,2}. Esforços estão em andamento em várias instituições para entender melhor essa doença e identificar novos alvos terapêuticos que possam melhorar os resultados dos pacientes. Embora existam vários modelos de camundongos de mesotelioma, o acesso às células tumorais primárias do mesotelioma é mais limitado³. A expansão in vitro das células tumorais primárias do mesotelioma forneceria um valioso sistema modelo que pode ser utilizado para estudar diretamente as células tumorais e sua interação com células imunes autólogas, como linfócitos infiltrados em tumores. Embora tenha havido relatos sobre a expansão das linhas primárias de células tumorais de mesotelioma, estas são poucas e não fornecem um procedimento padrão de operação (SOP) detalhado. Além disso, poucas linhas de celular estão disponíveis a partir de fontes comerciais, como a American Type Culture Collection (ATCC). Embora a disponibilidade de linhas tumorais primárias seja limitada, foi demonstrado que as células tumorais podem ser expandidas a partir de derrames pleurais e diretamente do tecido tumoral ^4,5. Além disso, linhas de células tumorais expandidas têm sido demonstradas para preservar o perfil molecular do tumor original ^4,5,6.

Nosso laboratório está estudando o microambiente tumor-imune do MPM e desenvolveu um método para expandir as linhas primárias de células tumorais mpm a partir de casos ressecados cirurgicamente. Este método é adaptado de nossa experiência no estabelecimento de linhas celulares tumorais de melanoma metastático primário. O objetivo deste trabalho é fornecer uma abordagem detalhada e prática para a expansão da linha de tumores mesotelioma primário usando um sistema modelo 2D e perfil fenotípico subsequente. Dado o sucesso recente das estratégias de bloqueio de checkpoint visando CTLA4 e PD-1 na configuração de primeira linha², a capacidade de gerar muitas linhas tumorais primárias poderia promover a compreensão de ambos os mecanismos intrínsecos de resistência tumorais, bem como fornecer um importante sistema de modelo para avaliar o reconhecimento de células T, aprofundando assim nossa compreensão da resposta imune no MPM.

A maior limitação deste protocolo é que cada tumor contém um microambiente diferente, e há um alto grau de variabilidade do sucesso de expansão. Além disso, este método seleciona para células tumorais que podem se expandir em um sistema de cultura 2D. Outros métodos que envolvem a produção de uma cultura esferoide ou organoide 3D poderiam fornecer uma abordagem alternativa que pode permitir uma maior taxa de sucesso de expansão ou resultar na capacidade de derivar linhas celulares que são incapazes de se expandir em um sistema 2D tradicional. Tais culturas 3D têm sido demonstradas como úteis para a geração de tipos de tumores que são difíceis de expandir, por exemplo, o câncer de pâncreas⁷.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institution Review Board (IRB) do Centro de Câncer Anderson da Universidade do Texas MD Anderson. Isso diz respeito aos tumores mpm ressecção cirúrgica e padrão removidos após o consentimento informado.

1. Preparação de mídia de digestão de tumores e outras mídias associadas

1. Para preparar a mídia de digestão tumoral, adicione 5 mL de 100% Pen/Strep (Penicillin/Streptomycin) a 500 mL de estéril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio em uma capa de fluxo laminar.
   1. Transfira o filtro estéril médio para 500 mL, 0,22 μm poliethersulfone (PES) para filtragem a vácuo.
      NOTA: As etapas de filtragem e aspiração devem ser realizadas com uma pressão padrão de vácuo de 75-150 torr.
   2. Rotule e atue o meio de digestão do tumor e armazene-o a 4 °C.
      NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.
2. Para preparar o coquetel enzimático de digestão do tumor, adicionar 2,5 mL de 3% de colagenase tipo 1, 1 mL de 1,5 mg/mL de higina, 20 μL de 250.000 unidades/mL DNAse 1 a 16,5 mL de meio de digestão em um tubo cônico de 50 mL em um capô de fluxo laminar a 1.
   NOTA: O volume total do coquetel enzimático de digestão do tumor é de 20 mL; no entanto, apenas 10 mL é necessário por amostra de tumor. Como tal, o coquetel restante pode ser armazenado a -20 °C até que seja necessário. Não recongele alíquotas.
3. Para preparar o meio tumoral completo, adicione 5 mL de 100% Pen/Strep e 50 mL de soro bovino fetal (FBS) a 500 mL de RPMI 1640 estéril em uma capa de fluxo laminar.
   1. Transfira o médio para um filtro estéril pes de 500 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.
   2. Rotule e data o meio tumor completo e armazene-o a 4 °C.
      NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.
4. Para preparar o meio de soro reduzido para a fome, adicione 5 mL de 100% De Caneta/Estreptococos e 5 mL de FBS a 500 mL de RPMI 1640 estéril em uma capa de fluxo laminar.
   1. Transfira o médio para um filtro estéril pes de 500 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.
   2. Rotule e data o meio de soro reduzido e armazene-o a 4 °C.
      NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.
5. Para preparar o meio de congelamento, adicione 5 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO) a 45 mL de FBS em uma capa de fluxo laminar.
   1. Transfira o médio para um filtro estéril pes de 50 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.
   2. Rotule e data cinco tubos cônicos de 15 mL.
   3. Transfira 10 mL de meio de congelamento para cada tubo e armazene os tubos a -20 °C.
6. Para preparar o meio sem antibióticos para o teste de mycoplasma, adicione 50 mL de FBS a 500 mL de RPMI 1640 estéril em uma capa de fluxo laminar.
   1. Transfira o médio para um filtro estéril pes de 50 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.
   2. Rotule e data o meio sem antibióticos e armazene-o a 4 °C.
      NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.
7. Para preparar o tampão de triagem celular ativado pela fluorescência (FACS) para análise fenotípica, adicione 16,6 mL de albumina de soro bovino estéril a 500 mL de salina estéril tamponada de fosfato (PBS) em um capô de fluxo laminar.
   1. Rotule e data o buffer FACS e armazene-o a 4 °C.
      NOTA: O tampão FACS não requer esterilização do filtro, desde que ambos os componentes estejam armazenados estéreis. O buffer FACS pode ser armazenado antes da abertura por 6 meses a 4 °C.

2. Digestão do tecido tumoral

1. Transfira 10 mL de coquetel enzimático de digestão tumoral da etapa 1.2 para um tubo de dissociação.
2. Transfira o pedaço do tecido tumoral para uma tampa de placa estéril de 6 poços usando um bisturi estéril.
   NOTA: A quantidade de meio transferido com o tecido tumoral é suficiente para o processamento.
   1. Remova todos os tecidos gordurosos, tecido necrosado e/ou coágulos sanguíneos usando um novo bisturi estéril e fórceps.
      NOTA: O tecido gorduroso é normalmente amarelado na aparência e semisólida. O tecido necrosado é mais escuro que o tecido circundante na aparência e muito macio; tanto o tecido gorduroso quanto o necrosado se desfazão facilmente. O tecido sangrento parece vermelho brilhante e pode liberar sangue para o meio quando manipulado. Uma vez removido, o tecido tumoral resultante deve manter a forma e ser pálido ou rosa, dependendo do tipo de tecido.
   2. Corte todo o tecido tumoral em 1 mm³ pequenos fragmentos. Para garantir que o tecido não seque, adicione 500 μL de solução de sal balanceado estéril de 1x Hank 's (HBSS) ao tecido tumoral.
3. Transfira fragmentos tumorais para o tubo de dissociação contendo 10 mL de coquetel enzimático de digestão tumoral (passo 2.1). Feche o tubo firmemente, coloque-o lado da tampa para baixo sobre o dissociador de tecido, e adicione o aparelho de aquecedor aplicando-o como uma manga sobre o tubo de dissociação e pressionando para clicar no lugar.
   NOTA: A capacidade máxima para cada tubo é de 4 g de tumor e volume de 10 mL.
4. Selecione a configuração pré-programada no 37C_h_TDK_1 dissociador. Verifique o status após 10 minutos para garantir que não haja erro de entupimento conforme indicado pela luz vermelha piscando.
   NOTA: Este programa processa a 1.865 rpm por 1h com temperatura em 37 °C.
   NOTA: Se ocorrer entupimento, remova o tubo de dissociação e gire-o manualmente para desalojar qualquer tecido preso na tampa; em seguida, substitua o tubo sobre o dissociador e retome o programa.
5. Após a digestão de 1 h, remova o tubo de dissociação e coloque-o em uma coifa de fluxo laminar. Filtre o tumor digerido colocando um coador de células de 70 μm em cima de um tubo cônico de 50 mL e tubos do tumor digerido usando uma pipeta de 10 mL no filtro. Se o filtro obstruír, mude para um novo filtro.
   1. Enxágüe o tubo de dissociação com 10 mL de mídia de digestão de tumores frescos e passe a lavagem através do filtro.
   2. Remova o filtro de 70 μm e descarte-o.
   3. Leve o volume total para 40 mL com meio de digestão tumoral.
6. Centrifugar a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
7. Usando uma pipeta aspirando de 2 mL presa a uma fonte de vácuo, aspire o supernatante sem perturbar a pelota, e resuspenque as células usando 10 mL de meio tumor completo estéril.
8. Repita o passo 2.6.
9. Aspire o supernante como descrito na etapa 2.7. Resuspenque as células em 3 mL de meio tumor completo estéril e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa estéril de 6 poços.
10. Mantenha a placa em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
11. Após 24 horas, transfira o meio usado do tumor digerido em bem 1 para um novo poço (bem 2) na mesma placa de 6-bem. Adicione 3 mL de tumor completo estéril ao poço 1.
12. Transfira o meio usado dos poços 1 e 2 e combine em bem 3 na mesma placa de 6-bem 24 horas após a etapa 2.11. Adicione 3 mL de meio tumor completo estéril nos poços 1 e 2.
13. Aspire o médio de todos os 3 poços e pipeta 3 mL de meio tumor completo em cada poço 48 h após a etapa 2.12.

3. Geração de linha celular tumoral primária

1. Usando um microscópio de fase invertida, determine a porcentagem de contaminação do fibroblasto na cultura de passagem precoce.
   NOTA: Os fibroblastos são geralmente longos e irregulares e têm uma membrana celular mal definida. Eles parecem magros ou planos em uma escala Z.
   1. Se a contaminação do fibroblasto for superior a 20% das células da cultura de passagem precoce, continue a cultivar após substituir o meio completo por meio de soro reduzido.
   2. Repita a substituição com meio de soro reduzido na etapa 3.1.1 duas vezes por semana durante 3-4 semanas.
   3. Quando a cultura atingir 80% de confluência, passagem as células dividindo 50:50 em 2 novos poços de uma placa de 6 poços. Continue a passar 50:50 em mídia de soro reduzido uma vez que as células atingem 80% de confluência.
   4. Repita o passo 3.1.3 por até 4 semanas, passando em frascos de cultura maiores conforme necessário, dividindo 50:50 quando a cultura atinge 80% de confluência. Se a população de fibroblasto não for reduzida a 10% ou menos, continue a etapa 3.2 para tentar o método diferenciado de trippsinização para remover a contaminação do fibroblasto. Caso contrário, prossiga para a etapa 3.3.
2. Para enriquecer para as células tumorais, enxágue suavemente o poço com 1x PBS para remover o soro médio contendo.
   1. Adicione trippsina da seguinte forma: 1 mL por bem se em uma placa de 6 poços, 2 mL para um frasco T25, 3 mL para um frasco T75.
   2. Coloque a placa de 6 poços ou o frasco em uma incubadora a 37 °C por 1 min. Remova a placa ou o frasco da incubadora e verifique a adesão das células usando um microscópio invertido. Se as células estiverem parcialmente levantando ou flutuando, remova suavemente as células suspensas e tente apenas. Coloque as células em um tubo cônico de 15 mL contendo um volume igual ou maior de meio tumor completo.
      NOTA: Esta coleta parcial de células baseadas em propriedades de adesão é a primeira de múltiplas frações.
   3. Repita as etapas 3.2.1 e 3.2.2 até que todas as células sejam levantadas, ou haja 4 frações removidas.
   4. Centrifugar todas as frações independentes a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
   5. Aspire o supernante conforme descrito na etapa 2.7, e resuspenque as células usando 5 mL de meio estéril e reduzido de soro.
   6. Coloque as células em um frasco T25 para cada fração e coloque os frascos em uma incubadora a 37 °C.
   7. Avalie a cultura após 48 horas para determinar qual fração é enriquecida para células tumorais versus fibroblastos. Descarte frascos ricos em fibroblastos. Se a contaminação do fibroblasto for <10%, continue a expansão em meio tumor completo e prossiga para a etapa 4. Se a contaminação do fibroblasto for de 10 a 30%, a repetição das etapas 3.1.2-3.1.4. Se a contaminação do fibroblasto for superior a 30%, repetimos as etapas 3.2-3.2.7.
3. Se poucos ou nenhum fibroblastos forem detectados dentro da cultura de passagem precoce, continuem a passar as células em meio tumor completo, dividindo 50:50 uma vez que as células são 80% confluentes em sua placa de 6 poços ou frasco.

4. Expansão da linha celular tumoral primária de passagem precoce

1. Uma vez que a cultura tumoral primária contenha 10% ou menos de contaminação por fibroblasto, aspire o meio e substitua-o por meio tumor completo estéril duas vezes por semana.
   NOTA: O volume médio ideal para um T25 é de 5 mL; T75 tem 12 mL; T150 é de 25 mL.
   1. Passar a cultura 50:50 em frascos maiores conforme necessário, uma vez que atinge 80% de confluência na placa ou frasco.
      NOTA: A cultura pode precisar ser passagem em uma proporção maior dependendo do seu crescimento. Ajuste para que a cultura atinja 80% de confluência a cada 3-5 dias.
2. Passagem até a cultura está na passagem 4 ou superior. Uma vez que a cultura é 80% confluente em um mínimo de dois frascos T75, continue a passo 5.

5. Caracterização e banco da linha celular tumoral primária estabelecida

1. Criopreserve um frasco T75 como um congelamento de passagem antecipada. Para o teste de mycoplasma dos frascos T75 restantes, continue a etapa 5.2.
   1. Para criopreservação de células de passagem precoce, descongele 1 tubo de meio de congelamento aliquoted preparado na etapa 1.5.
   2. Colete as células por experimentação, primeiro lavando a placa com 1x PBS como descrito na etapa 3.2 e adicionando trippsina conforme descrito na etapa 3.2.1.
   3. Coloque o frasco em uma incubadora a 37 °C por 3 min. Remova o frasco da incubadora e verifique a adesão das células usando um microscópio invertido. Se as células estiverem levantando ou flutuando, remova suavemente as células suspensas e a trippsina. Coloque as células em um tubo cônico de 15 mL contendo um volume igual ou maior de meio tumor completo.
      NOTA: Se as células permanecerem aderentes após 3 min, coloque o frasco de volta na incubadora por mais 2 minutos.
   4. Misture bem o tubo por tubos suavemente e remova 20 μL para contar.
   5. Centrifugar o tubo a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
   6. Enquanto as células estão girando, conte usando um protocolo de contagem específico de laboratório, como azul trypan ou iodeto de acridina laranja/propídio (AO/PI).
   7. Resuspengue as células após a centrifugação em meio de congelamento com um mínimo de 2 × 10⁶ células/1 mL meio de congelamento.
   8. Transfira 1 mL da suspensão celular da etapa 5.1.7 para criovials de 1,5 mL pré-rotulados.
   9. Coloque os criovias em uma câmara de congelamento de taxa controlada e transfira-as imediatamente para -80 °C.
   10. Armazene as células a -80 °C por até 1 semana antes de transferi-las para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
2. Divida um frasco T75 às 50:50 para o teste de mycoplasma. Alterar o meio médio para o meio sem antibióticos preparado na etapa 1.6.
   1. Depois de 72 h, descongele o reagente de detecção de mycoplasma, substrato e controles em temperatura ambiente por 15 minutos antes do teste.
   2. Colete 1 mL do supernaente de cada cultura a ser testado e coloque-o em um tubo cônico de 15 mL.
   3. Pelota qualquer célula suspensa por centrifugação do supernante a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
   4. Carregue 100 μL de supernacantes de amostra e controles em uma placa branca de 96 poços. Adicione 100 μL de reagente de detecção de mycoplasma a cada amostra e controle.
   5. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
   6. Coloque a placa em um leitor de placas e leia a luminescência (Leitura A, ou seja, primeira leitura).
      NOTA: O protocolo do fabricante do kit mycoplasma indica manter as configurações padrão nos leitores de placas multifuncionais. A leitura é definida no ponto final da Luminescência com um tempo de integração de 1 s e ganho de 135. O leitor de placas usa uma rotina de escala automática para otimizar o sinal de ganho para cada experimento. O tempo de integração de 1 s é padrão padrão. Ambas as configurações são usadas para ajustar a intensidade do sinal luminescente interpretado pelo leitor de placas e podem precisar ser ajustadas dependendo do leitor de placas individuais.
   7. Remova a placa do leitor de placas e adicione 100 μL do substrato de detecção de mycoplasma a cada amostra e aos controles.
   8. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.
   9. Coloque a placa no leitor de placas e leia a luminescência (Leitura B, ou seja, segunda Leitura).
   10. Para determinar a positividade do micoplasma, determine a razão da leitura B com a leitura A.
       NOTA: As razões de positividade do mycoplasma são descritas no protocolo do fabricante do kit mycoplasma. As leituras A e B são adquiridas com as mesmas configurações e simplesmente refletem a ordem de leitura.
       1. Considere uma razão < 1 para ser mycoplasma negativo.
       2. Considere uma razão de 1-1.2 para ser inconclusiva e repetir o passo 5.2.
       3. Considere uma razão > 1,2 para ser mycoplasma-positiva e monitorar essa cultura; acabar com a cultura, se necessário.
3. Caracterização da citometria de fluxo das células tumorais mycoplasma-negativa
   1. Desalojar as células tumorais usando tampão de dissociação celular.
   2. Conte as células e resuspenda as células a 1 × 10⁶/mL no buffer FACS a partir da etapa 1.7.
   3. Remova 100 μL de suspensão celular em tubos individuais para coloração superficial.
   4. Centrifugar a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
   5. Aspire os receptores supernacantantes e bloqueiem os receptores Fc incubando as células em 500 μL de soro de cabra de 5% no tampão FACS à temperatura ambiente por 10 minutos.
   6. Adicione 2 mL de tampão FACS e centrifule a suspensão a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
   7. Aspire o supernasciente e adicione a mistura de manchas de superfície de anticorpos (Tabela 1) e tampão FACS de modo que o volume final seja de 100 μL. Cubra as amostras e manche-as no gelo por 30 minutos.
   8. Repita o passo 5.3.6.
   9. Aspire o supernasal e fixe as células resuscupando em 200 μL de 1% de paraformaldeído (PFA) mais 0,25% EtOH. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos com as amostras protegidas da luz.
   10. Repita o passo 5.3.6. Resuspende as células em 200 μL de tampão FACS para aquisição usando um citômetro de fluxo apropriado.
       NOTA: Espera-se que as células tumorais de mesotelioma sejam positivas para a mesotelina e a N-cadherina. Alguns também podem expressar CD90.
4. Expanda em meio e banco tumor completo, conforme descrito nas etapas 4.1 e 5.1, respectivamente.

Resultados

Para determinar a contaminação do fibroblasto das culturas de passagem precoce, as células são avaliadas usando um microscópio de fase invertida para identificar a frequência de fibroblastos em relação às outras células aderentes presentes. A Figura 1 mostra exemplos de aumento da contaminação do fibroblasto de 80% (Figura 1A), 50% (Figura 1B) e 30% (Figura 1C), em comparação com uma cultu...

Discussão

Embora este protocolo seja simples, existem alguns passos críticos que devem ser seguidos de perto. O congelamento da passagem precoce é importante para preservar a capacidade de repetir o processo de enriquecimento tumoral-células, se inicialmente mal sucedido. A capacidade de avaliar a contaminação fibroblástica pelo olho para decidir a técnica correta de divisão e fome da mídia é vital para evitar o crescimento excessivo do fibroblasto na cultura. Além disso, o método diferencial de trippsinização requer...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML