Isolamento e Caracterização das Células Imunes de Plexos Choroides de Camundongos Micro-dissecados

Resumo

Este estudo utiliza citometria de fluxo e duas estratégias diferentes de gating em camundongos isolados com plexos cerebrais coroides; este protocolo identifica os principais subconjuntos de células imunes que povoam essa estrutura cerebral.

Resumo

O cérebro não é mais considerado como um órgão funcionando isoladamente; acumular evidências sugere que mudanças no sistema imunológico periférico podem moldar indiretamente a função cerebral. Na interface entre o cérebro e a circulação sistêmica, os plexos coroides (CP), que constituem a barreira do fluido sangue-cefalorraquidiano, têm sido destacados como um local-chave da comunicação periferia-cérebro. Cp produz o fluido cefalorraquidiano, fatores neurotróficos e moléculas de sinalização que podem moldar a homeostase cerebral. Cp também são um nicho imunológico ativo. Em contraste com o parênquimo cerebral, que é povoado principalmente por microglia em condições fisiológicas, a heterogeneidade das células imunes CP recapitula a diversidade encontrada em outros órgãos periféricos. A diversidade e a atividade das células imunes CP mudam com o envelhecimento, o estresse e a doença e modulam a atividade do epitélio CP, moldando indiretamente a função cerebral. O objetivo deste protocolo é isolar o CP murine e identificar cerca de 90% dos principais subconjuntos imunológicos que os povoam. Este método é uma ferramenta para caracterizar células imunes CP e entender sua função na orquestração da comunicação periférica-cérebro. O protocolo proposto pode ajudar a decifrar como as células imunes cp modulam indiretamente a função cerebral na saúde e em várias condições da doença.

Introdução

Desde a descoberta da barreira hematoencefálica por Paul Erhlich no final ^{do século XIX}, o cérebro tem sido considerado virtualmente separado dos outros órgãos e da corrente sanguínea. No entanto, nesta última década, viu o surgimento do conceito de que a função cerebral é moldada por vários fatores biológicos, como microbiota intestinal e células imunes sistêmicas e sinais1,2,3,4. Paralelamente, outras fronteiras cerebrais, como meninges e plexos coroides (CP) foram identificadas como interfaces de conversa transversal-imuno-cérebro ativa em vez de tecidos de barreira inerte5,6,7,8.

O PC constitui a barreira do fluido sangue-cefalorraquidiano, uma das fronteiras que separam o cérebro e a periferia. Eles estão localizados em cada um dos quatro ventrículos do cérebro, ou seja, o terceiro, o quarto, e ambos os ventrículos laterais, e são adjacentes a áreas envolvidas na neurogênese, como a zona subventricular e a zona subgranular do ^hipocampo3. Estruturalmente, o PC é composto por uma rede de capilares de sangue fenestrados fechados por uma monocamada de células epiteliais, que são interligadas por junções apertadas e aderentes9,10. Os principais papéis fisiológicos do epitélio CP envolvem a produção de fluido cefalorraquidiano, que libera o cérebro de metabólitos de resíduos e agregados proteicos, e a produção e passagem controlada sangue-cérebro de várias moléculas de sinalização, incluindo hormônios e fatores neurotróficos11,12,13. Moléculas secretadas da CP moldam a atividade do cérebro, ou seja, modulando a neurogênese e a função microglial14,15,16,17,18,19, o que torna o CP crucial para a homeostase cerebral. CP também se engaja em várias atividades imunológicas; enquanto o principal tipo de célula imune no parenchyma cerebral em condições não patológicas é a microglia, a diversidade de populações de células imunes CP é tão ampla quanto em órgãos periféricos3,7, sugerindo que vários canais de regulação e sinalização imunológica estão em ação no CP.

O espaço entre as células endotelial e epitelial, o estroma CP, é povoado principalmente por macrófagos associados à borda (BAM), que expressam citocinas pró-inflamatórias e moléculas relacionadas à apresentação de antígenos em resposta a sinais inflamatórios3. Outro subtipo de macrófagos, as células epiplexas de Kolmer, estão presentes na superfície apical do epitélio ^CP20. O estroma CP também é um nicho para células dendríticas, células B, células de mastro, basófilos, neutrófilos, células linfoides inatas e células T que são principalmente células T efeito ou memória capazes de reconhecer antígenos do sistema nervoso central7,21,22,23,24. Além disso, a composição e a atividade das populações de células imunes no PC alteram a perturbação sistêmica ou cerebral, por exemplo, durante o envelhecimento10,14,15,21,25, microbiota ^{perturbação7}, ^stress26 e ^doença27,28. Notavelmente, essas alterações foram sugeridas para moldar indiretamente a função cerebral, ou seja, uma mudança das células T CP CD4⁺ para a inflamação Th2 ocorre no envelhecimento cerebral e desencadeia sinalização imune do PC que pode moldar o declínio cognitivo associado ao envelhecimento14,15,21,25,29 . Iluminar as propriedades das células imunes cp seria, portanto, crucial para entender melhor sua função regulatória na fisiologia e secreção do epitélio CP e, assim, decifrar seu impacto indireto na função cerebral em condições saudáveis e de doenças.

CP são pequenas estruturas que contêm apenas algumas células imunes. Seu isolamento requer microdisseção após uma etapa preliminar de perfusão; células imunes na corrente sanguínea constituiriam contaminantes graves. Este protocolo visa caracterizar os subconjuntos de células mielóide e T do CP usando citometria de fluxo. Este método identifica cerca de 90% das populações de células imunes que compõem o PC do camundongo sob condições não inflamatórias, de acordo com trabalhos recentemente publicados usando outros métodos para dissecar a heterogeneidade cp imune7,10,28. Este protocolo poderia ser aplicado para caracterizar alterações no compartimento de células imunes cp com doenças e outros paradigmas experimentais in vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos acordados com as diretrizes da Comissão Europeia para o manejo de animais de laboratório, diretiva 86/609/CEE. Eles foram aprovados pelos comitês de ética nº 59, pelo CETEA/CEEA nº 089, sob o número dap210067 e APAFIS nº 32382-2021070917055505 v1.

1. Preparação dos materiais

1. Armazene todos os anticorpos (Tabela de Materiais) a 4 °C, protegidos contra exposição à luz.
2. Solução de estoque DAPI (1 mg/mL): Resuspend o pó em PBS^-/- (Tabela de Materiais), aliquot e armazenar a -20 °C.
3. Solução de trabalho DAPI (0,1 mg/mL): Diluir a solução de estoque DAPI com PBS^-/- a uma razão de 1:10.
4. Tampão de células ativados por magnético (MACS): Prepare 2 mM de diamina de diamiácetico (EDTA) e albumina de soro bovino de 0,5% (BSA) (Tabela de Materiais) em PBS^-/-.
5. Solução de estoque de colagenase IV (20 U/μL): Resuspend o pó em PBS^+/+ (Tabela de Materiais), aliquot e armazenar a -20 °C.
   NOTA: A Colagemnase IV requer que o _MgCl2 esteja totalmente ativo; não congele a solução de Colagenase IV.
6. Solução anestésica-analgésico: Misture 150 μL de cetamina (150 mg/kg), 25 μl de xilazina (5 mg/kg) e 330 μl de buprecare (0,1 mg/kg) em 1 mL de PBS^-/-.
   NOTA: Prepare a solução anestésica-analgésico extemporâneamente e não a mantenha por mais de um dia.
7. Solução de heparina (100 U/mL): Resuspend o pó em PBS^-/-.
8. Prepare o sistema de inset de infusão que conecta um tubo a um decantador Erlenmeyer preenchido com PBS^-/-. Conecte uma agulha de 23 G à extremidade do tubo de infusão. Abra o inset de infusão e deixe o PBS funcionar até que não haja bolhas no tubo.
9. Prepare a lupa binóculo equipada com uma luz.

2. Habitação de ratos C57BL/6

1. Para a análise de células mielóides CP ou T, utilize quatro camundongos para cada um e acumule os quatro CP (dois de cada ventrículo lateral, o terceiro ventrículo e o quarto ventrículo CP; para oito ratos no total). Não reunir CP traz o risco de não detectar as raras populações imunes em CP devido à sua baixa abundância.
2. Deixe os ratos aclimatar por pelo menos 7 dias antes de qualquer experimentação. Mantenha os camundongos em condições livres de patógenos em temperatura e umidade constantes, em um ciclo claro/escuro de 12/12 h ou 14/10 h, com água e alimento padrão de pelotas ad libitum.

3. Perfusão da PBS e dissecção cerebral

1. Peso cada rato e injete 10 μL/g da solução de mistura anestésica-analgésico (passo 1.6) intraperitoneally.
2. Aguarde cerca de 30 min por analgesia eficiente (verifique a profundidade da anestesia beliscando os dígitos do mouse).
3. Posicione o mouse anestesiado de costas, no suporte de dissecção e tape as palmas das mãos ao suporte de dissecção.
4. Beliscando a pele do animal com fórceps e usando tesouras, abra o abdômen, o diafragma e o tórax para expor o coração.
   NOTA: Quando o tórax é aberto, o cérebro se torna anoxico. Deve-se prosseguir com precisão e rapidez através dos próximos passos da perfusão.
5. Injete 20 μL de solução de heparina U/mL diretamente no ventrículo esquerdo.
6. Com uma tesoura fina, faça uma incisão de pelo menos 3 mm no átrio direito para permitir que o sangue flua para fora do corpo.
7. Imediatamente depois, insira a agulha de 23 G colocada na extremidade do tubo de infusão através da ponta do ventrículo esquerdo.
8. Abra o sistema de infusão no máximo e espere por perfusão completa: Usando uma agulha de 23 G, a uma vazão de cerca de 6 mL/min, a perfusão é completa em 3 min.
   NOTA: A descoloração uniforme de órgãos como o fígado atesta a eficácia da perfusão.
9. Feche o sistema de infusão e remova a agulha do ventrículo cardíaco.
10. Remova a fita das palmas das mãos do rato. Coloque o mouse em uma posição ventral.
11. Beliscando a pele do animal com fórceps e usando tesouras, remova a pele da parte superior da cabeça dos olhos para as orelhas.
12. Com a ajuda da tesoura, corte o crânio primeiro entre os olhos e, em seguida, lateralmente de cada olho para a medula espinhal logo acima dos músculos do masseter. Para isso, use a extremidade da tesoura e proceda suavemente para evitar danificar o cérebro com a tesoura.
13. Abra o crânio com fórceps beliscando-o da extremidade entre os olhos.
14. Use uma tesoura para cortar a medula espinhal e extrair o cérebro com fórceps, colocando seus dois pontos no lado lateral do cérebro para incliná-lo e colocá-lo em uma placa de Petri cheia de PBS^+/+. O CP é imediatamente coletado.
    NOTA: Verifique se há descoloração do cérebro para verificar a eficácia da perfusão.

4. Dissecção do Plexo Choroide do cérebro

1. Posicione o lado dorsal do cérebro na placa de Petri e abaixo dos objetivos das lupas binóculos.
2. Com a ajuda de fórceps para manter o cérebro no lugar, insira as duas extremidades de outro fórceps através da linha média entre os hemisférios.
3. Use os fórceps para puxar o córtex com o caloso e o hipocampo longe do septo, expondo o ventrículo lateral e uma parte do terceiro ventrículo.
4. Identifique o CP lateral como um longo véu que reveste o ventrículo lateral que está em chamas em ambas as extremidades. Use as duas extremidades de um fórceps fino para pegar o CP lateral. Tenha cuidado para coletar a parte posterior triangular que pode ser escondida pela dobra posterior do hipocampo.
5. Puxe o córtex com o corpus caloso e hipocampo do hemisfério contralateral para longe do septo para expor todo o terceiro ventrículo e o ventrículo lateral oposto.
6. Colete com adoces finos o terceiro CP, que pode ser identificado como uma estrutura curta com aspecto de superfície granular.
7. Pegue o outro CP lateral.
8. Insira as duas extremidades de um fórceps entre o cerebelo e o cérebro médio. Retire o cerebelo dos pons e medulla para expor o quarto ventrículo.
9. Identifique o quarto CP como uma longa estrutura globular com um aspecto de superfície granular que reveste o quarto ventrículo da extremidade direita lateral para a extremidade esquerda entre o cerebelo e a medula. Pegue o quarto CP com fórceps finos.
   NOTA: O revestimento de fórceps de base de silano pode evitar a pegajosa do CP em fórceps.
10. Repita as etapas 3.1-4.9 para cada um dos outros sete ratos. Enquanto isso, o CP coletado pode ser mantido temporalmente em um tubo colocado no gelo.

5. Preparação de amostras para análise de citometria de fluxo

1. Encha o tubo contendo todos os CP dissecados a 750 μL de PBS^+/+.
   NOTA: A deposição de CP dissecada com fórceps finos no tubo traz um pequeno volume de PBS^+/+. Preencha o volume existente até 750 μL do que removê-lo e substituí-lo por 750 μL fresco de PBS^+/+ para evitar uma possível perda do tecido CP.
2. Adicione 15 μL de 20 soluções de estoque de Colagenase IV U/μL (ver passo 1.5) para uma concentração final de 400 U/mL.
   NOTA: O DNAse I (150 μg/mL) pode evitar o agrupamento excessivo de células.
3. Incubar CP com Colagenase IV a 37 °C sob agitação leve (300 RPM) por 45 min.
4. Pipeta suavemente para cima e para baixo cerca de 10 vezes para finalizar a dissociação do CP.
5. Encha o tubo CP a 1,5 mL com tampão MACS (ver passo da receita 1.4) para parar a atividade de colagemnase IV.
   NOTA: A atividade de Colagenase IV é interrompida a baixa temperatura e inibida pela albumina de soro.
6. Centrifugar as células a 500 x g, por 5 min, a 4 °C. Descarte o supernatante e lave as células com 1,5 mL de tampão MACS.
7. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min, a 4 °C. Descarte as células supernascidas e resuspend em 220 μL de buffer MACS.
8. Separe uma alíquota de 10 μL da suspensão celular para ser usada como controle não manchado (próximo passo 5.18).
9. Separe uma alíquota de 10 μL da suspensão celular a ser usada como controle mono-manchado da DAPI (próximo passo 5.12).
10. Pré-insuscie os 200 μL restantes com anticorpo de bloqueio CD16/CD32 anti-mouse (1:100) por 20 min, a 4 °C, para bloquear interações não específicas mediadas por Fc.
11. Divida as células em dois tubos de 100 μL (um para análise de células mielóides, o outro para análise de células T) (próximo passo 5.14).
12. Pegue a amostra com 10 μL de células para o controle dapi-mono-manchado (etapa 5.9) e preencha-a até 100 μL com tampão MACS (próximo passo 5.14).
13. Prepare onze novos tubos contendo 100 μL de MACS para os anticorpos mono-manchados (etapa 5.14.4) e controles totalmente manchados (passo 5.14.5) e adicione uma gota de contas de compensação em cada um.
    NOTA: Os controles de compensação permitirão configurar a tensão do laser de detecção fluorescente e avaliar a potencial detecção de sinal inespecífico de corante fluorescente nos outros canais que serão ainda mais compensados.
14. Incubação de anticorpos de amostras:
    1. Amostra de meloide: Adicionar 0,1 mg/mL DAPI (1:100) (ver passo 1.3), FITC anti-mouse CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b (1:100), APC anti-mouse-mouse _CX3CR1 (1:100), BV711 anti-mouse Ly6C (1:100), PE anti-mouse F4/80 (1:100) e APC-Cy7 anti-mouse IA-IE (1:100).
    2. Amostra de células T: Adicionar 0,1 mg/mL DAPI (1:100), FITC anti-mouse CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b (1:100), TCRβ anti-mouse APC (1:100), PE anti-mouse CD8a (1:100) e CD4 anti-mouse APC-Cy7 (1:50).
    3. Controle mono-manchado DAPI (a partir da etapa 5.12): Adicionar 0,1 mg/mL DAPI (1:100).
    4. Contas de compensação mono-manchadas de anticorpos: Adicione cada um dos nove anticorpos usados anteriormente para amostras de células mielóides e T (mesma diluição), separadamente (um para cada tubo) aos nove tubos contendo as contas.
       NOTA: Os controles de compensação mono-manchados permitirão a determinação de picos positivos de fluorescência para cada um dos marcadores fluorescentes usados durante a etapa de compensação. O analisador irá compará-los com o sinal negativo observado nas células CP de controle não manchadas.
    5. Contas de compensação de anticorpos totalmente manchadas: Adicione todos os anticorpos usados para coloração de mielóides em um tubo e aqueles usados para coloração de células T a outro.
       NOTA: Os controles de compensação totalmente manchados permitirão configurar a tensão de cada detecção de laser fluorescente e avaliar a potencial detecção de sinal inespecífico de corante fluorescente nos outros canais.
    6. Incubar por 30-45 min no gelo, protegido da exposição à luz.
15. Encha todos os tubos até 1,5 mL com tampão MACS. Centrifugar as células e as contas de compensação a 500 x g, por 5 min, a 4 °C.
16. Descarte o supernatante e lave as células e as contas de compensação em 1,5 mL de tampão MACS.
17. Centrifugar as células e as contas de compensação a 500 x g, por 5 min, a 4 °C. Descarte o supernatante.
18. Resuspenda as células e contas de compensação em 500 μL de buffer MACS. Encha o controle não manchado (etapa 5.8) até 500 μL com buffer MACS.
19. Filtre cada tubo com células CP através de um coador de 70 μm (CP não manchado, controle mono-manchado da DAPI e amostras de células mielóides e T).

6. Citometria de fluxo

NOTA: O citómetro de fluxo usado neste protocolo é equipado com os seguintes 5 lasers: um laser UV de 355 nm, um laser Violet de 405 nm, um laser azul de 488 nm, um laser verde-amarelo de 561 nm e um laser vermelho de 637 nm.

1. Realize as verificações diárias de controle de qualidade no citômetro usando a configuração do citômetro, a interface de rastreamento (CST) e as contas de controle CST para garantir a consistência entre análises, qualidade do instrumento e intensidades consistentes de fluorescência de alvo.
2. Para configurar o experimento de citometria de fluxo, crie um novo experimento com tramas bivarias e histogramas. Garantir a inclusão de uma área de dispersão para a frente (FSC-A) e parcelas de área de dispersão lateral (SSC-A), bem como parcelas histogramas para cada cor para monitorar a aquisição.
3. Defina a morfologia celular configurando a tensão pmt para parâmetros FSC-A e SSC-A em células CP de controle não manchadas.
4. Defina as tensões de cada marcador fluorescente, configurando os picos negativos dos fluorochromes em células CP de controle não manchadas e os picos positivos dos fluorochromes usando contas de compensação manchadas com todos os anticorpos e garantindo que os sinais do detector não estejam fora da escala e não sejam fortemente detectados em outros canais.
5. Crie uma matriz de compensação para analisar cada um dos controles de compensação de cores únicas. Depois de atacar as populações apropriadas de FSC-A/SSC-A, verifique controles de uma única mancha em parcelas de histograma e registiculhe controles de compensação. Depois de registrar todas as amostras manchadas, calcule a matriz de compensação.
6. Registo todos os eventos detectados para populações de células mielóides e T.

7. Células mielóides CP gating

1. Selecione FSC-A vs. SSC-A e portão para células (com base no tamanho).
2. Crie um portão de filha para células individuais com altura de dispersão FSC-A vs. para a frente (FSC-H).
3. Crie um portão de filha para células vivas com DAPI vs. FSC-A para excluir células DAPI⁺ .
4. Crie um portão de filha para células imunes CD45⁺ com CD45 vs. FSC-A.
5. Crie um portão de filha a partir das células CD45⁺ e selecione CD11b vs. F4/80, identifique os seguintes dois grupos: o CD11b⁺ F4/80⁺ e o CD11b⁺ F4/80^- populações (próximo passo 7.8).
6. Crie um portão de filha para células CD11b⁺ F4/80⁺ e selecione _CX3CR1 vs. IA-IE. Identifique tanto _cx3cr1⁺ IA-IE⁺ BAM que são ainda mais denominados como CD11b⁺ F4/^80high _CX3CR1⁺ IA-IE⁺ BAM, e _CX3CR1⁺ IA-IE^- macrófagos.
7. Crie um portão de filha para cd11b⁺ F4/80⁺ _CX3CR1⁺ IE^- macrófagos e selecione F4/80 vs. CD11b. Identifique tanto o CD11bhigh F4/^{80intermediate} quanto as populações CD11b⁺ F4/^80high que são ainda chamadas de CD11bigh F4/^{80intermediate} _CX3CR1⁺ IA-IE^- Macrofagos epiplexos de Kolmer e CD11b⁺ F4/^80high _CX3 CR1⁺ IA-IE-BAM, respectivamente.
   NOTA: AS células CX3CR1⁺ CD11bigh F4/^{80intermediato} _CX3CR1+ ^e CD11b⁺ F4/^80high _CX3CR1⁺ IA-IE^- apareceram um pouco misturadas entre os níveis F4/^{80intermediate-F4}/^80high e CD11bhigh-CD11b⁺.
8. Da ^população CD11b⁺ F4/80 (etapa 7.5), portão para Ly6C vs. IA-IE. Selecione tanto as células IA-IE⁺ Ly6C^- população e IA-IE-Ly6C⁺ que correspondem principalmente a monócitos/neutrófilos.
   NOTA: A alta presença de células IA-IE-Ly6C⁺ provavelmente reflete problemas na eficácia da perfusão de animais sem condição inflamatória; sua abundância deve ser baixa.
9. Crie um portão de filha para ^{a população} CD11b⁺ F4/80^- IA-IE⁺ Ly6C e selecione CD11b vs. _CX3CR1, identifique ^{tanto as populações} CD11bhigh _CX3CR1low quanto CD11b⁺ _CX3CR1- populações.

8. Células CP T gating

1. Selecione FSC-A vs. SSC-A e portão para células (com base no tamanho).
2. Crie um portão de filha para células individuais com altura de dispersão FSC-A vs. para a frente (FSC-H).
3. Crie um portão de filha para células vivas com DAPI vs. FSC-A para excluir células DAPI⁺ .
4. Crie um portão de filha para células imunes CD45⁺ com CD45 vs. FSC-A.
5. Crie um portão de filha a partir das células CD45⁺ e selecione TCRβ vs. CD11b. Exclua células mielóides CD11b⁺ e selecione a população de células TCRβ⁺ CD11b-T.
6. Crie um portão de filha ^{para a população} TCRβ⁺ CD11b e selecione CD4 vs. CD8a. Identifique as células CD8^- CD4⁺ T e as células ^CD4-T CD8+.

Resultados

As análises de citometria de fluxo apresentadas aqui revelaram com sucesso os principais subconjuntos das células mielóide e T (Figura 1 e Figura 2, respectivamente), e seu número total relativo por rato de forma altamente reprodutível (Figura 3).

A análise de citometria de fluxo das células mielóides mostrou que o CP é povoado por CD11b⁺ _CX3CR1⁺ F4/^80high

Discussão

Estudos com o objetivo de entender as contribuições imunológicas para a homeostase cerebral e doença têm focado principalmente em células residentes dentro do parenchyma cerebral, negligenciando fronteiras cerebrais como o PC, que são, no entanto, contribuintes cruciais para a função ^cerebral2,3. A análise das populações de células imunes no PC é desafiadora devido ao pequeno tamanho de CP, baixo número de células imunes residentes e acesso compli...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Flow cytometry antibody
Albumin, bovine	MP Biomedicals	160069	Blocking reagent
APC anti-mouse CX3CR1	BioLegend	149008	Flow cytometry antibody
APC anti-mouse TCRb	BioLegend	109212	Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100414	Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse IA-IE	BioLegend	107628	Flow cytometry antibody
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences		Flow cytometry analyzer
BV711 anti-mouse Ly6C	BioLegend	128037	Flow cytometry antibody
Collagenase IV	Gibco	17104-019	Enzyme to dissociate CP tissue
DAPI	Thermo Scientific	62248	Live/dead marker
EDTA			Ion chelator
fine scissors	FST	14058-11	Dissection tool
FITC anti-mouse CD45	BioLegend	103108	Flow cytometry antibody
Flow controller infusion inset	CareFusion	RG-3-C	Blood perfusion inset
FlowJo software	BD Biosciences		Analysis software
forceps	FST	11018-12	Dissection tool
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Anticoagulant
Imalgene	Boehringer Ingelheim		Ketamine, anesthesic
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-42	Control beads to realize compensation
PBS-/-	Gibco	14190-094	Buffer
PBS+/+	Gibco	14040-091	Buffer
PE anti-mouse CD8a	BioLegend	100708	Flow cytometry antibody
PE anti-mouse F4/80	BioLegend	123110	Flow cytometry antibody
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b	BioLegend	101256	Flow cytometry antibody
Rompun	Bayer		Xylazine, anesthesic
thin forceps	Dumoxel Biology	11242-40	Dissection tool
Vetergesic	Ceva		Buprenorphin, analgesic