Métodos Eletrofisiológicos para Medir Níveis de Fotopigment em Fotorreceptores de Drosophila

Resumo

Apresentamos um protocolo para caracterizar eletrofisilogicamente fotopigmentações bie estáveis: (i) explorando os deslocamentos de carga dentro das moléculas de fotopigment após a absorção de fótons e sua enorme quantidade nos fotorreceptores, e (ii) explorando as diferenças de absorção-espectros dos estados de fotopigmento de rhodopsina e metarhodopsina. Esses protocolos são úteis para rastrear mutações que afetam sistemas de fotopigment biestabilidade.

Resumo

O drosophila G-protein-acoplado rhodopsin (R) é composto de uma proteína (opsina) e um cromoforeiro. O processo de ativação da rodopsina é iniciado pela isomerização indutora de absorção de fótons do cromoóforo, promovendo alterações conformais da opsina e resultando em um segundo estado de fotopigmento escuro-estável (metarhodopsina, M). A investigação deste fotopigment bi-estável usando mutagênese aleatória requer métodos simples e robustos para a triagem de moscas mutantes. Portanto, vários métodos para medir reduções nos níveis funcionais de fotopigment foram projetados. Um desses métodos explora os deslocamentos de carga dentro do fotopigment após a absorção de fótons e as enormes quantidades de moléculas de fotopigment expressas nos fotorreceptores. Este sinal elétrico, chamado de potencial receptor precoce (ou corrente de receptor precoce), é medido por uma variedade de métodos eletrofisiológicos (por exemplo, eletroretinograma e gravações de células inteiras) e é linearmente proporcional aos níveis de fotopigment funcional. As vantagens deste método são a alta relação sinal-ruído, a medição linear direta dos níveis de fotopigment e a independência dos mecanismos de fototransdução rio abaixo para a ativação de rodopsina ou metarhodopsina. Um método eletrofisiológico adicional chamado despolarização prolongada pós-potencial (PDA) explora a bi-estabilidade da fotopigment de Drosophila e as diferenças espectrais de absorção dos estados de pigmento R e M. O PDA é induzido por intensa luz azul, convertendo quantidades saturadas de rodopsina em metarhodopsina, resultando na falha da terminação de resposta à luz por um longo tempo na escuridão, mas pode ser terminada por metarhodopsina à conversão de rodopsina usando luz laranja intensa. Uma vez que o PDA é um sinal robusto que requer conversão maciça de fotopigment, mesmo pequenos defeitos na biogênese do fotopigamento levam a PDA anormal prontamente detectada. De fato, mutantes PDA defeituosos levaram à identificação de novas proteínas de sinalização importantes para a fototransdução.

Introdução

A rodopsina ativada pela luz (R), que é um receptor acoplado à proteína G (GPCR), é composta por uma proteína transmembrana 7 (opsina) e um cromoforo. Em Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas), a absorção de fótons induz a isomerização do cromo de 11-cis-3-OH-retinal ao todo trans-3-OH-retinal ¹, promovendo a mudança conformacional da rhodopsina para metarhodopsina (M, Figura 1A). Ao contrário da rodopsina vertebrado, a fração predominante do cromoforoto invertebrado não se dissocia da opsina, resultando no estado de pigmento fisiologicamente ativo e estável M. Por sua vez, a absorção adicional de fótons pelo cromoforo de retina totalmente trans-3-OH induz isomerização do cromoforo ^2,3, gerando o estado de pigmento R com o cromotorgico 11-cis-3-OH-retinal. O estado R é um fotopigment escuro, estável e fisiologicamente não ativo. Além da rota de regeneração de fótons extremamente rápida do cromoforo⁴, assim como os fotopigmentos de vertebrados, existe uma rota lenta enzimática alternativa para a regeneração do cromóforo em invertebrados, em que alguns dos estágios são realizados em células da retina ao redor das células fotorreceptores ^5,6.

A drosophila implica grandes vantagens como organismo modelo para estudar fotorreceptores invertebrados. Em particular, a acessibilidade da preparação e a capacidade de aplicar genética molecular tornaram o Drosophila um poderoso sistema modelo⁷. Assim, foram estabelecidos diversos métodos experimentais in vivo e ex vivo para o estudo da fototransdução em geral e em níveis de fotopigment, em particular. O método in vivo mais simples explora a resposta de tensão extracelularmente relativamente grande à luz do olho drosophila. Assim, a estimulação da luz evoca uma resposta de tensão elétrica em todo o olho que pode ser medida usando o registro de eletroretinograma extracelular (ERG), que é ~3 ordens de magnitude maior que a resposta ERG à luz dos olhos vertebrados ^8,9. A resposta Drosophila ERG é robusta e facilmente obtida, o que o torna um método conveniente para identificar anormalidades na resposta à luz devido a mutações. A resposta do ERG à luz surge principalmente dos fotorreceptores, células pigmentantes (glia) e neurônios secundários da lâmina (ver Figura 1B). Os principais componentes do ERG são (i) a resposta de tensão extracelular dos fotoreceptores, (ii) os transitórios "on" e "off" no início e no fim do estímulo de luz que surgem dos neurônios lamina (Figura 2A, inset, ON, OFF), (iii) a resposta lenta das células glia (Figura 2A, inset, setas) e (iv) o breve e transitório, resposta resultante do deslocamento da carga durante a ativação do fotopigment que precede o ON transitório¹⁰ (Figura 2C [inset], D, E). Esta breve resposta é composta de duas fases (M1 e M2, Figura 2C [inset]) e só pode ser induzida por estimulação de luz extremamente forte, que ativa simultaneamente milhões de moléculas de fotopigment. Não é observada sob estimulação azul (Figura 2D, traço azul) nem em mutantes com níveis de fotopigment altamente reduzidos (Figura 2E, traço vermelho), mas sua amplitude é levemente aumentada em um mutante que abolia a atividade do PLC (Figura 2E, traço laranja). A fase M1 é um ERP típico da mosca decorrente da ativação de M nos fotorreceptores. A fase M1, que tem uma polaridade positiva (intracelularmente), libera um neurotransmissor da maneira normal em uma sinapse invertida de sinais e ativa os neurônios de lâmina, que respondem à despolarização do fotoreceptor gerando a fase M2 sintáticamente amplificada. Assim, ambas as fases M1 e M2 refletem a ativação M^10,11.

A despolarização do fotoreceptor gera o transitório "on" córnea-positivo, decorrente da sinapse invertida entre o axônio fotorreceptor e os neurônios monopolares da lamina^10,11 (Figura 1B). O lento aumento e decadência do ERG surge da despolarização das células pigmentadas (Figura 2A, inset, setas) principalmente devido ao Efflux K⁺ das células fotorreceptoras¹² através dos canais receptores transitórios (TRP) e TRP-like (TRPL) 13,14,15. Esses componentes cinéticos lentos mascaram e distorcem em grande parte a forma de onda da resposta do fotorreceptor quando comparada às gravações intracelulares ou células inteiras da resposta do fotorreceptor à luz ^9,10. Além disso, em iluminação muito forte, pode ser observada uma resposta transitória adicional, que precede e se funde parcialmente com o transitório "on", (Figura 2C [inset],D,E). Este sinal se origina diretamente da ativação maciça do fotopigmento¹⁰.

Vários protocolos de regime de luz utilizando densidade neutra (ND) e filtros de cores, bem como fortes flashes iluminados, foram desenvolvidos para investigar o olho em geral e a cascata de fototransdução em particular. Esses protocolos também têm sido usados para investigar as propriedades do fotopigment.

O protocolo de intensidade-resposta mede o pico de amplitude da resposta de tensão ERG de todo o olho ao aumento das intensidades de luz (Figura 2A,B). Este protocolo auxilia na detecção de alterações na sensibilidade das células fotorreceptoras à luz⁹.

O protocolo de despolarização prolongada pós-potencial (PDA) explora as diferenças nos espectros de absorção de rhodopsin e metarhodopsina que permite, em Drosophila, uma conversão maciça de fotopigment de R para seu estado intermediário fisiologicamente ativo e estável escuro^{M 2}. Na resposta de tensão ERG, é dado um pulso relativamente curto de luz saturada, e a resposta de tensão resultante é registrada. Sob essa condição, um teto (potencial de reversão) é atingido pelo sinal de despolarização porque a ativação de uma fração de por cento da enorme quantidade de moléculas de rodopsina (~1 x 10⁸) é suficiente para atingir o teto. A presença dos componentes de fototransdução em grande abundância garante que este teto seja atingido mesmo em mutantes com uma redução significativa na concentração ou defeito sutil dos componentes de fototransdução. Esta situação impede o isolamento desses mutantes. Pak et al. introduziram a triagem PDA⁷ buscando um teste confiável e revelador para isolar mutantes visuais. Em Drosophila, a resposta do PDA é provocada pela remoção genética do pigmento de triagem vermelho, que permite a conversão de fotopigment, e a aplicação da luz azul, que é preferencialmente absorvida por rodopsina (Figura 3A) e, assim, resulta em uma grande conversão líquida do R para o estado de fotopigmentação M. A terminação de fototransdução é interrompida ao nível do fotopigment por uma grande conversão líquida de R para M, o que, por sua vez, resulta em excitação sustentada muito depois que a luz é desligada (Figura 2C, Figura 4A [topo]). Durante o período PDA, os fotorreceptores são menos sensíveis às luzes de teste subsequentes e são parcialmente dessensibilizados (inativados). O PDA detecta mesmo pequenos defeitos na biógnese de rodopsina e testa a capacidade máxima da célula fotorreceptora para manter a excitação por um longo período. Uma vez que depende estritamente da presença de altas concentrações de rodopsina, ele pontua facilmente para reposição deficiente dos componentes de fototransdução. Notavelmente, a tela do PDA rendeu muitos mutantes visuais novos e muito importantes (revisados em Pak et ^al.7). Assim, os mutantes do PDA isolados por Pak et ^al.7 ainda são extremamente úteis para analisar o sistema visual Drosophila .

O PDA é induzido em Drosophila pela saturação da luz azul, resultando em despolarização contínua muito tempo após o deslocamento da luz (Figura 4A [topo]). Após saturar a luz azul indutora de PDA, os fotorreceptores periféricos (R1-6) permanecem continuamente ativos no escuro em sua capacidade máxima, atingindo a saturação. Luzes azuis saturadas adicionais durante o PDA não produzem nenhuma resposta adicional em células R1-6 por muitos segundos, mas induzem uma resposta em células R7-8 que é sobreposta ao PDA. As respostas sobrepostas são explicadas pelos diferentes espectros de absorção dos fotopigmentamentos expressos nessas células (R7-8)¹⁶. O PDA pode ser suprimido pela fotoconversão de M de volta para R com luz laranja saturada (Figura 4A [topo]). A capacidade do PDA de trazer as células fotorreceptoras à sua capacidade ativa máxima, uma situação que não pode ser alcançada pela luz branca intensa, explica por que tem sido uma ferramenta importante para a triagem de mutantes visuais de Drosophila. Isso porque permite a detecção de pequenos defeitos em proteínas envolvidas na biogênese dos níveis normais de fotopigment^17,18. Dois grupos de mutantes defeituosos do PDA foram isolados: nem inativação nem pós-potencial (nina) mutantes e inativação, mas não após mutantes (ina) ina. O fenótipo do primeiro é a falta de um PDA e a inativação associada decorrente de uma grande redução nos níveis de fotopigment (Figura 4A [meio]). O fenótipo deste último mostra inativação, mas sem despolarização escura após a luz azul devido a um mecanismo ainda desconhecido no mutante com níveis normais de rodopsina, mas sem proteínas interagindo com os canais TRP (Figura 4A [inferior]).

O PDA decorre da diferença na quantidade de fotopigment em relação à prisão (ARR2), que vincula e encerra a atividade M 19,20,21 (Figura 1A). Em fotorreceptores de Drosophila, a quantidade do fotopigment é cerca de cinco vezes maior que a quantidade de ARR2¹⁹. Assim, os níveis de ARR2 são insuficientes para inativar todas as moléculas M geradas por uma grande fotoconversão líquida de R a M, deixando um excesso de M constantemente ativo no escuro 17,19,20,22,23. Este mecanismo explica a eliminação da resposta do PDA por mutações ou por privação de^{carotenoides 24,25}, causando uma redução no nível de fotopigment, mas não afeta os níveis de detenção. Além disso, essa explicação também explica os fenótipos do alelo mutante ARR2 (arr2³)²¹, no qual o PDA poderia ser alcançado em intensidades de luz azul 19,20,21 (Figura 4B,C). O PDA não é uma característica única de fotorreceptores de mosca, e aparece em todas as espécies testadas que tem M estável escuro com um espectro de absorção diferente do estado R, permitindo fotoconversão suficiente do fotopigment do R para o estado M. Uma espécie minuciosamente investigada em que a fenomenologia do PDA foi descoberta é o fotoreceptor de craca (Balanus), no qual o espectro de absorção do estado R está em um comprimento de onda mais longo do que o estado M² (Figura 3B). Assim, ao contrário da situação na mosca, na craca, a luz laranja-vermelha induz um PDA, enquanto a luz azul suprime o PDA².

O protocolo de potencial receptor (ERP) inicial explora o deslocamento de carga que ocorre durante a ativação de R ou M. O pigmento visual é parte integrante da membrana superficial do compartimento de sinalização das membranas vertebrados e invertebrados³. Assim, o processo de ativação em que as moléculas de fotopigmento mudam de um estado intermediário para o outro é acompanhado por um deslocamento^de carga ^4,26. Como as moléculas de fotopigmentão estão eletricamente alinhadas em paralelo com a capacitância da membrana⁴, uma rápida mudança conformacional sincronizada gera uma rápida mudança de polarização da membrana superficial, que, em moscas, ocorre no compartimento de sinalização composto por uma pilha de ~30.000-50.000 microvilli chamado rabdomi. Essa polarização então descarrega passivamente através da capacitância da membrana do corpo celular até que a membrana celular esteja igualmente polarizada. O ERP é a gravação extracelular do deslocamento da carga. O ERP registrado intracelularmente manifesta o ERP extracelular integrado pela constante de tempo da membrana^{celular 4,27,28}. A corrente ativada pelo deslocamento da carga de pigmento visual também poderia ser medida em gravações de tensão-grampo de tensão de células inteiras^29,30 (Figura 5A-D), com a maior vantagem (nas gravações de corrente receptora precoce (ERC) de minimizar o efeito da capacitância da membrana na cinética do sinal.

A seção de protocolo descreve como realizar medições de ERG a partir de medições de olho Drosophila ⁹ e ERC por gravações de células inteiras de Drosophila isolada ommatidia^31,32. Também descrevemos protocolos específicos que são usados para investigar a fototransdução em geral e fotopigments em particular.

Protocolo

1. Medindo a relação de resposta à intensidade, despolarização prolongada após o potencial (PDA) e o potencial do receptor precoce (ERP) usando o eletroretinograma

1. Condições adequadas de criação para a preparação de D. melanogaster
   1. Raise D. melanogaster voa em garrafas contendo milho amarelo padrão contendo alimentos em uma incubadora mantida a uma temperatura de 24 °C e em um ciclo escuro/claro de 12 horas
   2. Mantenha as garrafas de mosca no escuro pelo menos 24 horas antes do experimento.
2. Configuração geral
   1. Prepare as pipetas de gravação puxando 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) capilares de vidro borossilicato recheados de fibra (Figura 6L, O). A resistência das pipetas deve ser de 5-10 MΩ; qualquer puxador adequado pode ser usado.
   2. Cubra dois fios prateados com AgCl₂, inserindo fio prata de 0,25 mm na solução de 3 M KCl conectada a uma fonte de alimentação 5 V personalizada.
   3. Insira cada fio de prata revestido nos suportes de eletrodos (Figura 6N).
   4. Encha o capilar de vidro com a solução filtrada do Ringer (ver Tabela 1) usando uma seringa de ponta alongada (Figura 6M).
   5. Insira o eletrodo do fio no capilar de vidro. Certifique-se de que a solução dentro do capilar esteja em contato com o fio de prata.
   6. Insira os suportes de eletrodos (Figura 7P, N) nos dois micromanipuladores de eletrodos (Figura 7G).
3. Procedimento de preparação da mosca para gravações elétricas
   NOTA: Para manter a mosca sob condições de adaptação escura, use apenas iluminação de luz vermelha fraca durante as etapas seguintes.
   1. Anestesiar as moscas na garrafa com gás CO₂ usando o sistema de dormente de mosca (Figura 6A, B) e despeje-as no recipiente adormecido.
   2. Escolha uma mosca e segure-a cuidadosamente pela asa usando uma pinça afiada. Cubra o resto das moscas com uma placa de Petri.
   3. Coloque a mosca no suporte de mosca no devido sentido deitado de lado, de costas para a mão (Figura 6P).
   4. Ligue a fonte de alimentação do ferro de solda. Defina a corrente para ~2,25 A. Esta corrente deve aquecer o filamento de platina de 0,25 mm para ~55-56 °C (ver Arquivo Suplementar).
   5. Coloque uma gota de cera com uma baixa temperatura de fusão (~55-56 °C) no ferro de solda (Figura 6F).
   6. Usando pinças, levante a mosca de suas asas e fixe suas asas ao suporte de mosca (Figura 6I) usando o ferro de solda.
   7. Usando o ferro de solda, conecte as costas da mosca à superfície do suporte com cera (Figura 6P).
   8. Abaixe a ponta do ferro de solda no ponto de junção das pernas e derreta a cera para cobrir todas as pernas juntas (Figura 6P).
   9. Coloque uma pequena gota de cera entre a cabeça e as costas na área do pescoço (Figura 6P).
      NOTA: Tome cuidado especial para evitar superaquecimento da cabeça de mosca. Certifique-se de que a mosca está corretamente fixa e não pode se mover durante o experimento; pequenos movimentos podem criar artefatos nas gravações. Certifique-se de que as aberturas de traqueia (entradas respiratórias) no tórax e abdômen não estão cobertas com cera.
   10. Coloque o suporte de mosca (Figura 7Q) em uma gaiola escura de Faraday em um bloco de ímã (Figura 7I) e certifique-se de que a mosca está ~5 mm da extremidade do guia de luz (Figura 7L).
   11. Coloque o eletrodo de gravação (Figura 7P) acima do olho da mosca e do eletrodo de terra (Figura 7N) sobre a parte superior traseira da mosca usando os micromanipuladores.
   12. Insira o eletrodo moído na parte de trás da mosca usando os micromanipuladores.
   13. Insira o eletrodo de gravação na periferia externa do olho da mosca, de preferência, utilizando os micromanípulos.
       NOTA: Após inserir o eletrodo no olho, será observada uma pequena covinha; puxe o eletrodo para cima sem removê-lo do olho até que a covinha desapareça. Os eletrodos também podem ser imersos em pequenas gotículas de geleia de eletrodo aplicada no torso e no olho.
4. Protocolo de resposta à intensidade
   1. Coloque um filtro laranja (filtro de borda de 590) na frente da lâmpada Xenon de alta pressão. Use um filtro grande (seis ordens de magnitude) atenuante da densidade neutra (ND).
   2. Espere 60 s no escuro e dê um pulso de luz de 5 s.
   3. Substitua o filtro ND por um filtro ND menos atenuante em uma ordem de incrementos de magnitude.
   4. Espere 60 s no escuro e dê um segundo pulso de luz de 5 s.
   5. Repetição passos 1.4.1.-1.4.4, aumentando gradualmente a intensidade da luz usando filtros ND menos atenuantes (o último pulso deve ser gerado sem filtro ND). Certifique-se de usar a série de filtros ND na direção adequada, começando a partir de uma grande atenuação e atingindo baixa atenuação.
5. Protocolo PDA (este protocolo só pode ser realizado em moscas de olhos brancos)
   1. Dê um pulso de luz de 5 s de intensidade máxima usando um filtro laranja (filtro de borda de 590, para converter fotopigment máximo para o estado R).
   2. Substitua o filtro laranja por um filtro azul de banda larga (BP450/40 nm) e dê três pulsos de luz de 5 s em intensidade máxima.
      NOTA: Também é possível dar um pulso de luz azul de intensidade máxima de longa intensidade contínua até que uma resposta de tensão de estado estável seja alcançada.
   3. Aguarde 60 s no escuro, substitua o filtro azul pelo filtro laranja anterior e dê dois pulsos de luz de 5 s com intervalos de 60 s.
6. Protocolo potencial ERP/M para medir o espectro de equilíbrio fotográfico de M (este protocolo só pode ser realizado em moscas de olhos brancos^10,25)
   1. Dê um pulso de luz azul contínuo (bp) 450/40 nm) até atingir uma resposta de tensão de estado estável, que converte a quantidade máxima de fotopigment do estado R para o estado M das células R1-6.
   2. Dê um breve (<3 ms) flash de luz intenso de um comprimento de onda entre 350-700 nm (o espectro de absorção conhecido de fotopigment de células R1-6) usando estreito (~2 nm) filtros de bandpass e medem o pico de amplitude da fase M1 da resposta potencial M (que reflete a absorção de metarhodopsina neste comprimento de onda específico no foto-equilíbrio^10,25).
      NOTA: Para a ativação síncrono de uma grande piscina de moléculas de fotopigmentamento, é necessário um breve e intenso flash de luz para que o conteúdo do fóton seja embalado em curta duração. O potencial M é composto por dois componentes: M1 (fase negativa da córnea), que reflete o deslocamento de carga da metarhodopsina no fotoreceptor, e M2 (fase positiva da córnea^11,33), que reflete a resposta amplificada M1 dos fotorreceptores na lamina ^9,10,11 . Cada um desses componentes pode ser identificado e medido. No entanto, é preferível medir o potencial M1, pois é uma manifestação linear direta dos níveis M. Se o M2 for usado, certifique-se de que sua amplitude esteja na faixa linear usando privação de carotenoide leve^24,25.
   3. Dê um pulso de luz azul contínuo (BP450/40 nm) novamente, seguido por um breve (<1 ms) flash de luz intenso de um comprimento de onda diferente.
   4. Repita este protocolo até que todo o espectro de absorção de M no equilíbrio fotográfico esteja coberto.

2. Protocolo ERC para medir o espectro de ação dos estados R e M das células R1-6 usando gravações de grampo de tensão de células inteiras

NOTA: Para obter um protocolo detalhado para o uso de gravações de grampo de tensão de células inteiras, consulte Katz et ^al.34. O M-potencial utiliza o ERG para medir a ativação do estado M somente porque a contribuição do estado R é suprimida pela capacitância da membrana. Em contraste, o ERC mede a ativação tanto dos estados R (ERC positivos) quanto M (ERC negativo) porque as gravações de grampo de tensão removem o efeito da capacitância da membrana (ver introdução).

1. Converta o fotopigment para o estado desejado (R ou M). Para conversão de R a M, primeiro, adapte as moscas por um breve (<1 ms) azul adaptativo (BP450/40 nm). Para conversão M para R, dê um curto flash laranja adaptativo (filtro de borda OG590).
2. Dê um breve flash de luz (<1 ms) de um comprimento de onda entre 350-700 nm e meça a amplitude máxima negativa ou positiva da resposta ERC, que reflete a absorção M/R neste comprimento de onda específico.
   NOTA: Para a ativação síncrono de uma grande piscina de moléculas de fotopigmentamento, é necessário um breve e intenso flash de luz para embalar o conteúdo do fóton em uma curta duração. A conversão máxima de fotopigment de R para M por flash azul pode atingir ~80% do total de moléculas de fotopigment por causa da sobreposição no espectro de absorção de R e M (Figura 3A). Portanto, em comprimentos de onda abaixo de ~550 nm, o ERC tem dois componentes: uma fase negativa que reflete a resposta da metarhodopsina, e uma fase positiva que reflete a resposta da rodopsina restante. O ERC depende linearmente da intensidade da luz (Figura 5D). Assim, para obter a sensibilidade espectral dos estados R e M, cada fase do ERC precisa ser normalizada nos vários comprimentos de onda para a energia igual²⁹.
3. Repetia as etapas 2.1.-2.2. usando flashes de diferentes comprimentos de onda.
4. Plote o ERC positivo e negativo normalizado em função do comprimento de onda.
   NOTA: O forte flash de luz induz uma corrente maciça através dos canais sensíveis à luz levando ao estresse metabólico no fotorreceptor, o que, por sua vez, causa abertura de canal independente da luz. O ERC é sobreposto a esta corrente constituinte.

Resultados

A Figura 2 exemplifica a robustez e a facilidade de utilização da técnica ERG. É robusto porque é gravado na mosca praticamente intacta por uma técnica simples de gravações de tensão extracelular que requerem uma simples configuração eletrofisiológica. A robustez se manifesta pela obtenção de gravações de respostas de luz com amplitudes relativamente grandes (na faixa de milívolos) mesmo quando mutações reduzem fortemente ou distorcem a resposta à luz. Portanto, mesmo um ...

Discussão

A maior vantagem do uso da preparação do fotorreceptor Drosophila é sua acessibilidade, a facilidade e precisão da estimulação da luz e, o mais importante, a capacidade de aplicar o poder da genética molecular⁷. Estudos genéticos extensivos estabeleceram o Drosophila como um sistema modelo extremamente útil para a dissecção genética de processos biológicos complexos⁷. A estrutura relativamente simples do genoma de Drosophila (composto...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X