Caracterização ecocardiográfica da estrutura, função e fluxo coronariano do ventrículo esquerdo em camundongos recém-nascidos

Resumo

O presente protocolo descreve a avaliação ecocardiográfica da morfologia, função e fluxo sanguíneo coronariano do ventrículo esquerdo em camundongos recém-nascidos de 7 dias de idade.

Resumo

A ecocardiografia é um procedimento não invasivo que permite a avaliação de parâmetros estruturais e funcionais em modelos animais de doença cardiovascular e é utilizada para avaliar o impacto de potenciais tratamentos em estudos pré-clínicos. Estudos ecocardiográficos geralmente são realizados em camundongos adultos jovens (ou seja, 4-6 semanas de idade). A avaliação da função cardiovascular neonatal precoce geralmente não é realizada devido ao pequeno tamanho dos filhotes de camundongos e às dificuldades técnicas associadas. Um dos desafios mais importantes é que o curto comprimento dos membros dos filhotes impede que eles atinjam os eletrodos na plataforma ecocardiográfica. A temperatura corporal é o outro desafio, pois os filhotes são muito suscetíveis a mudanças de temperatura. Portanto, é importante estabelecer um guia prático para a realização de estudos ecocardiográficos em filhotes de camundongos pequenos para ajudar os pesquisadores a detectar alterações patológicas precoces e estudar a progressão da doença cardiovascular ao longo do tempo. O presente trabalho descreve um protocolo para a realização de ecocardiografia em filhotes de camundongos na tenra idade de 7 dias de idade. A caracterização ecocardiográfica da morfologia, função e fluxo coronariano cardíaco em camundongos neonatais também é descrita.

Introdução

O objetivo geral deste protocolo é examinar a morfologia, a função e o fluxo da artéria coronária cardíaca em filhotes de camundongos neonatais de 7 dias de idade usando ecocardiografia. A lógica por trás do desenvolvimento dessa técnica é determinar alterações precoces no fluxo coronariano e na função cardíaca em modelos de camundongos de doença cardíaca¹. A natureza não invasiva da ecocardiografia é vantajosa, pois permite aos pesquisadores avaliar a função cardiovascular em condições fisiológicas e fornece aos pesquisadores uma ferramenta de triagem para o estudo de terapias direcionadas para o tratamento de doenças cardiovasculares ^2,3. Tradicionalmente, estudos ecocardiográficos são realizados com camundongos adultos jovens (4-6 semanas); no entanto, alguns modelos de camundongos (ou seja, modelos geneticamente modificados) já apresentam alterações patológicas e disfunção cardíaca nessa idade. Portanto, a pesquisa cardíaca usando modelos animais tem se concentrado principalmente em agentes terapêuticos que melhoram ou tratam a disfunção cardíaca. Em contrapartida, mais recentemente, os esforços de pesquisa têm sido redirecionados para se concentrarem em medidas preventivas e intervenções precoces em doenças cardíacas⁴.

Estudos prévios descreveram o uso da ecocardiografia para medir a função cardíaca em modelos de infarto do miocárdio em camundongos neonatais ^5,6; no entanto, esses estudos não conseguiram medir o fluxo coronariano e, o mais importante, não registraram dados de eletrocardiograma (ECG) e frequência cardíaca (FC) durante o procedimento, provavelmente devido ao pequeno tamanho dos membros dos filhotes, que não conseguiram atingir as almofadas dos eletrodos. Superamos esse problema neste protocolo anexando folha de alumínio aos membros para permitir que eles alcancem as almofadas do eletrodo e criem um circuito de ECG. Além disso, este protocolo descreve e caracteriza o fluxo da artéria coronária em camundongos neonatais.

Este estudo obteve imagens de modo B e modo M em incidências paraesternais de eixos longos e curtos para medir parâmetros estruturais e funcionais ^2,3. Os parâmetros morfológicos incluíram dimensões do átrio esquerdo, dimensões do ventrículo esquerdo (VE), espessura da parede do VE, massa do VE e espessura relativa da parede (RWT). Os parâmetros funcionais incluíram fração de ejeção (FE), encurtamento fracionado (FS), débito cardíaco (CO) e velocidade de encurtamento da fibra circunferencial (CFV). O Doppler de onda de pulso (PW) foi utilizado para medir o fluxo aórtico na visão paraesternal de eixo curto (PSAX) e para medir o fluxo sanguíneo mitral na visão apical de quatro câmaras. A visão apical de quatro câmaras também foi utilizada para a realização do Doppler Tecidual na parte septal do anel valvar mitral. O fluxo coronariano na artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE) também foi examinado usando uma visão de eixo longo paraesternal modificada (PLAX). A reserva de fluxo coronariano (CFR) foi calculada após um desafio de estresse induzido pelo aumento da concentração de isoflurano.

O presente protocolo demonstra que os estudos ecocardiográficos podem ser realizados em idade muito precoce em camundongos neonatais, permitindo o reconhecimento precoce de patologias cardíacas e estudos longitudinais de acompanhamento da hemodinâmica do VE e dos parâmetros de fluxo coronariano em diferentes modelos de camundongos. Esta técnica pode ser usada para estudar o papel de alterações genéticas ou intervenções farmacológicas na função cardíaca em idades pós-natais precoces. Além disso, o protocolo fornece uma ferramenta valiosa para determinar o aparecimento de doenças cardíacas no início da vida, permitindo assim que os pesquisadores desbloqueiem os mecanismos moleculares subjacentes aos estágios iniciais das doenças cardíacas em diferentes modelos de camundongos.

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Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Illinois em Chicago. Para os experimentos, foram utilizados camundongos FVB/N de 7 dias de idade. O protocolo é dividido em preparação de camundongos, aquisição de imagens ecocardiográficas e cuidados pós-imagem com animais.

1. Preparação do mouse

1. Obtenha os ratos de 7 dias de idade da gaiola de reprodução.
   NOTA: Nesta idade precoce, é difícil determinar o sexo do animal pelo exame físico.
2. Coloque o gel de ECG (ver Tabela de Materiais) nas almofadas do eletrodo da plataforma aquecida. Coloque tiras de folha de alumínio (~1,5 pol x 0,25 pol) em cima das almofadas do eletrodo para estender a faixa do eletrodo e fixar com fita adesiva (Figura 1A). Posteriormente, coloque o gel de ECG em cima das tiras de folha de alumínio.
   NOTA: Certifique-se de que o gel sob as tiras de folha de alumínio não seque durante o procedimento. Se isso ocorrer, adicione mais gel para manter a condutividade.
3. Corte um dedo de uma luva nitrílica e encaixe-o para cobrir o cone de isoflurano/oxigênio de um lado e o nariz de rato do outro lado (Figura 1B).
4. Colocar o filhote de camundongo na câmara de indução de isoflurano e iniciar a entrega de isoflurano na concentração de 2,5% impulsionada por oxigênio a 100% (Figura 1C).
5. Coloque o filhote anestesiado em decúbito dorsal na plataforma de imagem com as patas em cima das almofadas de folha de alumínio e prenda com fita adesiva. Certifique-se de que o circuito elétrico está completo e que o ECG está gravando.
6. Diminua a entrega de isoflurano para 1,5% impulsionada por 100% de oxigênio. Prenda o dedo recortado da luva ao redor do nariz do filhote com fita adesiva. Confirme a profundidade da anestesia apertando as patas do filhote.
7. Coloque uma camada espessa de gel de ultrassom pré-aquecido em cima da parte superior do corpo do filhote. Use dois rolos de gaze para manter o gel de ultrassom no lugar (Figura 1D).
8. Use uma lâmpada de aquecimento para manter a temperatura corporal normal do filhote (Figura 1E).
   NOTA: Uma sonda retal não foi utilizada para monitorar a temperatura corporal no presente estudo devido ao pequeno tamanho do filhote.

2. Aquisição e análise ecocardiográfica de imagens

1. Realizar ecocardiografia transtorácica utilizando um instrumento ecocardiográfico equipado com um transdutor de matriz linear a 40 MHz para o modo B e a 32 MHz para Doppler (taxa de quadros 233) (ver Tabela de Materiais), seguindo protocolos de ecocardiografia de camundongos adultos^7,8,9.
2. Evite colocar pressão excessiva na cavidade torácica do filhote ao colocar o transdutor de eco durante a aquisição da imagem ecocardiográfica.
   NOTA: Devido ao pequeno tamanho do filhote, o peso do próprio transdutor pode resultar em função cardíaca alterada ou morte.
3. Capture a visão PLAX da via de saída do ventrículo esquerdo e do átrio esquerdo.
   1. Coloque o transdutor no suporte, com a marca de índice em direção ao ombro direito do filhote.
   2. Abaixe o transdutor até que ele esteja em contato com o gel e visualize a via de saída do ventrículo esquerdo no modo B (Figura 2A).
   3. Utilizar o modo-M nos folhetos aórticos para medir o diâmetro máximo do átrio esquerdo (AE) na sístole final (Figura 2B, Tabela 1). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
4. Capture a visão PSAX do ventrículo esquerdo para medir as dimensões da câmara, a espessura da parede, o fluxo aórtico e o fluxo pulmonar.
   1. Gire o transdutor ~90° no sentido horário do PLAX para obter a visualização PSAX.
   2. Colocar a sonda ao nível dos músculos papilares e utilizar o modo-M para medir os diâmetros internos do ventrículo esquerdo (IDVE), a espessura do septo interventricular (IVS) e a PP durante a sístole e a diástole (Figura 3A, Tabela 1). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
   3. Calcule o RWT, um índice de hipertrofia, utilizando as dimensões da câmara diastólica da seguinte^{forma 3,10}:
      (PW + IVS no final da diástole) / (LVID no final da diástole)
   4. Mova o transdutor em direção à base do coração e use o Doppler colorido para visualizar a artéria pulmonar. Pressione o Doppler PW para quantificar a velocidade de pico de fluxo pulmonar, os perfis de fluxo pulmonar, o tempo de ejeção pulmonar (PET) e o tempo de aceleração pulmonar (PAT)^11,12 (Figura 3B). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
   5. Mova o transdutor ainda mais em direção à base e use o Doppler colorido para visualizar o fluxo aórtico (Figura 3C). Use o Doppler PW para visualizar o fluxo sanguíneo e medir o tempo de ejeção aórtica (AET). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
   6. Calcule-se o Vcf (circ/seg)^13,14, um indicador de desempenho miocárdico^, utilizando a diástole final da IDVE (DDVEd), a sístole final da IDVE (DDVEs) e a AET da seguinte forma (Tabela 1):
      (LVIDd - LVIDs) / (LVIDd x AET)
5. Capture a visão apical de quatro câmaras.
   1. Coloque a plataforma na posição de Trendelenburg, incline-a para a esquerda e ajuste a sonda para visualizar as quatro câmaras (Figura 4A).
   2. Use Doppler colorido para visualizar o fluxo sanguíneo e Doppler PW na ponta dos folhetos da valva mitral no centro do orifício da valva mitral para registrar o fluxo mitral. Pressione o Cine Store para registrar os dados.
   3. Nesta visualização, calcule os seguintes parâmetros ^2,3,10 (Figura 4B e Tabela 1):
      1. Calcule a relação E/A, que é a velocidade máxima do fluxo sanguíneo na fase inicial da diástole (E) sobre a velocidade máxima do fluxo sanguíneo na fase tardia da diástole (A).
      2. Determine o tempo de desaceleração da onda E (DT), que é o tempo do pico E até o final da diástole inicial.
      3. Calcule o tempo de relaxamento isovolumétrico do VE (IVRT), que é o tempo desde o fechamento da válvula aórtica até a abertura da válvula mitral.
      4. Calcule o tempo de contração isovolumica do VE (TCIV), que é o tempo desde o fechamento da valva mitral até a abertura da valva aórtica.
   4. Utilizar o Doppler tecidual no lado septal do anel valvar mitral em uma visão de quatro câmaras para medir o pico da velocidade de relaxamento miocárdico no enchimento diastólico precoce (e') e no enchimento diastólico tardio (a'), bem como o pico de velocidade de contração miocárdica sistólica (s') (Figura 4C e Tabela 1). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
6. Capture a visão PLAX modificada para examinar a artéria coronária descendente anterior esquerda.
   1. Use uma visão PLAX^{modificada 15}, movendo o transdutor lateralmente e inclinando o feixe em direção à anterior (Figura 5A).
   2. Mova a sonda e use o Doppler colorido para visualizar a origem da artéria coronária principal esquerda (ACV) que gera a partir da aorta. Identificar a artéria LAD que gera a partir da ACL e corre entre a parede anterior do ventrículo esquerdo e a via de saída do ventrículo direito^16,17. Nesta posição, aplique o Doppler PW para medir o fluxo de LAD (Figura 5B). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
   3. Calcule os seguintes parâmetros de fluxo da artéria coronária LAD (Figura 5C e Tabela 2): velocidade máxima do fluxo coronariano (CFV), CFV média e integral velocidade-tempo (VTI).
      NOTA: Todos estes parâmetros são medidos a uma concentração basal de isoflurano de 1,5% (linha de base).
   4. Aumente a concentração de isoflurano para 2,5% e aguarde 5 min para atingir o fluxo máximo (Figura 5C). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados. Calcule a CFR como a razão entre a CFV de pico diastólico no fluxo máximo e a CFV de pico diastólico no início^{do estudo 18,19,20} (Tabela 2):
      CFR = CFV pico diastólico (2,5%) / CFV pico diastólico (1,5%)

3. Monitorização e cuidados pós-imagiologia dos animais

1. Depois de completar a imagem ecocardiográfica, limpe cuidadosamente o filhote e deixe-o se recuperar da anestesia por aproximadamente 2 min.
2. Antes de devolver o filhote à sua gaiola, esfregue o filhote com a cama da mãe da gaiola para evitar a rejeição ou canibalização.
3. Observe o comportamento da mãe por cerca de 30 minutos após o procedimento. Se for observado um comportamento agressivo, eutanasie o filhote seguindo as diretrizes do procedimento animal.

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Resultados

Este estudo utilizou filhotes de camundongos de 7 dias de idade para caracterizar a morfologia cardíaca, a função e o fluxo da artéria coronária. O manuseio do mouse precisa ser feito com cuidado, e a plataforma do mouse deve ser adaptada para o pequeno tamanho dos filhotes, conforme descrito na Figura 1. Uma imagem representativa da visualização PLAX é mostrada na Figura 2A e no Vídeo Suplementar 1. Nessa visão, o modo M foi utilizado...

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Discussão

Na era da medicina preventiva, a avaliação precoce das alterações na função cardiovascular é necessária para estabelecer o início da doença e projetar terapias intervencionistas apropriadas. Os ratos estão sendo cada vez mais usados como modelos pré-clínicos em pesquisas cardíacas, e os estudos ecocardiográficos são tipicamente conduzidos com camundongos adultos jovens. No entanto, para estudar o papel das alterações genéticas ou intervenções farmacológicas nos estágios iniciais das doenças cardí...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilating agent	Nair Hair Remover
Electrode gel	Parker Laboratories	15-60
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
Isoflurane	MedVet	RXISO-250
Linear array high frequency transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS550D
Mice breeding pair	Charles River Laboratories	FVB/N	Strain Code 207
Ultrasound Gel	Parker Laboratories	11-08
Vevo Lab Software	FUJIFILM VisualSonics, Inc.		Verison 5.5.1