Microscopia Confocal para medir três modos de dinâmica de poros de fusão em células adrenal chromaffin

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica de imagem confocal para detectar três modos de fusão em células adrenals de chromaffin bovinas. Esses modos de fusão incluem 1) close-fusion (também chamado de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) stay-fusion, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento vesícula fundido.

Resumo

Abertura dinâmica de poros de fusão e fechamento mediam exocitese e endocitose e determinam sua cinética. Aqui, é demonstrado em detalhes como a microscopia confocal foi usada em combinação com a gravação de grampo de remendo para detectar três modos de fusão em células adrenal adrenal de cultura primária. Os três modos de fusão incluem 1) fusão de perto (também chamada de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) estadia-fusão, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento do perfil de forma Ω gerada por fusão até que se funda completamente na membrana plasmática.

Para detectar esses modos de fusão, a membrana plasmática foi rotulada pela superexpressão mNeonGreen anexada ao domínio PH de fosfolipase C δ (PH-mNG), que se liga ao fosfaticicylinositol-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P₂) no folheto voltado para o citosol da membrana plasmática; vesículas foram carregadas com o falso neurotransmissor fluorescente FFN511 para detectar a liberação de conteúdo vesicular; e Atto 655 foi incluído na solução de banho para detectar o fechamento de poros de fusão. Estas três sondas fluorescentes foram imagens simultaneamente a ~20-90 ms por quadro em células de cromaffin ao vivo para detectar abertura de poros de fusão, liberação de conteúdo, fechamento de poros de fusão e mudanças de tamanho vesícula. O método de análise é descrito para distinguir três modos de fusão dessas medidas de fluorescência. O método aqui descrito pode, em princípio, aplicar-se a muitas células secretas além das células cromafinas.

Introdução

A fusão de membranas media muitas funções biológicas, incluindo transmissão sináptica, homeostase de glicemia, resposta imune e entrada viral ^1,2,3. A excitose, envolvendo a fusão vesícula na membrana plasmática, libera neurotransmissores e hormônios para alcançar muitas funções importantes, como atividades da rede neuronal. Fusion abre um poro para liberar conteúdo vesicular, após o qual o poro pode fechar para recuperar a vesícula fusível, que é chamada de beijo e fuga ^1,4. Tanto a abertura irreversível quanto a reversível dos poros de fusão podem ser medidas com gravações de capacitância ligadas a células combinadas com gravações de conduance de poros de fusão de fusão única de fusão vesícula.

Isso é frequentemente interpretado como reflexo da fusão de colapso total, envolvendo a dilatação da fusão até o achatamento da vesícula fusível, e beijo-e-fuga, envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, respectivamente 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Estudos recentes de esgotamento de emissões confocal e estimulados (STED) em células cromafina observaram diretamente abertura e fechamento de poros de fusão (beijo-e-fuga, também chamada de fusão estreita), abertura de poros de fusão que mantém uma forma de Ω com um poro aberto por um longo tempo, denominada fusão de estadia, e encolhimento da vesícula fusória até que se funda com a membrana plasmática, que substitui a fusão de colapso total para a fusão de vesículas fusíveis com a membrana plasmática^4, 8,14,15,16,17.

Nos neurônios, a abertura e o fechamento de poros de fusão foram detectados com imagens mostrando a liberação de pontos quânticos pré-carregados em vesículas maiores que o poro de fusão e com medições de condutância de poros de fusão na face de liberação dos terminais nervosos ^5,18,19. As células cromafinas adrenal são amplamente utilizadas como modelo para o estudo da exo-e endocitose^20,21. Embora as células cromatofinas contenham grandes vesículas densas, enquanto as sinapses contêm pequenas vesículas sinapáticas, as proteínas excitose e endocitose em células cromafinas e sinapses são bastante análogas 10,11,12,20,21,22,23.

Aqui, um método é descrito para medir esses três modos de fusão usando um método de imagem confocal combinado com eletrofisiologia em células adrenal chromaffin bovina (Figura 1). Este método envolve o carregamento de falsos neurotransmissores fluorescentes (FFN511) em vesículas para detectar exocitose; adição de Atto 655 (A655) na solução de banho para preencher o perfil de forma Ω gerado pela fusão, e rotulagem da membrana plasmática com o domínio PH de fosfolipase C δ (PH), que se liga a PtdIns(4,5)P₂ na membrana plasmática ^8,15,24. A dinâmica dos poros de fusão pode ser detectada através de alterações em diferentes intensidades fluorescentes. Embora descrito para células cromafinas, o princípio deste método descrito aqui pode ser amplamente aplicado a muitas células secretary muito além das células cromafinas.

Protocolo

NOTA: O procedimento de uso animal seguiu as diretrizes do NIH e foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIH.

1. Cultura celular cromafina bovina

1. Prepare a solução do Locke (Tabela 1) e as ferramentas de autoclave 1 dia antes da cultura celular cromafina.
2. Obtenha glândulas adrenal bovinas de um matadouro local no dia da cultura, e mantenha-as submersas na solução gelada de Locke antes da dissecação.
   NOTA: As glândulas suprarrenais são de 21-27 meses de idade, saudável, angus preto de ambos os sexos (principalmente masculino) com peso corporal em torno de 1.400 libras (~635 kg).
3. Prepare 30 mL (para 3 glândulas suprarrenais) de solução de enzima fresca contendo colagenase P, inibidor de trippsina e albumina de soro bovino (Tabela 1) antes da dissecção e mantenha-a à temperatura ambiente.
4. Escolha 3 glândulas intactas sem cortes ou sangramentos na superfície e remova o tecido adiposo com uma tesoura (Figura 1A). Lave as glândulas por perfusão com a solução de Locke até que não saia sangue. Para isso, infle a glândula através da veia adrenal (Figura 1B) usando uma seringa de 30 mL anexada com um filtro de 0,22 μm quantas vezes necessário²⁵.
   NOTA: Aproximadamente 150 mL da solução locke geralmente é necessário para lavar 3 glândulas.
5. Para digestão, injete a solução enzimática através da veia adrenal usando uma seringa de 30 mL anexada com um filtro de 0,22 μm até que a glândula comece a inchar. Em seguida, deixe as glândulas a 37 °C por 10 min. Injete mais uma vez e deixe as glândulas a 37 °C por mais 10 minutos.
   NOTA: Aproximadamente 30 mL de solução enzimápica são necessários para digerir 3 glândulas.
6. Após a digestão, corte a glândula longitudinalmente da veia para a outra extremidade com uma tesoura para desdobrar a glândula (Figura 1C). Isole a medula, tweezing a medula branca em uma placa de Petri de 10 cm contendo a solução de Locke.
   NOTA: A comparação do interior da glândula antes e depois da digestão é mostrada na Figura 1C. Os detalhes da digestão e isolamento da medula são relatados anteriormente^23,25.
7. Corte e pique a medula em pequenos pedaços com tesoura (Figura 1D). Filtre a suspensão da medula com uma malha de nylon de 80-100 μm em um béquer. Em seguida, transfira o filtrado para um tubo cônico de 50 mL para centrifugação a 48 × g, temperatura ambiente, por 3 minutos com desaceleração de 3.
   NOTA: O picar o medullae geralmente leva ~10 min. Para obter um bom rendimento de células, as peças picadas devem ser muito pequenas, até que não possam ser tweezed up.
8. Após a centrifugação, remova o supernascedor e resuspenque a pelota celular com a solução de Locke por pipetação. Filtre a suspensão celular com um coador de 80-100 μm e centrífuga a 48 x g, temperatura ambiente, por 3 minutos com desaceleração de 3.
9. Remova o supernatante e resuspense a pelota celular com 30 ml de meio de cultura (Tabela 1). Determine o número da célula usando as câmaras de contagem de hemacítmetros²⁵.

2. Transfecção com eletroporação

1. Transfira 2,8 × 10⁶ células para um tubo de 15 mL. Pelota as células por centrifugação a 48 × g por 2 min com desaceleração de 3. Adicione 100 μL de tampão de transfecção (ver a Tabela de Materiais) fornecida pelo fabricante à pelota celular e, em seguida, adicione 2 μg do plasmídeo PH-mNG.
   NOTA: O plasmídeo PH-mNG foi criado substituindo a proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) por mNG em PH-EGFP¹⁵ (ver a Tabela de Materiais).
2. Misture suavemente a suspensão ao escoar a solução para cima e para baixo, e transfira a mistura para um cuvette de eletroporação sem demora (Figura 1E). Transfira imediatamente o cuvette para o eletroporador (veja a Tabela de Materiais), selecione o programa O-005 na lista de tela e pressione Enter para realizar a eletroporação.
   NOTA: Prepare a suspensão da célula para transfecção em uma capa de cultura celular. Não introduza bolhas de ar na suspensão durante a etapa de mistura. Prossiga para o próximo passo sem demora.
3. Após a eletroporação, adicione 1,8 mL de meio imediatamente ao cuvette e misture suavemente com um micropipettor equipado com uma ponta estéril. Em seguida, adicione 300 μL da suspensão das células eletroporadas em cima do deslizamento (ver a Tabela de Materiais) em cada prato, emplacando 5-6 pratos no total para uma reação de eletroporação.
4. Transfira cuidadosamente os pratos para uma incubadora umidificada a 37 °C com 9% de CO₂ por 30 min, e adicione suavemente 2 mL de meio pré-enlatado a cada prato após 30 min.
5. Mantenha as células transfeinadas na incubadora umidificada a 37 °C com 9% de CO₂ durante 2-3 dias antes do experimento.
   NOTA: As células cultivadas durarão uma semana. É melhor usar células cultivadas nos dias 2-3.

3. Preparação para gravação de grampos e imagens confocal

NOTA: Este protocolo foi realizado com um microscópio confocal de varredura a laser e amplificador de grampo de remendo com gravação de tensão-grampo juntamente com um amplificador de travamento para gravação de capacitância. Uma imagem confocal de plano XY em um plano Z fixo (digitalização_fixa XY/Z) foi usada para fotografar todos os três sinais fluorescentes simultaneamente. O plano Z estava focado no fundo da célula onde a membrana plasmática estava aderindo às tampas.

1. No dia do patch-clamp e experimento de imagem, observe as células sob um microscópio de fluorescência. Use o campo brilhante para garantir que a cultura celular não esteja contaminada (Figura 1F) e epifluorescência para verificar se há uma expressão adequada da proteína com marca fluorescente.
   NOTA: Por exemplo, PH-mNG é expresso na membrana plasmática de ~20-30% das células.
2. Prepare pipetas de remendo de capilares de vidro borossilicato. Para isso, puxe as pipetas com um puxador de pipeta, cubra suas pontas com cera líquida e poli-as com um microforge (veja a Tabela de Materiais).
3. Ligue o amplificador de gravação de grampo de remendo e inicie o software de gravação de grampo de correção (veja a tabela de materiais). Defina os parâmetros apropriados para a gravação de corrente de cálcio e capacitância no software (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Defina um protocolo de gravação de 60 s de duração total, onde a estimulação começa em 10 s.
   2. Defina o potencial de retenção para gravação do grampo de tensão para -80 mV. Defina uma despolarização de 1 s de -80 mV para 10 mV como o estímulo para induzir o fluxo de cálcio e o salto de capacitância.
   3. Para medições de capacitância, defina a frequência do estímulo sinusoidal para uma faixa de 1.000-1.500 Hz com uma tensão de pico a pico de no máximo 50 mV.
4. Salve o protocolo e crie um novo arquivo para gravação.
5. Ligue o sistema de microscópio confocal e defina os parâmetros apropriados no software (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Ligue os lasers, incluindo 458 nm, 514 nm e 633 nm, e defina a faixa de coleta de emissões para cada laser de acordo com cada sonda de fluorescência como no seguinte. FFN511: comprimento de onda de excitação (EX), 458 nm; comprimento de onda de emissão (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
   2. Use imagens sequenciais para FFN511 e mNG para evitar o crosstalk entre essas duas sondas. Defina um timelapse de 1 minuto de duração para gravação de imagem (Figura 1G).

4. Gravação de grampo de remendo e imagem confocal

1. Escolha um prato com bom estado celular e expressão adequada e adicione 2 μL de neurotransmissor falso fluorescente FFN511 (estoque de 10 mM, solução de trabalho de 1:1.000) no meio. Coloque o prato de volta na incubadora por 20 minutos. Alternativamente, carregue FFN511 após a etapa 3.2 e execute as etapas 3.3-3.5 enquanto espera para economizar tempo.
2. Após o carregamento FFN511 concluído, prepare a câmara de gravação e adicione 2 μL de corante fluorescente A655 em 500 μL da solução de banho (Figura 2A e Tabela 1). Transfira o deslizamento do prato para a câmara de gravação (veja a tabela de materiais) com pinças e adicione imediatamente a solução de banho contendo A655 (Figura 2B).
   NOTA: O A655 é mantido em -20 °C com concentração de 10 mM e a concentração de trabalho é de 40 μM.
   ATENÇÃO: Use luvas para evitar contato direto com a pele com FFN511 ou A655.
3. Coloque uma gota de óleo (índice de refração: 1.518; consulte a Tabela de Materiais) no objetivo de imersão de óleo 100x (Abertura Numérica = 1,4). Monte a câmara no microscópio e use o botão de ajuste para fazer com que o óleo entre em contato com a parte inferior do deslizamento de cobertura, depois mergulhe a ponta do fio moído na solução do banho (Figura 2C, D).
   NOTA: Escolha um óleo de imersão apropriado para trabalhar em temperatura ambiente. Alternar entre a lente de baixa e alta ampliação é desnecessário. A temperatura ambiente é mantida em torno de 20-22 °C durante a gravação.
4. Leve as células ao foco e use imagens brightfield e confocal para encontrar uma boa célula com expressão mNG. Amplie a célula selecionada e ajuste-a para o centro da vista para minimizar regiões em branco.
   NOTA: O desenho esquemático da rotulagem de fluorescência é mostrado na Figura 3A. Uma boa célula geralmente tem uma membrana lisa e borda limpa (Figura 3B). Com epifluorescência ou imagem confocal, uma boa célula parece ter um fundo grande e plano com expressão mNG brilhante (Figura 3C).
   O tamanho do pixel é de ~50 nm, dentro de um alcance de ~40-80 nm de acordo com diferentes tamanhos de célula e fator de zoom.
5. Configure parâmetros para imagens confocal de plano XY em um plano Z fixo (digitalização_fixa XY/Z) de FFN511, PH-mNG e A655, com um intervalo de tempo minimizado. Ajuste o foco na parte inferior da célula com o botão de ajuste fino.
   NOTA: PH-mNG sinaliza o contorno da membrana plasmática celular na seção confocal XY-plano (exceto o fundo da célula). Perto do fundo da membrana celular, podem ser observadas manchas A655, que refletem invaginações de membrana em forma de Ω ou Λ. Se o plano Z-focal for menor que o fundo da célula, a intensidade de toda a fluorescência ficará mais fraca.
6. Ajuste a potência do laser de excitação no software para encontrar uma configuração para obter a melhor relação sinal-ruído e evitar branqueamento significativo de fluorescência. Para isso, comece com um valor inicial de teste de 2,5 mW de potência para FFN511 animado em 458 nm e 1 mW para mNG animado em 514 nm. Para A655 animado a 633 nm com um laser HeNe, use alta potência laser, ~12-15 mW (ou seja, 70%-80% do máximo), que, após excitação contínua, pode branquear todo o A655 fluorescente dentro de um perfil de Ω-forma quando seu poro está fechado.
   NOTA: Se a potência do laser for muito alta, a fluorescência PH-mNG e FFN511 será branqueada rapidamente. Se a potência do laser estiver muito baixa, os sinais serão muito fracos ou barulhentos para serem analisados.
7. Adicione 9 μL de solução interna (Tabela 1) em uma pipeta de remendo e conecte a pipeta ao suporte no estágio do amplificador de grampo de correção (veja a tabela de materiais).
8. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva com uma seringa e mova a ponta da pipeta para tocar a solução de banho com um micromanipulador. Certifique-se de que o amplificador mostra que a resistência à pipeta é ~2-4 MΩ com um teste de pulso de tensão. Pressione LJ/Auto para cancelar a junção líquida.
9. Mova a pipeta para a célula selecionada com o micromanipulador. Para formar um modo conectado à célula, mova a ponta da pipeta para tocar a célula (a resistência aumentará); aplicando pressão negativa suavemente com a seringa (a resistência aumentará para mais de 1 GΩ), alterando o potencial de exploração de 0 para -80 mV.
10. Uma vez que a resistência passe 1 GΩ, espere ~30 s para que a configuração se estabilize. Pressione C-fast/Auto para compensar a capacidade rápida.
11. Para formar um modo de célula inteira, aplique pressão negativa curta e poderosa pulsada com a seringa para romper a membrana (a forma do pulso atual muda com um capacitor de membrana carregado e descarregado). Pressione C-slow/Auto para compensar a capacidade lenta.
12. Ajuste o foco de imagem ligeiramente para se concentrar na parte inferior da célula. Inicie a gravação de imagens de timelapse confocal e patch-clamp simultaneamente clicando nos botões Iniciar nos dois aplicativos de software diferentes ao mesmo tempo.
    NOTA: O software de imagem confocal faz um filme a uma taxa de ~20-90 ms/frame. A gravação do grampo de remendo inclui o estado de repouso para 10 s, a estimulação de despolarização de 1 s e um adicional de 49 s após a estimulação. A configuração do grampo permite o registro da corrente de cálcio, salto de capacitância e decomposição induzido pela despolarização de 1 s de -80 a +10 mV (Figura 3D).
13. Uma vez que a gravação esteja concluída, certifique-se de que os dados sejam salvos. Mude o potencial de retenção para 0 mV. Tire a pipeta da solução do banho e descarte-a.
14. Repita as etapas 4.7-4.13 para gravar outra célula no prato. Depois de 1h de gravação, mude para outro prato para gravação.
    NOTA: Após 1h de gravação, a taxa de sucesso da gravação de patch-clamp diminui significativamente. Para aumentar a eficiência da coleta de dados, o registro por apenas 1h é recomendado em cada prato.

5. Análise de dados de patch-clamp

1. Abra software apropriado (consulte a Tabela de Materiais) para análise de dados. Clique no | PPT Carregar | de arquivo PULSE Botões de arquivo para carregar o arquivo .dat. Clique em Fazê-lo e quatro traços serão plotados em um gráfico automaticamente, incluindo os traços de corrente de cálcio e capacitância.
2. Clique no | do Windows Novos botões gráficos , escolha o Pulse_1_1_1, a primeira onda em Y Wave(s) e clique em Fazê-lo para traçar o gráfico de corrente de cálcio. Clique no | do Windows Novos botões de tabela , escolha o Pulse_1_1_1 e clique em Fazê-lo para mostrar os dados brutos da corrente de cálcio, que poderiam ser usados para traçar o traço médio de múltiplas células.
3. Desenhe um quadrado de acordo no gráfico de corrente de cálcio, clique com o botão direito do mouse e expanda o sinal atual para incluir a linha de base e o pico de corrente de cálcio. Clique em gráfico | Mostre informações para mostrar os cursores A e B e movê-los para a linha de base e pico, respectivamente. As informações do gráfico serão mostradas na parte inferior e os parâmetros podem ser estimados.
4. Repita o passo 5.2, mas escolha o Pulse_1_1_1_Cm, a segunda onda em Y Wave(s), para traçar o traço de capacitância. Repita os passos 5.3 e coloque os cursores A e B na posição apropriada para medir os parâmetros de capacitância, como linha de base, amplitude e taxa de decomposição.
5. Copie dados brutos na etapa 5.2 em uma planilha, calcule o erro médio e padrão de média para um grupo de células registradas e plote os traços médios de corrente de cálcio e capacitância de membrana (Figura 3E) em um software apropriado.

6. Análise de dados de imagem confocal

1. Abra os arquivos de imagem bruto com qualquer software fornecido pelo fabricante (consulte a tabela de materiais).
   NOTA: Alguns outros programas gratuitos, como ImageJ ou Fiji, poderiam ser utilizados para o processamento de dados e quantificação das imagens obtidas na seção 4.
2. Clique em process | Processetos e use as ferramentas para gerar arquivos de média de rolamento (por exemplo, média de rolamento para cada 4 imagens) para cada imagem timelapse e salvar esses arquivos.
   NOTA: Após a média de rolamento, o ajuste adequado do brilho e do fundo poderia ser feito para mostrar melhor as mudanças de fluorescência de três canais, o que pode ajudar a identificar eventos de fusão. Verifique a intensidade fluorescente em algumas regiões sem evento de fusão pode ajudar a distinguir o sinal fluorescente de eventos de fusão de sinais de fundo.
3. Clique nos botões Quantify | Ferramentas | Stack Profile, verifique os pontos de tempo antes e depois da estimulação para identificar alterações de fluorescência em cada canal. Clique no botão Draw elipse para circular as regiões de interesse (ROIs) para eventos de fusão. Clique com o botão direito do mouse na imagem e clique em Salvar ROIs para salvar os ROIs.
   NOTA: O tamanho do ROI, que cobre todos os três sinais fluorescentes, foi semelhante com o tamanho da vesícula nas células^{croomaffin 24}. Os dados brutos foram utilizados para a análise, enquanto os dados de média de rolamento que aumentam a relação sinal-ruído foram fornecidos para mostrar claramente os três sinais.
4. Clique em Criar projetos para localizar o arquivo bruto, clique com o botão direito do mouse na imagem e clique em Carregar ROIs para carregar o arquivo ROI nos arquivos de imagem bruta para medir as intensidades de fluorescência.
   NOTA: O sinal fluorescente bruto será usado para traçar traços de diferentes canais. Para cada ROI, a linha de base é definida como a intensidade antes da estimulação, e os traços de intensidade podem ser normalizados à linha de base.
5. Clique em Ferramentas | Classifique ROIs no software e plote os traços para os três canais de cada ROI. Clique em Reportar para salvar os dados do ROI, incluindo dados digitais e rastreamentos de imagem para cada ROI, em uma pasta de arquivos.
   1. Identifique um evento de fusão pelo aumento simultâneo na intensidade da fluorescência spot PH-mNG (F_PH) e_{A655 (F 655}) (dentro de um único quadro), acompanhada de uma diminuição na fluorescência spot FFN511 (F_FFN).
   2. Procure o aparecimento de F_PH e F₆₅₅, o que indica a formação de manchas PH-mNG/A655 devido a um perfil de Ω gerado pela fusão, permitindo a difusão de PH-mNG da membrana plasmática e difusão persistente de A655 do banho.
   3. Procure por f_ffn diminuição, que indica sua liberação de uma vesícula devido à abertura de poros de fusão e exclui a possibilidade de que f_ph e f₆₅₅ aparência pode ser de invaginação de membrana causada por endocitose.
   4. Inspecione as imagens_fixas timelapse XY/Z que mostram eventos de fusão acontecendo na parte inferior da célula. Analise três modos de eventos de fusão: 1) fusão próxima, 2) stay-fusion e 3) shrink-fusion.
      NOTA: Eventos de fusão raramente eram observados antes da despolarização, enquanto dezenas de eventos de fusão podiam ser observados após a despolarização. Após a fusão, o perfil de Ω pode fechar seu poro, manter seu poro aberto ou encolher para se fundir na membrana plasmática.
      1. Para identificar a fusão próxima, procure o escurecimento F₆₅₅ porque o fechamento de poros de fusão impede a troca de banho A655, enquanto f_PH sustenta, refletindo a conversão contínua de PtdIns(4,5)P₂ em PtdIns(4)P, ou F_PH decai com um atraso, refletindo a pinça-off vesícula (close-fusion, Figura 4A,B).
      2. Procure por F_PH e F₆₅₅ sustentados para identificar a fusão de estadia (Figura 4C).
      3. Procure por reduções paralelas de F_PH e F₆₅₅, indicando Ω-perfil de encolhimento para identificar a fusão de encolhimento (Figura 4D).
         NOTA: Verifique os arquivos de imagem originais para inspecionar os traços de imagem se não houver certeza do tipo de evento. Verificar a intensidade fluorescente em algumas regiões sem evento de fusão pode ajudar a distinguir o sinal fluorescente de eventos de fusão dos sinais de fundo.
6. Traços representativos de mudanças de intensidade para esses três canais: FFN511, PH-mNG e A655. Quantifique a porcentagem de diferentes modos de fusão em cada célula e figuras de enredo.

Resultados

Seguindo os procedimentos experimentais mostrados na Figura 1 e Figura 2, as células cromafinas das glândulas suprarrenais bovinas foram transfectadas com PH-mNG para rotular a membrana plasmática; O A655 foi adicionado à solução de banho para detectar o fechamento dos poros de fusão; e o falso neurotransmissor fluorescente FFN511 foi carregado em vesículas para detecção de liberação. Em seguida, a imagem de timelapse confocal de plano XY de FFN511, ...

Discussão

Um método de imagem microscópica confocal é descrito para detectar a dinâmica da liberação de poros de fusão e transmissor, bem como três modos de fusão, fusão de perto, fusão de estadia e redução de fusão em células adrenal^{rnafina bovina 4,24}. Um método eletrofisiológico para despolarizar a célula e, assim, evocar exo-e endocitose é descrito. O processamento sistemático de imagens confocal fornece informações sobre diferentes modos de compo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187-500MG	ATP for preparing internal solution
Atto 655	ATTO-TEC GmbH	AD 655-21	Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons	Lonza	VSPI-1003	Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette	Warner Instruments	64-0795	Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G	Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M	Quality Biological	351-130-721	Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm	Falcon	352360	Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution	Sigma	232041	Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P	Sigma	11213873001	Enzyme for gland digestion
Coverslip	Neuvitro	GG-14-Laminin	GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885092	Reagent for preparing culture medium
EGTA	Sigma	324626-25GM	Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector	Amaxa Biosystems	Nucleofector II	Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10082147	Reagent for preparing culture medium
FFN511	Abcam	ab120331	Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877-250MG	GTP for preparing internal solution
HEPES	Sigma	H3375-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software	Leica	LAS X software	Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope	Leica	Leica TCS SP5	Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid	Sigma	49449-100G	Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier	Heka	Lock-in	Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M	Quality Biological	351-033-721EA	Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line	Hausser Scientific	3120	Counting chamber
Microforge	Narishige	MF-830	Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Millipore	SLGPR33RB	Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)	Allele Biotechnology	ABP-FP-MNEONSB	Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron	EIKO filtering co	03-100/32	Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10	Heka	EPC-10	Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP	Addgene	Plasmid #51407	Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller	Sutter Instrument	P-97	Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride	Sigma	P5404-500G	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software	Heka	Pulse	Software for patch-clamp data collection
Recording chamber	Warner Instruments	64-1943/QR-40LP	coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride	Sigma	S7653-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S8282-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate	Barnsted/Thermolyne	type 10100	Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL	Becton Dickinson	302832	Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride	Sigma	T2265-100G	TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor	Sigma	T9253-5G	Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid	Leica	195371-10-9	Leica confocal mounting oil