Imagem Biomolecular da Captação Celular de Nanopartículas utilizando Microscopia Óptica Multimodal Não Linear

Resumo

Este artigo apresenta a integração de um módulo de focalização espectral e um laser de pulso de dupla saída, permitindo imagens hiperespectrais rápidas de nanopartículas de ouro e células cancerígenas. Este trabalho tem como objetivo demonstrar os detalhes de técnicas ópticas não lineares multimodais em um microscópio de varredura a laser padrão.

Resumo

Sondar nanopartículas de ouro (AuNPs) em sistemas vivos é essencial para revelar a interação entre AuNPs e tecidos biológicos. Além disso, ao integrar sinais ópticos não lineares, como espalhamento Raman estimulado (SRS), fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) e absorção transitória (TA) em uma plataforma de imagem, ele pode ser usado para revelar o contraste biomolecular de estruturas celulares e AuNPs de maneira multimodal. Este artigo apresenta uma microscopia óptica não linear multimodal e a aplica para realizar imagens quimicamente específicas de AuNPs em células cancerígenas. Essa plataforma de imagem fornece uma nova abordagem para desenvolver AuNPs funcionalizadas mais eficientes e determinar se elas estão dentro de vasculaturas ao redor dos espaços tumoral, pericelular ou celular.

Introdução

As nanopartículas de ouro (AuNPs) mostraram grande potencial como sondas de imagem biocompatíveis, por exemplo, como substratos eficazes de espectroscopia Raman aprimorada por superfície (SERS) em várias aplicações biomédicas. As principais aplicações incluem campos como biossensoriamento, bioimagem, espectroscopias aprimoradas de superfície e terapia fototérmica para o tratamento do câncer¹. Além disso, sondar AuNPs em sistemas vivos é crucial para avaliar e entender a interação entre AuNPs e sistemas biológicos. Existem várias técnicas analíticas, incluindo espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) 2, espectrometria de massa indutivamente acoplada à ablação a laser (LA-ICP-MS)³ e ressonância magnética (MRI)⁴ que têm sido usadas com sucesso para investigar a distribuição^de AuNPs em tecidos. No entanto, esses métodos sofrem de várias desvantagens, como ser demorado e envolver o preparo complexo da amostra³, exigindo longos tempos de aquisição, ou a falta de resolução espacial sub-mícron ^2,4.

Em comparação com as técnicas de imagem convencionais, a microscopia óptica não linear oferece várias vantagens para sondar células vivas e AuNPs: a microscopia óptica não linear atinge uma profundidade de imagem mais profunda e fornece capacidade intrínseca de seccionamento óptico 3D com o uso de lasers ultrarrápidos de infravermelho próximo. Com a melhora significativa da velocidade de imagem e da sensibilidade de detecção, a fluorescência excitada de dois fótons (TPEF)^5,6,7 e a microscopia de segunda geração harmônica (SHG)^8,9,10 demonstraram melhorar ainda mais a imagem não invasiva de biomoléculas endógenas em células e tecidos vivos. Além disso, utilizando novas técnicas ópticas não lineares bomba-sonda, como a absorção transitória (AT)11,12,13,14 e o espalhamento Raman estimulado (SRS)^15,16,17,18, é possível derivar o contraste bioquímico livre de rótulo de estruturas celulares e AuNPs. Visualizar AuNPs sem o uso de rótulos extrínsecos é de grande importância, uma vez que as perturbações químicas das nanopartículas modificarão suas propriedades físicas e, portanto, sua absorção nas células.

Este protocolo apresenta a implementação de um módulo Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) para um laser de pulso de comprimento de onda duplo, permitindo imagens multimodais rápidas de AuNPs e células cancerígenas. Este trabalho tem como objetivo demonstrar os detalhes das técnicas integradas de TPEF, TA e SRS em um microscópio de varredura a laser.

Protocolo

1. Ligar o sistema a laser

1. Ligue o sistema de intertravamento e selecione o laser do braço antes de iniciar o sistema.
2. Ligue o PC com o software para controlar o laser de femtossegundo de saída dupla.
3. Carregue o software para o laser de femtossegundo de saída dupla; este software permite que o laser seja ligado e desligado e controla diretamente o comprimento de onda do feixe da bomba.
4. Ative a emissão de laser mantendo pressionado o ícone Energia para uma contagem de 3.
5. Espere até que o laser tenha aquecido e a luz pronta para laser esteja acesa em verde no software.
6. O comprimento de onda do feixe da bomba é controlado diretamente através do software; isso pode variar de 680-1.300 nm. Para imagens celulares na região vibracional C-H Raman, selecione 802 nm.
7. Abra as persianas do feixe da bomba ajustável e do feixe de Stokes de 1.045 nm, mantendo pressionadas as imagens de abertura por 3 s.
   CUIDADO: Orientação de segurança do laser O laser de femtossegundo de saída dupla é um laser pulsado infravermelho classe IV e pode causar danos permanentes à visão. Portanto, todas as regras locais de segurança do laser devem ser seguidas durante a realização deste procedimento: (i) Somente usuários autorizados que receberam treinamento de segurança a laser podem realizar o procedimento. (ii) A entrada no laboratório é feita através de acesso por cartão magnético com uma trava na porta da sala. (iii) Durante a maior parte da operação, os feixes de laser são totalmente fechados. (iv) Quando o feixe de laser é exposto, os óculos de segurança a laser devem ser usados (use os óculos de segurança a laser LG9, que dão bloqueio OD 7+ da bomba e dos feixes Stokes).

2. Ligar a Unidade de Temporização e Recombinação de Focagem Espectral (SF-TRU)

1. Carregue o software ATM no mesmo PC com o software laser, que controla os estágios de atraso e atenuadores a laser na unidade SF-TRU.
   NOTA: Esta unidade é responsável por garantir que a bomba e os feixes de Stokes estejam espacialmente sobrepostos, controlando a dispersão na bomba e nos feixes de Stokes e controlando o atraso de tempo entre a bomba e os feixes de Stokes. A polarização dos feixes da bomba e de Stokes é vertical. Observe que cada feixe é equipado com uma placa de meia onda para controlar independentemente as polarizações antes de sair do SF-TRU.
2. Certifique-se de que os lasers da bomba e de Stokes sejam atenuados para <10% (bomba) e <15% (feixes de Stokes). Se os feixes não forem atenuados, a potência do laser pode causar danos ao sistema e queimará amostras biológicas.
3. Para imagens celulares, defina as configurações ideais do laser para 6% (bomba) e 10% (Stokes), correspondendo a 12 mW e 30 mW na amostra.
4. O SF-TRU tem duas configurações: modo femtosegundo (fs) e modo picossegundo (ps).
5. Para o modo fs, empurre os botões em ambos os lados da caixa (isso remove as grades de dispersão do caminho do feixe).
6. Para o modo ps, puxe os botões de ambos os lados da caixa (isso coloca as grades de dispersão no caminho do feixe).
7. Para imagens hiperespectrais, selecione o modo ps.
8. Certifique-se de que o estágio de atraso esteja na posição correta para que a bomba e os feixes de Stokes sejam sobrepostos temporalmente para imagens C-H neste sistema.
9. Certifique-se de que as configurações de dispersão da bomba e do feixe de Stokes estejam corretas; para uma bomba de 802 nm, isto é de 5 mm para o feixe da bomba e de 30 mm para o feixe de Stokes.

3. Modulando o feixe de Stokes para imagens SRS

1. Para a detecção de SRS, module a intensidade do feixe de Stokes.
2. Ligue o gerador de sinal para a modulação do feixe.
3. Recupere as configurações anteriores, que são as seguintes:
   SAÍDA 1: Onda quadrada: Frequência = 19,5 MHz, Amplitude = 1,4 V.
   SAÍDA 2: Onda quadrada: Frequência = 19,5 MHz, Amplitude = 300 mV.
4. Ative as saídas 1 e 2.
5. Conecte a saída 1 a um amplificador para o EOM na caixa SF-TRU através de um cabo BNC.
6. Conecte a saída 2 ao amplificador de bloqueio usado para detecção de SRS através de um cabo BNC.
7. Ligue a fonte de alimentação do amplificador no pórtico.

4. Ligar o amplificador de bloqueio

1. Para imagens SRS, use o módulo de detecção SRS que compreende um fotodiodo de grande área e um amplificador de bloqueio construído para esse fim.
2. Ligue a fonte de alimentação para o amplificador de bloqueio no pórtico.
3. Carregue o software para o amplificador de bloqueio "SRS detection Module" no PC.
4. No software, foram escolhidas as seguintes configurações: Fase = 0°, Deslocamento = -80 mW, Ganho = 58 dB.
5. Selecione a constante de tempo de integração do amplificador de bloqueio no software: para imagens celulares, a constante de tempo de 2 μs fornece imagens de boa qualidade.

5. Operando no microscópio de varredura a laser

1. Ligue os plugues de todos os equipamentos, exceto a caixa de controle remoto. Aguarde até que o modo de espera esteja aceso na caixa de controle localizada na parte superior do pórtico.
2. Ligue a caixa de controle remoto no pórtico e ligue a parte de trás da caixa. Aguarde até que a luz remota fique azul (na caixa de controle) e pressione Start Operation.
3. Ligue o PC do microscópio de varredura a laser.
4. Execute o software do microscópio confocal.
5. Verifique o caminho da luz do microscópio através do software do computador.
   NOTA: Algumas modificações foram feitas no microscópio para torná-lo adequado para imagens SRS: (i) No caminho do feixe, uma passagem curta de 775 nm foi adicionada à roda de filtro onde os feixes de laser entram na unidade de varredura, isso pode ser selecionado na guia Lightpath no software do computador. (ii) Em vez de usar os PMTs embutidos do microscópio confocal para detecção, um detector sob medida foi adicionado ao caminho da luz transmitida, o que permite a detecção SRS e CARS. (iii) As saídas desses detectores são conectadas à caixa analógica no pórtico. O sinal CARS do PMT é conectado através de um cabo BNC ao CD1 e o sinal SRS do amplificador de bloqueio é conectado através de um cabo BNC ao CD2.
6. Controle o foco através da tela sensível ao toque ou dos botões de controle remoto ou do software do computador.
7. Selecione as configurações de imagem desejadas no software; isso inclui zoom, o tamanho da imagem em pixels e o tempo de permanência do pixel.
8. Certifique-se de que a velocidade de imagem (tempo de permanência do pixel) seja maior do que o tempo de integração definido no software do amplificador de bloqueio.
   OBS.: FOI UTILIZADA UMA OBJETIVA DE IMERSÃO EM ÁGUA NA 1.2 para a imagem.

6. Montagem de uma amostra no estágio do microscópio

1. Prepare as amostras de células para geração de imagens da seguinte maneira.
   1. Cultura de células de carcinoma mamário de camundongo 4T1 em RPMI-1640 suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS). Mude o meio a cada 2 dias e passe as células em 70% a 80% de confluência.
      NOTA: As passagens 8–10 foram usadas ao longo dos experimentos descritos aqui.
   2. Para experimentos de imagem, incubar 1 x 10 5 células em coberturas quadradas por 24 h a 37 °C,⁵ % de CO₂. Em seguida, lavar as células com solução salina pré-aquecida tamponada com fosfato (PBS) e incubar com nanopartículas de ouro (diluição 1:100 em meio de cultura celular, concentração de estoque: 2,3 x^{10 10} partículas/mL, diâmetro: 60 nm) por 4 h.
   3. Antes da imagem, lave as células com PBS gelado e fixe-as com paraformaldeído a 4% em PBS por 15 min à temperatura ambiente (RT). Lave as células com PBS 3x e, em seguida, monte entre duas folhas de cobertura para obter imagens.
2. Coloque uma gota de água destilada em cima da objetiva de imersão em água que concentra os feixes de laser na amostra entre a objetiva e a amostra. Em seguida, coloque a amostra no estágio do microscópio.
3. Um condensador com NA 1.4 recolhe a luz propagada para a frente. Aplique uma gota de água entre o condensador e a amostra para exames de imagem. Ajustar a altura do condensador para aproximadamente 1 mm acima da amostra para recolher a quantidade máxima de luz.
4. O detector SRS está em uma montagem móvel, o que permite que ele seja deslizado para dentro e para fora da via óptica de coleta. Para se concentrar na amostra usando luz branca, mova o detector SRS para fora do caminho do feixe.
5. Coloque o detector de volta no caminho do feixe, pronto para a imagem SRS.

7. Alterando o deslocamento Raman e coletando uma pilha de dados hiperespectral

NOTA: O deslocamento Raman no qual a imagem ocorre depende da posição do estágio de atraso na caixa SF-TRU e do comprimento de onda do feixe da bomba do sistema a laser.

1. Para grandes mudanças no deslocamento Raman, altere o comprimento de onda do laser. Por exemplo, para a imagem de vibrações CH entre 2.800–3.100 cm-1, selecione 802 nm, enquanto, para a imagem de cerca de 1.600 ^cm-1 para o pico de amida I, selecione o feixe da bomba a 898 nm. Ajuste isso através do software.
2. Para obter pequenos ajustes no turno Raman, verifique o estágio de atraso na unidade SF-TRU.
3. O SF-TRU fornece posições de estágio de atraso em milímetros (mm). Para converter a posição do estágio de atraso de mm para ^cm-1, execute a varredura hiperespectral de calibração usando uma amostra de esferas de poliestireno e compare as posições de pico encontradas na varredura de calibração com aquelas tomadas em uma configuração Raman espontânea. Isso fornecerá uma equação linear, que converte a posição do estágio de atraso em mm para o deslocamento Raman em ^cm-1.
4. Para gerar uma varredura hiperespectral, faça uma série temporal de imagens em diferentes posições de estágio de atraso.
5. Para sincronizar a aquisição de imagem e o movimento do estágio de atraso, use a unidade analógica para enviar e receber sinais TTL de e para o sistema SF-TRU.
   NOTA: Para fazer isso, a caixa analógica tem as seguintes conexões: (i) TRIG OUT VD1—isso é conectado ao SF-TRU através de um BNC e envia um sinal TTL para dizer ao estágio de atraso para mover o incremento +1. (ii) TRIG Em 1—aqui, um sinal é recebido via BNC quando o estágio de atraso termina seu movimento, e isso é usado para acionar a próxima imagem na série temporal.
6. Para o conjunto de dados hiperespectrais, selecione as seguintes configurações no software de microscópio confocal:
   1. Na guia Acionador , selecione Iniciar pelo gatilho TTL (ON) e Trigger (cada quadro).
   2. Na guia Série , defina a série temporal ON e a série z OFF.
   3. Defina o número de quadros na série temporal para corresponder ao número de etapas no software ATM (101 etapas são usadas aqui).
7. No software ATM, vá para a guia Executar .
   1. Defina as posições do estágio de atraso em milímetros para o início e a parada da varredura hiperespectral. Para a região de alto número de onda CH, use a posição inicial = 90,25 mm e a posição de parada = 92,25 mm.
   2. Certifique-se de que o número de passos corresponde ao número de quadros no software do microscópio confocal.
8. Depois de verificar as configurações corretas, inicie a pilha hiperespectral no software do microscópio confocal primeiro. Vá para Adquirir e clique em Iniciar varredura. Em seguida, no software ATM, clique em Iniciar. Isso inicia a coleta de uma série de imagens, com aumentos incrementais na posição do estágio de atraso entre as posições de início e parada selecionadas.
9. Exporte a série de imagens hiperespectrais como um arquivo de .tif de vários quadros e use um pacote de software adequado para realizar a calibração.
10. Quando a calibração estiver concluída, use a equação de calibração linear para converter a posição do estágio de atraso para os deslocamentos Raman.
11. Para alternar entre a imagem na região vibracional CH (2.800–3.100 cm-1) para a região vibracional amida I 1.500–1.700 ^cm-1), faça o seguinte.
    1. Altere o comprimento de onda da bomba no software laser de 802 nm para 898 nm.
    2. Altere a configuração de dispersão de Stokes no software ATM de 30 mm para 5 mm.
    3. Faça um pequeno ajuste no espelho na via de dispersão do feixe da bomba dentro da caixa SF-TRU. Isso é feito ajustando o botão inferior no suporte do espelho, o que altera o ângulo do espelho em uma quantidade incremental.
    4. Ao executar uma varredura hiperespectral sobre a região amida I, defina as posições de início e parada no software ATM para 89 e 91mm, respectivamente
       CUIDADO: Óculos de segurança a laser devem ser usados para esta etapa, pois o feixe de laser será exposto.

Resultados

O módulo Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) é introduzido entre o laser de femtossegundo de saída dupla e o microscópio de varredura a laser modificado. O sistema de laser ultrarrápido ajustável usado neste estudo tem duas portas de saída que fornecem um feixe a um comprimento de onda fixo de 1.045 nm e o outro feixe ajustável na faixa de 680-1.300 nm. Um esquema detalhado do módulo SF-TRU e da plataforma de imagem multimodal é representado na Figura 1. O SF-T...

Discussão

Este estudo apresentou a combinação do módulo SF-TRU e do sistema laser ultrarrápido de saída dupla demonstrando suas aplicações para microespectroscopia multimodal. Com sua capacidade de investigar a absorção de nanopartículas de ouro (AuNPs) por células cancerígenas, a plataforma de imagem multimodal pode visualizar as respostas celulares a tratamentos de câncer hipertérmico quando os feixes de laser são absorvidos por AuNPs.

Além disso, imagens quimicamente específicas ráp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
APE SRS Detection Unit	APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)	APE Lock-in Module	Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations
Confocal Scanning Unit	Olympus	FV 3000	Confocal scanning unit used for imaging
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm	Invitrogen	C37483	Polystyrene microspheres
Coverslips	Thorlabs	CG15CH2	22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells
FBS	Gibco	10500-064	Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)
Flouview	Olympus	FV31S-SW	Laser scanning microscope control software
Function Generator	BX precision	40543	Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam
Gold Nanoparticles	Nanopartz	A11-60	Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter
Input Output Interface	Olympus	FV30 ANALOG	This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.
InSight X3	Newport	Spectra-Physics	Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.
Microscope Frame	Olympus	IX83	Inverted microscope
Mouse 4T1 cells	ATCC	CRL-2539	Mouse breast cancer cells
NA 1.2 Water Immersion Objective	Olympus	UPLSAPO60XW/IR	The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.
NA 1.4 Condenser	Nikon	CSC1003	Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.
PMT	Hamamatsu	R3896	PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy
PMT Connector	Hamamatsu	C13654-01-Y002	Connector for PMT
Power Supply	RS	RSPD-3303 C	Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT
RPMI-1640	Gibco	A10491-01	Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.
SF-TRU	Newport Spectra Physics	SF-TRU	System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS