Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

Resumo

Este protocolo descreve a metodologia para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) usando um modelo transgênico de zebrafish. A adaptação do protocolo para incorporar a modulação da via de sinalização usando compostos farmacológicos é extensivamente detalhada. Uma plataforma MATLAB para quantificar a regeneração de RPE com base na pigmentação foi desenvolvida e é apresentada e discutida.

Resumo

O epitélio pigmento da retina (RPE) reside na parte de trás do olho e desempenha funções essenciais para manter a saúde e integridade dos tecidos adjacentes da retina e vascular. Atualmente, a capacidade reparativa limitada do RPE mamífero, que se restringe a pequenas lesões, tem dificultado o progresso na compreensão dos processos regenerativos in vivo RPE. Aqui, uma metodologia detalhada é fornecida para facilitar o estudo do reparo in vivo RPE utilizando o zebrafish, um modelo de vertebrado capaz de regeneração robusta do tecido. Este protocolo descreve um paradigma de lesão mediada por nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), que resulta em ablação dos dois terços centrais do RPE após tratamento de 24 horas com MTZ, com posterior recuperação tecidual. O foco é colocado em ablações de RPE em zebrafish larval e métodos para testar os efeitos de compostos farmacológicos na regeneração de RPE também são descritos. Também é discutida a geração e validação do RpEGEN, um script MATLAB criado para automatizar a quantificação da regeneração de RPE com base na pigmentação. Além dos mecanismos ativos de reparação de RPE, este protocolo pode ser expandido para estudos de degeneração de RPE e respostas de lesões, bem como os efeitos dos danos de RPE em tecidos adjacentes da retina e vascular, entre outros processos celulares e moleculares. Este sistema de zebrafish mantém uma promessa significativa na identificação de genes, redes e processos que impulsionam a regeneração do RPE e mecanismos relacionados à doença de RPE, com o objetivo de longo prazo de aplicar esse conhecimento a sistemas de mamíferos e, em última instância, ao desenvolvimento terapêutico.

Introdução

A metodologia aqui descrita detalha um protocolo para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) utilizando zebrafish larval. O RPE se estende sobre a parte de trás do olho e reside entre as camadas estratificadas da retina neural e a camada de vasculatura que constitui o coroide. Suporte trófico, absorção de luz fototóxica e manutenção de proteínas do ciclo visual são apenas algumas das funções críticas que o RPE desempenha que são essenciais para sustentar a saúde e a integridade desses tecidos adjacentes¹. Os danos ao RPE mamífero são reparáveis quando as lesões são pequenas²; no entanto, os danos sofridos por lesões maiores ou doenças degenerativas progressivas são irreversíveis. Em humanos, as doenças degenerativas de RPE (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade (AMD) e doença de Stargardt levam à perda permanente da visão e, com poucas opções de tratamento disponíveis, diminuíram a qualidade de vida do paciente. A capacidade limitada de rpe mamífero para auto-reparação criou uma lacuna de conhecimento no campo dos processos regenerativos RPE. Dada a robusta capacidade regenerativa do zebrafish em muitos tipos diferentes de tecidos, este protocolo foi desenvolvido para estabelecer um sistema de vertebrados in vivo para facilitar estudos sobre a regeneração intrinseca do RPE e descobrir mecanismos que conduzem essa resposta. Usando o paradigma de ablação aqui descrito, a via de sinalização canônica Wnt³, a via mTOR⁴ e as respostas relacionadas à imunidade⁵ foram identificadas como mediadoras críticas da regeneração de RPE, provavelmente com funções sobrepostas.

Neste paradigma de ablação genética, o gene Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)³ zebrafish expressam o gene nitroreductase derivado da bactéria (NTR/nfsB)⁶ fundido ao eGFP sob controle do elemento melhorador RPE, rpe65a⁷. A ablação é alcançada adicionando o pró-drogas, metronidazol (MTZ), ao sistema de água que abriga zebrafish. A ativação intracelular de MTZ por nitroreductase resulta em cruzamento de DNA e apoptose em células expressas^NTR/nfsB ^8,9. Esta tecnologia tem sido amplamente utilizada em zebrafish para ablate células da retina 10,11,12,13 e outros tecidos 8. Juntos, esses elementos permitem a expressão direcionada (rpe65a) de uma metodologia de ablação celular indutível (NTR/MTZ)^8,9 e um marcador fluorescente (eGFP) para visualização.

Outros modelos in vivo interessantes também existem que podem ser usados para estudar o potencial regenerativo do RPE¹⁴. Estes são amplos e incluem a transdiferenteição RPE-para-retina pós-retinoctomia em anfíbios, nos quais as células RPE perdidas para o recrescimento da retina são substituídas^15,16; Restauração RPE pós-lesão no mouse MRL/MpJ "super curativo"¹⁷; e estimulação exógena da proliferação de RPE em um modelo de rato de RPE espontânea e degeneração da retina¹⁸, entre outros. Modelos in vitro, como células-tronco RPE humanas adultas (RPESCs)¹⁹ também foram desenvolvidos. Esses modelos são ferramentas valiosas que trabalham para desvendar os processos celulares relacionados à regeneração de RPE (por exemplo, proliferação, diferenciação, etc.); no entanto, o zebrafish é único em sua capacidade de reparo de RPE intrínseco pós-ablação.

Enquanto a metodologia aqui é escrita para focar na compreensão dos mecanismos que impulsionam a regeneração do RPE, a linha Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) e este protocolo de ablação genética poderiam ser utilizados para estudar outros processos celulares, como apoptose RPE, degeneração RPE e o efeito da lesão de RPE em tecidos de retina e vascular adjacentes. O protocolo de ablação também pode ser modificado para incluir manipulação farmacológica, que é uma estratégia preliminar conveniente para rastrear caminhos de sinalização de interesse. Por exemplo, bloquear a via canônica Wnt usando o Inibidor do Wnt Response-1 (IWR-1)²⁰, mostrou-se prejudicado a regeneração de RPE³. Isso foi repetido aqui para orientar os usuários através de um experimento de manipulação farmacológica e servir como prova de conceito para validar um script MATLAB (RpEGEN) criado para quantificar a regeneração de RPE com base na recuperação da pigmentação. Como a linha transgênica e o protocolo de ablação, os scripts RpEGEN são adaptáveis e podem ser usados para quantificar outros marcadores/processos celulares dentro do RPE.

Protocolo

Todas as metodologias aqui descritas estão em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Pittsburgh.

1. Preparação antes da coleta de embriões de zebrafish

1. Coloque a incubadora de embriões a 28,5°C.
2. Prepare uma solução de estoque de 25x do inibidor de melanogênese, N-phenylthiourea (PTU)^21,22. Esta solução de estoque é dimensionada a partir de uma receita comum²² e 1x é igual a 0,003% de peso por volume (% w/v) (por exemplo, 0,003 g de ptu em pó em 100 mL de solvente líquido).
   1. Para fazer uma grande solução de estoque PTU de 25x, adicione 0,75 g de ptu em pó a 1 L de água desionizada purificada (doravante chamada dH₂O) e misture bem à temperatura ambiente (~25 °C) usando uma barra de mexida e placa de mexida. Armazene a 4°C por até 3 meses protegido contra a luz.
      NOTA: É difícil fazer com que a PTU entre em solução aquosa e pode ser necessária agitação prolongada durante a noite.
      ATENÇÃO: A PTU é perigosa e deve ser tomada cuidado para evitar a ingestão, inalação e/ou contato com a pele ou os olhos. O pó ptu e todos os derivados líquidos ptu descritos aqui podem precisar ser descartados como resíduos químicos, dependendo das regulamentações estaduais e institucionais. Recomenda-se a confirmação dos métodos adequados de eliminação de resíduos de PTU, se houver, antes do uso.
   2. Para fazer uma solução de trabalho ptu de 1,5x (doravante referida como 1,5x PTU), adicione 60 mL de solução de estoque ptu de 25x a 940 mL de água do centro de habitação de zebrafish (doravante chamada de água do sistema). Os parâmetros ideais de qualidade da água para os zebrafish foram descritos²³ e as instalações aquáticas devem ter procedimentos padrão de monitoramento da água. Armazene 1,5x PTU a 28,5°C por 1-2 semanas protegido contra a luz.
      NOTA: Este protocolo é realizado rotineiramente usando as concentrações de PTU, solventes e parâmetros de armazenamento descritos na etapa 1.2. Como precaução, embriões/larvas devem ser observados a cada 1-2 dias enquanto em PTU para validar a eficácia e confirmar a despigmentação sustentada. As condições de dissolução e/ou armazenamento devem ser otimizadas se houver diminuição da solubilidade/eficácia do PTU.
3. Prepare uma solução de estoque de 0,05% w/v azul de metileno, um inibidor de crescimento fúngico, adicionando 0,05 g de pó azul de metileno a 100 mL de dH₂O. Misture bem usando uma barra de mexida e stir plate. Armazene a 4°C.
4. Prepare pipetas para manipulação de embriões/larvas (por exemplo, embriões/larvas móveis entre placas de Petri, separando larvas durante a triagem de fluorescência, coletando larvas eutanizadas em tubos de microcentrifuge para fixação, etc.) cortando a extremidade afilada de uma pipeta pasteur de vidro usando uma caneta de assinatura de ponta de diamante. Etch em torno da circunferência da pipeta com a caneta de diamante e puxe suavemente ou estaque a extremidade para fazer uma ruptura limpa.
   NOTA: A boca da pipeta deve ser lisa e larga o suficiente para facilmente ocupar um embrião ainda dentro do chorão sem tesourar. Use uma pipeta de transferência de desenho de lâmpada como alternativa. As pipetas preparadas também podem ser usadas para remover líquido durante as alterações de água (em vez de derramar) para minimizar a perda de embriões/larvas.
5. Prepare uma solução de 4% paraformaldeído (PFA) em 1x salina tamponada de fosfato (PBS) (por exemplo, adicione 10 mL de 16% PFA a 4 mL de PBS 10x e 26 mL de dH₂O). Armazene a 4°C por até 4 semanas protegido contra a luz.
   ATENÇÃO: O paraformaldeído é um produto químico perigoso e deve ser manuseado em um capô de fumaça química e descartado corretamente. Deve-se tomar cuidado e devem ser usados equipamentos de proteção individual (EPI) para evitar ingestão, inalação e/ou contato com a pele ou os olhos.

2. Coleta e manutenção de embriões de zebrafish antes da ablação genética (0-5 dias após a fertilização)

1. Mantenha o zebrafish adulto como descrito anteriormente ^3,4,5. À tarde/noite antes da coleta de embriões, separe os zebrafish adultos em tanques de reprodução para desova.
2. Na manhã seguinte (0 dias após a fertilização (dpf)), colete embriões em placas de Petri de 10 cm de diâmetro na água do sistema e remova todos os ovos inviáveis ou não fertilizados, que parecerão opacos e/ou apresentarão citoplasma irregular e decote^{falhou 24}.
   NOTA: Eventos normais de decote e estágio de desenvolvimento serão aparentes em embriões saudáveis como descrito²⁵. As placas de petri devem ser mantidas três quartos cheias (~30 mL para uma placa de 10 cm de diâmetro) durante todo o protocolo.
   1. Adicione duas gotas de 0,05% w/v azul de metileno em cada placa de Petri, misture suavemente e armazene embriões a 28,5°C para o restante do protocolo.
3. Em torno de 6h pós-fertilização (hpf)^4,5,26, substitua a água do sistema em pratos petri embrião por 1,5x PTU (solução de trabalho feita na etapa 1.2.2) e reponha o azul de metileno.
   NOTA: A PTU deve ser adicionada aos embriões antes do início da pigmentação (ou seja, antes de 24 hpf)²⁵, pois tecidos já pigmentados não despigmentarão após a adição de PTU²¹. Deve-se notar, no entanto, que a redução do tamanho dos olhos, déficits oculares e craniofaciais e interrupção de algumas vias de sinalização (por exemplo, sinalização da tireoide) foram relatadas em zebrafish tratados com PTU 27,28,29. A toxicidade do desenvolvimento da PTU parece depender da concentração e do tempo de adição de^{PTU 27,29}. Como mencionado acima para validar a eficácia da PTU (etapa 1.2), os sinais de toxicidade da PTU também devem ser cuidadosamente monitorados e, se suspeitado, a concentração de trabalho e/ou o tempo de adição de PTU devem ser otimizados.
4. Em 2-3 dpf, deschorionato embriões usando solução de pronase recém-feita.
   1. Dissolver a pronase em 1,5x PTU a uma concentração de 2 mg/mL por vórtice.
      ATENÇÃO: Pronase é embalada como um pó muito fino e é um irritante. Tome medidas para evitar inalação e/ou contato com pele, olhos, etc.
   2. Embriões eclodidos separados de embriões não-eclodidos e tratados com pronase apenas embriões não-eclodidos.
   3. Substitua 1,5x PTU por uma solução de pronase de 2 mg/mL feita na etapa 2.4.1 e deixe em embriões não-escaramuçados por 4-5 min com agitação suave (por exemplo, em um rotador/agitador de mesa ou por redemoinho manual).
   4. Despeje a solução de pronase e enxágue imediatamente com PTU de 1,5x fresco. Triturar suavemente 1,5x PTU enxaguar sobre embriões com uma pipeta de transferência de desenho de lâmpadas.
   5. Repita uma segunda lavagem ptu de 1,5x para descartar todos os detritos de chorão e, em seguida, reponha 1,5x PTU para manutenção.
      NOTA: Os embriões também podem ser descorrioados manualmente usando fórceps finos. Neste caso, os detritos de chorion devem ser removidos e 1,5x PTU reabastecidos após a descorção manual.
5. Monitore a saúde embrião/larval e reponha 1,5x PTU a cada 1-2 dias. Embriões/larvas são mantidos em 1,5x PTU até ablação a 5 dpf.
   NOTA: A importância das etapas 2.3 e 2.4 são abordadas ainda mais na seção Discussão.

3. Triagem de larvas de zebrafish para rpe65a:nfsB-eGFP e ablação genética do epitélio pigmento da retina (5-6 dias após a fertilização)

1. Faça uma solução fresca de 10 mM metronidazol (MTZ) em 5 dpf (dia de ablação). Este processo leva 2h para ser concluído.
   1. Adicione pó MTZ à água do sistema sem PTU e misture bem por um tremendo vigoroso (por exemplo, 250 rotações por minuto) por 1h a 37 °C.
   2. Esfrie a solução MTZ de 10 mM para um adicional de 1h à temperatura ambiente em um rotador/agitador de mesa e garanta a dissolução completa antes de adicionar a placas de Petri com larvas.
      NOTA: A triagem de fluorescência e a separação das larvas eGFP⁺ (etapa 3.2) podem ser realizadas durante as incubações de 37 °C e temperatura ambiente.
      ATENÇÃO: O MTZ é perigoso e deve ser tomado cuidado para evitar a ingestão, a inalação e/ou o contato com a pele ou os olhos. O pó de MTZ e todos os derivados líquidos aqui descritos podem precisar ser descartados como resíduos químicos, dependendo das regulamentações estaduais e institucionais. Recomenda-se a confirmação dos métodos adequados de eliminação de resíduos MTZ, se houver, antes do uso.
2. Larvas de zebrafish de tela para o transgene rpe65a:nfsB-eGFP.
   1. Anestesiar larvas com 0,168 g/L de tricaine (MS-222) e larvas transgênicas separadas (eGFP⁺) (Figura 1) de larvas não transgênicas (eGFP^-) utilizando um microscópio estéreo de fluorescência com um laser/filtro de excitação de 488 nm.
      NOTA: A tricaine deve ser adicionada a 1,5x PTU e/ou soluções de compostos farmacológicos, pois as larvas devem permanecer imersas no tratamento enquanto são rastreadas para eGFP. Incubar larvas em tricaine apenas durante a triagem (por exemplo, ≤10 min para uma única placa de Petri de 10 cm contendo 50 larvas).
   2. Acorde larvas examinadas imediatamente, pipetando diretamente em uma placa de Petri com PTU fresco de 1,5x sem tricaine.
   3. Após a conclusão da triagem, separe ainda mais as larvas eGFP⁺ em dois grupos de placas de Petri: um grupo para receber tratamento MTZ (ablated/MTZ⁺) e um grupo para ser o controle não-blado (MTZ^-).
3. Ablate o pigmento da retina epitélio.
   1. Remova 1,5x PTU dos pratos de controle não jateados (MTZ^-) e adicione água fresca do sistema sem PTU.
   2. Remova 1,5x PTU dos pratos de tratamento ablados (MTZ⁺) e adicione a solução MTZ recém-feita de 10 mM (passo 3.1.).
   3. Remova a solução MTZ de 10 mM após exatamente 24 h (designada 1 dia após a lesão (dpi)) e adicione água fresca do sistema sem PTU. Altere a água do sistema fresco sem PTU ^{no prato} MTZ(es). Larvas não serão expostas novamente ao PTU pelo restante do protocolo.
      NOTA: Pode ser difícil pipetar ou derramar todos os 1,5x PTU (etapas 3.3.1 e 3.3.2) ou 10 mM MTZ (etapa 3.3.3) entre trocas de solução sem perda larval, pois os animais estão ativamente nadando ao redor. Nesse caso, a lavagem(es) da água do sistema sem PTU pode ser adicionada para garantir uma troca de soluções bem sucedida.

4. Manutenção larval pós-ablação genética (mais de 6 dias após a fertilização)

1. Verifique as larvas e reponha a água do sistema sem PTU diariamente até a eutanásia (passo 5.6) ou retorne ao centro de habitação de zebrafish.
2. Monitore o sucesso e a extensão da ablação in vivo em 2 dpi (7 dpf) utilizando iluminação de luz transmitida em um microscópio estéreo (Figura 2).

5. Incorporando tratamento farmacológico no protocolo de ablação de epitélio de pigmento de retina de zebrafish

NOTA: Como realizado anteriormente³, o tratamento com 15 μM IWR-1 ou controle de sulfeto de dimetil (DMSO) a partir de 4 dpf é descrito aqui como um experimento de exemplo para testar o RpEGEN. As concentrações e cronogramas podem variar com diferentes compostos farmacológicos e recomendações para validação dose-resposta, duração do tratamento, triagem e outros aspectos do desenho experimental para estudos de manipulação farmacológica são abordados na seção Discussão. Siga as etapas 6 e 7 se a análise de imagem for necessária.

1. Coletar e manter embriões conforme descrito na etapa 2. Embriões descolados em 2 dpf.
2. Tela larvas eGFP⁺ em 4 dpf conforme descrito na etapa 3.2. Em vez de placas de Petri, coloque larvas eGFP⁺ em placas de 6 poços a uma densidade de n ≤ 10 larvas por 6 poços para tratamento farmacológico. Designe placas separadas de 6 poços para larvas que não serãobladas (MTZ^-) e larvas que serão abladas (MTZ⁺).
   NOTA: O sinal eGFP é visível em 4 dpf, mas parece mais escuro que a intensidade do sinal em 5 dpf.
3. Pretreat 4 dpf eGFP⁺ larvas com 15 μM IWR-1 ou controle de veículo DMSO compatível com volume por exatamente 24 horas antes da ablação genética com solução MTZ de 10 mM.
   NOTA: Muitas vezes, muito pouco composto é necessário para experimentos de tratamento farmacológico. Para evitar a pesagem de pequenas quantidades de pó IWR-1, este composto farmacológico é adquirido já em solução DMSO, a uma concentração de 25 mM, e aliquoado em volumes menores na chegada para evitar repetidos ciclos de congelamento.
   1. Determine o volume de tratamentos farmacológicos e de controle de veículos necessários e alíquota de 1,5x PTU em tubos cônicos em conformidade. Recomenda-se um volume de 5 mL/poço de uma placa de 6 poços.
   2. Adicione ações IWR-1 a 1,5x PTU para uma concentração final de 15 μM IWR-1 (por exemplo, 3 μL de 25 mM IWR-1 por 5 mL de 1,5x PTU). Adicione um volume combinado de estoque DMSO a 1,5x PTU (por exemplo, 3 μL ≥ 99,7% DMSO por 5 mL de 1,5x PTU). Aqui, isso acabará rendendo uma concentração final de 0,06% de volume/volume (% v/v) DMSO. Misture bem com vórtice e confirme visualmente a dissolução dos compostos.
      ATENÇÃO: DMSO, IWR-1 e outros compostos e solventes farmacológicos podem precisar ser descartados como resíduos químicos, dependendo das regulamentações estaduais e institucionais. A confirmação do nível de risco e dos métodos adequados de eliminação de resíduos para esses compostos, se houver, é recomendada antes do uso.
   3. Remova 1,5x PTU das larvas eGFP⁺ em placas de 6 poços e adicione 5 mL/poço de 0,06% v/v DMSO ou 15 tratamentos IWR-1 de 15 μM da etapa 5.3.2.
4. Em 5 dpf, abule o RPE. Além do pré-tratamento de 24 horas (etapa 5.3), as larvas permanecerão imersas em tratamentos farmacológicos e de controle veicular durante 24h de ablação genética com MTZ de 10 mM e durante a recuperação pós-ablação, até fixação (por exemplo, de 4 a 9 dpf).
   1. Faça 10 mM solução MTZ 2 h antes de realizar ablação genética (passo 3.1).
   2. Determine o volume de tratamentos farmacológicos e de controle de veículos necessários tanto para placas não abladas (MTZ^-) quanto para ablação (MTZ⁺) e volumes apropriados de aliquot de água do sistema fresco sem solução PTU (MTZ^-) ou 10 mM MTZ (MTZ⁺) em tubos cônicos. Isso produzirá quatro condições de tratamento: 1) 0,06% v/v DMSO, MTZ^-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ^-; 3) 0,06% v/v DMSO, MTZ⁺; e 4) 15 μM IWR-1, MTZ⁺.
   3. Adicione as soluções de estoque IWR-1 e DMSO aos respectivos tubos cônicos, conforme realizado na etapa 5.3.2. Misture bem com vórtice e confirme visualmente a dissolução dos compostos.
   4. Remova tratamentos DMSO 0,06% v/v e 15 μM IWR-1 em 1,5x PTU (etapa 5.3.2) das placas designadas não abladas (MTZ^-) e abladas (MTZ⁺) e reabasteça-se com os tratamentos adequados feitos na etapa 5.4.3.
   5. Remova tratamentos DMSO de 0,06% v/v e 15 tratamentos IWR-1 em solução MTZ de 10 mM após exatamente 24 h e reabasteça-se com tratamentos em água fresca do sistema sem PTU. Reabastecer tratamentos de 0,06% v/v DMSO e 15 tratamentos IWR-1 em água fresca do sistema sem PTU na placa nãoblada (MTZ^-) 6-well(s).
5. Siga a manutenção larval pós-ablação conforme descrito na etapa 4 e reponha 0,06% v/v DMSO ou 15 tratamentos IWR-1 μM diariamente em água do sistema sem PTU.
6. Eutanize larvas em 9 dpf (4 dpi para irmãos tratados com MTZ) por imersão de animais em solução de tricaine 0,3 g/L (overdose letal) juntamente com resfriamento rápido (por exemplo, coloque placas de Petri no gelo) por pelo menos 20 min³⁰. Verifique se as larvas não estão respondendo ao toque e fixação em 4% pfa (passo 1,5) por 3h em temperatura ambiente ou a 4 °C durante a noite.
7. Processe o tecido larval pós-fixação para aquisição de imagens de pilha z em um microscópio confocal, conforme descrito anteriormente ^5,31 e aqui na seção Resultados Representativos. A análise nas etapas 6 e 7 exigirá, no mínimo, a aquisição de marcadornuclear (por exemplo, DAPI) e imagens de pilha z-stack brightfield.

6. Pré-processamento de imagem de microscópio confocal em FIJI (ImageJ)

1. Importar e formatar imagens de microscópio confocal z-stack usando FIJI³².
   1. Abra imagens de microscópio usando as opções de importação de bioformitos definidas para exibir pilha com: Hyperstack e modo de cor: Escala de cinza.
   2. Gere uma projeção de intensidade máxima da imagem do microscópio importado escolhendo imagem | Pilhas | Projeto Z. Na janela ZProjection , defina Start Slice e Stop Slice para incluir todas as fatias para essa imagem. Por exemplo, defina Start Slice: 1 e Stop Slice: 18 para uma pilha z que tem um total de 18 fatias. Escolha o tipo de projeção: Intensidade máxima e clique em OK.
   3. Converta o arquivo de projeção de intensidade máxima em uma imagem de 8 bits (se não já) escolhendo imagem | Tipo | 8 bits.
   4. Reoriente a imagem para que o lado dorsal seja para cima e distal (ou seja, a lente) é deixada escolhendo imagem | Transforme | Vire Horizontalmente (para o último comando, escolha a opção que melhor se adequa à direcionalidade necessária para essa imagem). Para obter uma imagem multicanal, clique em Yes in the Process Stack? janela para reorientar todos os canais.
      NOTA: Este passo é crítico, mas não é necessário se a imagem já estiver no dorsal para cima, orientação esquerda distal. Consulte a Figura 3A-D e a Figura 4 para obter imagens com olhos na direcionalidade correta para processamento.
   5. Salve a projeção de intensidade máxima de 8 bits como um arquivo TIF (Formato de arquivo de imagem marcado) escolhendo o Arquivo | Salve como | Tiff....
2. Gerar região de interesse RPE (ROI) usando FIJI.
   1. Abra uma imagem TIF de 8 bits gerada como descrito na etapa 6.1. Inicie o Gerenciador de ROI escolhendo Analisar | Ferramentas | Gerente do ROI.
   2. Use | de imagem Zoom e alternar entre os canais DAPI e brightfield para identificar o ponto(s) em que o lado apical do RPE está adjacente à ponta da membrana limitante externa (OLM) (Figura 3B', B", D', D"; pontas de flecha azul). Use este marco anatômico como ponto de partida do ROI.
   3. Crie o ROI RPE com a ferramenta Seleções de Polígono (na barra de ferramentas FIJI) usando os canais de imagem DAPI e brightfield e função zoom (Imagem | Zoom) para identificar limites de RPE apical e basal. Leve as extremidades dorsal e ventral do ROI (ou seja, onde o ROI transita do lado apical para basal da RPE) para um ponto afiado em vez de embaraçar ou arredondar (Figura 3B', B", D', D"; linhas magenta).
      NOTA: Criar um final de ROI pontiagudo é um passo fundamental para otimizar a detecção de ponto final usando o RpEGEN e é abordado na seção Discussão.
   4. Adicione o ROI clicando em Adicionar no gerenciador de ROI. Ajuste o ROI conforme necessário e clique em Atualizar no Gerenciador de ROI.
   5. Salve o arquivo ROI escolhendo Mais>> | Salvar... dentro do ROI Manager. Use nomes idênticos para arquivos de imagem ROI e TIF combinados (por exemplo, [nome do arquivo].tif e [nome do arquivo].roi).
3. Combine arquivos TIF e ROI de 8 bits para cada condição em uma única pasta. Por exemplo, a pasta, DMSO_9dpf, conterá todos os arquivos TIF e ROI combinados para o grupo larval tratado com 9 dpf (MTZ^-) 0,06% v/v DMSO.

7. Quantificação e visualização da regeneração de RPE usando scripts RpEGEN

1. Instale e prepare scripts RpEGEN.
   1. Baixe os últimos scripts do RpEGEN do repositório do GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) clicando em Code | Baixe ZIP.
   2. Descompacte a pasta e coloque-a no local desejado do espaço de trabalho (por exemplo, Desktop).
   3. Abra o MATLAB.
   4. Navegue até a pasta RpEGEN no painel pasta corrente (geralmente no lado esquerdo).
   5. Clique com o botão direito do mouse na pasta RpEGEN e escolha Adicionar ao caminho | Pastas e Subpastas selecionadas. Isso adiciona a pasta ao caminho MATLAB para que ela possa encontrar e executar automaticamente quaisquer scripts na pasta.
   6. Clique duas vezes na pasta RpEGEN no painel pasta corrente para mostrar todas as subpastas e arquivos M.
   7. Clique duas vezes no arquivo RpEGEN.m para abrir no painel do Editor .
   8. De acordo com a seção VARIÁVEIS DEFINIDAS PELO USUÁRIO do arquivo RpEGEN.m, digite os locais de diretório das pastas que contêm os arquivos ROI (.roi), arquivos de imagem (.tif) e onde os arquivos de saída devem ser salvos. Digite o nome do grupo para que o arquivo .mat seja exportado (por exemplo, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, etc.) e a localização do canal brightfield na pilha de imagens TIF (por exemplo, 3, se brightfield é o terceiro canal em uma pilha de imagens). Se o arquivo de imagem contém apenas a imagem de campo brilhante, então isso deve ser igual a 1.
2. Execute o script RpEGEN.m e valide os resultados.
   NOTA: A RpEGEN requer que a caixa de ferramentas de processamento de imagem, a caixa de ferramentas de ajuste de curva e a caixa de ferramentas de estatística e aprendizado de máquina sejam ativadas na licença MATLAB do usuário para ser executada. Além disso, a caixa de ferramentas ReadImageJROI^{disponível gratuitamente 33} é necessária para importar ROIs FIJI para o MATLAB; no entanto, ele é fornecido na pasta RpEGEN juntamente com outros arquivos M de função que não requerem qualquer ativação.
   1. Execute o script clicando no botão Executar no menu Editor na parte superior do MATLAB.
      NOTA: Uma vez iniciada, a janela Comando fornecerá saída verbosa indicando a progressão do script. Depois de salvar o arquivo MAT contendo os dados extraídos, uma figura de três painéis aparecerá e será salva como um PDF para o diretório de saída para cada execução de imagem. Estas são figuras de controle de qualidade (QC) para garantir que tudo tenha corrido corretamente e inclua: 1) a imagem de campo brilhante sobreposta pelo ROI (Figura 4A); 2) o ROI com distância angular central e associada (graus) (Figura 4G); e 3) o ROI com os valores de intensidade mediana da linha central (0-255, escala de cores de 8 bits) (Figura 4H). Aguarde até que os PDFs QC tenham sido salvos na pasta de saída e a última figura tenha desaparecido antes de prosseguir para a próxima etapa.
   2. Abra os PDFs individuais exportados para a pasta de saída em qualquer visualizador PDF e verifique se todos os ROIs correspondem às imagens de campo brilhante, que os valores da linha central são aproximações razoáveis do centro dos ROIs, e que os valores de intensidade mediana são adequadamente preenchidos com dados (ou seja, nem todos o mesmo valor em toda a linha central).
      NOTA: Uma descrição detalhada e estrutura de cada variável salva no arquivo MAT pelo RpEGEN.m podem ser encontradas na Tabela 1.
3. Execute o roteiro de RpEGEN_PermPlot.m.
   NOTA: O script RpEGEN_PermPlot.m usa a saída do RpEGEN.m para executar comparações estatísticas usando uma simulação de permutação das medianas de dois grupos e também fornece o código para reproduzir os plots neste papel usando a caixa de ferramentas GRAMM³⁴ disponível livremente, que também foi incluída na pasta RpEGEN.
   1. Clique duas vezes no arquivo RpEGEN_PermPlot.m para abrir em uma nova guia Editor .
   2. De acordo com a SEÇÃO 1 - VARIÁVEIS DEFINIDAS PELO USUÁRIO no arquivo RpEGEN_PermPlot.m, digite o local do diretório para a pasta de saída contendo os arquivos MAT de execução do RpEGEN.m e digite cada nome de arquivo MAT a ser carregado (por exemplo, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
   3. Execute esta seção do script clicando no botão Executar seção no menu Editor na parte superior do MATLAB.
   4. Na Seção 2, digite os nomes dos dois grupos para comparação estatística nas variáveis data_A e data_B (estes são os grupos dos quais as medianas serão derivadas utilizando a simulação de permutação). Na variável bin_sz , digite o número de graus sobre os quais integrar os valores de intensidade mediana para os conjuntos de dados (padrão são caixas de 1 grau).
      NOTA: A variável reps indica o número de permutações a serem usada para construir uma distribuição de probabilidades e pode ser definida para qualquer número (o valor padrão é de 20.000). Em geral, um maior número de repetições será mais estatisticamente robusto, mas aumentará o tempo de processamento.
   5. Execute esta seção do script clicando no botão Executar seção no menu Editor na parte superior do MATLAB. Esta seção pode levar algum tempo para ser concluída dependendo do número de repetições especificadas, mas fornece uma atualização contínua de status na janela de comando.
   6. Execute as seções HEATMAP FIGURE e GROUP RESULTS E P-VALUES independentemente usando o botão Executar seção . Editar variáveis de dados em todas as seções comentadas com "ENTER DATA HERE". PDFs dessas figuras são automaticamente salvos para cada um e podem ser facilmente modificados em qualquer pós-processamento de software vetorial.
      NOTA: As parcelas geradas no arquivo RpEGEN_PermPlot.m são ad hoc e provavelmente exigirão modificações com base nas necessidades específicas de visualização e dados específicos de cada usuário. No entanto, os números fornecem uma base sólida que pode ser facilmente individualizada usando tanto sites MATLAB quanto GRAMM.

Resultados

A inibição da via de sinalização canônica do Wnt é conhecida por prejudicar significativamente a regeneração do RPE de zebrafish usando o paradigma de ablação genética (rpe65a:nfsB-eGFP) e a metodologia de manipulação farmacológica (IWR-1) descrita no protocolo³. Este experimento foi repetido aqui para validar um método automatizado para quantificar a regeneração de RPE de zebrafish com base na pigmentação. Os resultados resumidos abaixo abrangeram todas as etapas do pr...

Discussão

Este protocolo descreve a metodologia para ablto genético do RPE e mecanismos de estudo de degeneração e regeneração em zebrafish envelhecidos em larvas. Este protocolo também foi realizado com sucesso em zebrafish^{adulto 3}, mas com caracterização menos extensa, e é por isso que as larvas são o foco aqui. Aspectos críticos desta parte do protocolo (etapas 1-4) incluem: 1) adicionar 1,5x PTU a embriões antes do início da melanogênese, 2) descorioar embriões tratados com PTU em 2-3 dpf...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)	Millipore Sigma	D9542
6-well plates	Fisher Scientific	07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-539-13	Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen	Fisher Scientific	50-254-51	Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %	Fisher Scientific	BP231	Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)	Fisher Scientific	3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)	Labnet	I5110A
Fluorescence stereo microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16	Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-4	Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo	Millipore Sigma	5.04462	Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)	Fisher Scientific	BP117-100	Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)	Millipore Sigma	M3761	Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)	Millipore Sigma	P7629	Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free	Fisher Scientific	AA433689M	Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)	Millipore Sigma	P3813	Used to make 10 X PBS stock
Pronase	Millipore Sigma	PRON-RO
Shaking incubator	Benchmark	H2010	Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope	Leica	S9i	Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	91150-20	Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker	Scilogex	SK-D1807-E
Transfer pipette	Millipore Sigma	Z135003	3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Pentair	TRS1, TRS2, TRS5	Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)	FIJI (Fiji is Just ImageJ)	https://imagej.net/software/fiji/	Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos	MathWorks	https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html	Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support	MathWorks	https://www.mathworks.com/support.html