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Resumo

O protocolo apresenta um método para derivar organoides pulmonares humanos de tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides das vias aéreas 3D e 2D que ferem fielmente o epitélio das vias aéreas humanas.

Resumo

A falta de um modelo in vitro robusto do epitélio respiratório humano dificulta a compreensão da biologia e patologia do sistema respiratório. Descrevemos um protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos de células-tronco adultas no tecido pulmonar e induzir diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas. Os organoides pulmonares são então expandidos consecutivamente por mais de 1 ano com alta estabilidade, enquanto os organoides diferenciados das vias aéreas são usados para simular morfológica e funcionalmente o epitélio das vias aéreas humanas a um nível quase fisiológico. Assim, estabelecemos um modelo organoide robusto do epitélio das vias aéreas humanas. A expansão a longo prazo de organoides pulmonares e organoides diferenciados das vias aéreas gera uma fonte estável e renovável, permitindo aos cientistas reconstruir e expandir as células epiteliais das vias aéreas humanas em pratos culturais. O sistema organoide pulmonar humano fornece um modelo in vitro único e fisiologicamente ativo para várias aplicações, incluindo o estudo da interação entre vírus e hospedeiros, testes medicamentosos e modelagem de doenças.

Introdução

Os organoides tornaram-se uma ferramenta robusta e universal para a modelagem in vitro do desenvolvimento de órgãos e estudo da biologia e da doença. Quando cultivadas em um meio de cultura definido por fatores de crescimento, as células-tronco adultas (ASC) de uma variedade de órgãos podem ser expandidas em 3 dimensões (3D) e auto-montadas em aglomerados celulares semelhantes a órgãos compostos por múltiplos tipos de células, denominados organoides. O laboratório de Clevers relatou a derivação do primeiro organoide derivado do ASC, organoide intestinal humano, em 2009 1,2. Posteriormente, organoides derivados do ASC foram estabelecidos para uma variedade de órgãos e tecidos humanos, incluindo próstata 3,4, fígado 5,6, estômago 7,8,9, pâncreas10, glândula mamária11 e pulmão 12,13 . Esses organoides derivados do ASC mantiveram as propriedades críticas celulares, estruturais e funcionais do órgão nativo e mantiveram a estabilidade genética e fenotípica na cultura de expansão de longo prazo14,15.

Organoides também podem ser derivados de células-tronco pluripotentes (PSC), incluindo células de tronco embrionária (ES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPS)16. Enquanto organoides derivados do PSC exploram os mecanismos de desenvolvimento de órgãos para seu estabelecimento, as ASCs podem ser coagidas a formar organoides por meio da reconstrução de condições que imitam o nicho de células-tronco durante a autoconexão do tecido fisiológico ou reparação de tecidos. Os organoides derivados do PSC são modelos favoráveis para explorar o desenvolvimento e a organogênese, embora incapazes de atingir o nível de maturação comparável dos organoides derivados do ASC. O estado de maturação fetal dos organoides derivados do PSC e a complexidade para o estabelecimento desses organoides impedem substancialmente suas amplas aplicações para estudar biologia e patologia em tecidos maduros.

O trato respiratório humano, do nariz ao brônquio terminal, é forrado com o epitélio das vias aéreas, também chamado de epitélio ciliado pseudostratificado, que consiste em quatro tipos principais de células, ou seja, célula ciliada, célula de cálice, célula basal e célula do clube. Estabelecemos o organoide pulmonar humano derivado do ASC a partir de tecidos pulmonares humanos em colaboração com o laboratório 12,13 da Clevers. Esses organoides pulmonares são consecutivamente expandidos no meio de expansão por mais de um ano; a duração precisa varia entre diferentes linhas organoides obtidas de diferentes doadores. No entanto, em comparação com o epitélio das vias aéreas nativas, esses organoides pulmonares expansíveis de longo prazo não são maduros o suficiente, uma vez que as células ciliadas, a maior população celular nas vias aéreas humanas, são sub-representadas nesses organoides pulmonares. Assim, desenvolvemos um protocolo de diferenciação proximal e geramos organoides das vias aéreas 3D e 2D que, morfologicamente e funcionalmente, fenóquico das vias aéreas, a um nível quase fisiológico.

Aqui fornecemos um protocolo de vídeo para derivar organoides pulmonares humanos dos tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides 3D e 2D das vias aéreas.

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Protocolo

Toda a experimentação usando tecidos humanos descritos aqui foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 e UW21-695). O consentimento informado foi obtido dos pacientes antes da coleta de tecidos.

1. Derivação do organoide pulmonar humano

  1. Preparação de materiais experimentais
    1. Prepare o meio basal suplementando médio avançado DMEM/F12 com glutamina de 2 mM, HEPES de 10 mM, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
    2. Prepare o meio de expansão organoide pulmonar humano suplementando o meio basal com 10% R-spondin 1 meio condicionado, 10% noggin médio condicionado, 1x suplemento B27, 1,25 mM N-acetilcisteína, 10 mM nicotinamida, 5 μM de Y-27632, 500 nM de A-83-01, 1 μM de SB202190, 5 ng/mL de fator de crescimento fibroblst (FGF)-7, 20 ng/mL de FGF-10 e 100 μg/mL de primocina (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: O meio condicionado R-spondin 1 e Noggin pode ser substituído por R-spondin 1 (500 ng/mL) e Noggin (100 ng/mL).
    3. Pré-aquecimento uma placa de cultura de suspensão de 24 poços em uma incubadora de cultura celular. Use uma incubadora de cultura celular padrão com 5% de CO2 e atmosfera umidificada a 37 °C. Descongele a matriz do porão em uma geladeira de 4 °C. Mantenha a matriz do porão e a cultura média no gelo durante a experimentação.
  2. Isolamento celular dos tecidos pulmonares humanos para a cultura organoide 3D
    1. Procure tecidos pulmonares humanos recém-ressecados de cerca de 0,5 cm de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica devido a várias doenças. Transporte os tecidos pulmonares em 30 mL de meio basal à temperatura ambiente e processe o mais rápido possível dentro de uma capa de biossegurança.
    2. Moce tecidos pulmonares em pequenos pedaços (0,5-1 mm) com um bisturi estéril em um prato de cultura celular de 10 cm. Lave peças de tecido com 10 mL de meio basal frio em um tubo de centrífuga de 15 mL, seguida de centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C.
    3. Descarte o supernaspetivo e resuspenque a pelota em 8 mL de meio basal suplementado com colagemnase em uma concentração final de 2 mg/mL. Digerir os pedaços de tecido sacudindo o tubo a 120 rpm por 30-40 min a 37 °C.
    4. Pipeto para cima e para baixo por 20x para tesourar os pedaços de tecido digerido usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Empilhe um coador de 100 μm em um tubo de centrífugas de 50 mL e filtre a suspensão.
    5. Recupere as peças de tecido no coador com o meio basal e transfira-as para um tubo de centrífuga de 15 mL, seguida de uma segunda rodada de tesoura e filtragem. Podem ser realizadas filtragem adicional de tesoura 1x-2x para isolar mais células, especialmente quando um pequeno pedaço de tecido (por exemplo, <0,5 cm) é adquirido.
    6. Adicione FBS ao fluxo com uma concentração final de 2% para interromper a digestão, seguido de centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C.
    7. Resuspend a pelota celular em 10 mL de meio basal, seguido de centrifugação a 400 x g para 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
    8. (Opcional) Se muitos eritrócitos forem vistos na pelota (estimado pela cor da pelota), resuspende a pelota de célula em 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, adicione 10 mL de meio basal ao tubo, seguido de centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
    9. Resuspend a pelota em matriz fria do porão e mantenha no gelo. Adicionar 80-160 μL de matriz de porão para células recuperadas de um tecido pulmonar de tamanho em torno de 0,5 cm; a quantidade é suficiente para semear 2-4 gotículas.
    10. Dispense 40 μL de suspensão a cada poço de uma placa de cultura de suspensão pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa de cultura a 37 °C por 10-15 min. Deixe a matriz do porão se solidificar para formar uma gota.
    11. Adicione 500 μL de organoides pulmonares humanos meio de expansão complementado com 5 nM de Heregulin beta-1 para cada poço e incubar a placa em uma incubadora de cultura celular.
    12. Refrescar o meio a cada 3 dias. Remova o meio antigo mantendo a gota intacta e adicione o meio fresco com cautela. Passagem dos organoides após incubação por 10-14 dias. Use Heregulin beta-1 apenas na cultura inicial antes da primeira passagem.
    13. Observe os organoides sob um microscópio para garantir que os organoides não estejam incorporados com uma densidade celular muito alta. Se uma gotícula se desintegrar devido a uma densidade celular excessivamente alta, recupere e reindua os organoides e células com um maior volume de matriz de porão para fazer mais gotículas com uma densidade celular menor e desejável.

2. Expansão de organoides pulmonares humanos

  1. Prepare uma pipeta Pasteur queimando a ponta de uma pipeta Pasteur em uma chama, como um queimador bunsen, para reduzir a abertura de 1,5 mm para cerca de 1,0 mm de diâmetro. Esfrie as pipetas, seguidas de autoclaving para esterilizar. Molhe as pipetas com o meio basal para evitar a fixação e perda da célula durante a tesoura mecânica.
  2. Passagem de organoides pulmonares com cisalhamento mecânico
    1. Use uma ponta de 1 mL e pipeta para cima e para baixo para quebrar as gotículas obtidas acima. Em seguida, transfira os organoides junto com o tubo médio para uma centrífuga de 15 mL e ajuste o volume para 10 mL com meio basal frio. Descarte o supernatante após centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 °C
    2. Lave os organoides com 10 mL de meio basal frio mais uma vez. Resuspenda os organoides em 2 mL de meio basal frio. Pipeta para cima e para baixo para esmatar os organoides em pequenos pedaços com uma pipeta Pasteur.
    3. Suplemento com meio basal a um volume total de 10 mL, seguido de centrifugação a 300 x g para 5 min a 4 °C. Resuspend os fragmentos organoides com matriz de porão frio suficiente para permitir uma expansão de 1:3 a 1:5. Mantenha-se no gelo.
    4. Coloque 40 μL de suspensão organoide em cada poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa de cultura a 37 °C por 10-15 min. Deixe a matriz do porão se solidificar.
    5. Adicione 500 μL de meio de expansão organoide pulmonar a cada poço e incubar em uma incubadora de cultura celular. Refrescar o meio a cada 3 dias. Passagem os organoides a cada 2 semanas com uma razão de 1:3 a 1:5.
  3. Passagem de organoides pulmonares com trippsinização
    NOTA: A trippsinização é preferida quando é difícil cisar o organoide pulmonar em pequenos pedaços usando uma pipeta Pasteur, ou o tamanho dos organoides é altamente variável, ou as experimentações subsequentes requerem organoides de tamanho mais uniforme.
    1. Colher os organoides pulmonares conforme mostrado na etapa 2.2.1. Resuspend o organoide em 1 mL de enzima dissociação e incubar em um banho de água de 37 °C por 3-5 min.
    2. Adicione 1 mL de meio basal ao tubo. Tesourar os organoides mecanicamente, pipetando os organoides para cima e para baixo em pequenos pedaços usando uma tubulação Pasteur. Verifique o tamanho das peças organoides sob um microscópio a 4x de ampliação. Em seguida, adicione 40 μL de FBS para interromper a digestão.
      NOTA: Determine o tamanho dos fragmentos organoides sob o microscópio de acordo com o arranjo experimental. Se um experimento precisa de mais organoides ou organoides de tamanho mais uniforme, os organoides de tesoura em pedaços menores ou mesmo células únicas. Então, leva mais tempo, provavelmente 3 semanas, antes que os organoides estejam prontos para experimentação.
    3. Cubra com meio basal a um volume final de 10 mL, seguido de centrifugação a 300 x g para 5 min a 4 °C. Resuspend as peças organoides em matriz de porão frio com um volume suficiente para passagem com uma razão de 1:5-1:10. Mantenha-se no gelo.
    4. Coloque 40 μL de suspensão organoide em cada poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa de cultura a 37 °C por 10-15 min. Deixe a matriz do porão se solidificar.
    5. Suplementar com 500 μL de meio de expansão organoide pulmonar por poço e incubar em uma incubadora de cultura celular. Atualize o meio de expansão a cada 3 dias. Passagem os organoides após 2-3 semanas.
      NOTA: Cerca de 100 organoides são montados dentro de uma gotícula de 40 μL da matriz do porão. Os organoides pulmonares normalmente crescem melhor com uma densidade celular relativamente alta. Reinscreva os organoides com uma densidade celular menor se as gotículas se desintegrarem ou os organoides em crescimento se unirem devido à densidade celular excessivamente alta.

3. Diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas

  1. Prepare o meio de diferenciação proximal (meio PD) complementando o meio basal da interface líquida ar com suplemento de interface líquida de ar 1x, suplemento de manutenção da interface líquida de ar 1x, 4 μg/mL de heparina, 1 μM de hidrocortisona, 10 μM de Y-27632 e 10 μM de DAPT (ver Tabela de Materiais).
  2. Organoides das vias aéreas 3D
    1. Incubar organoides pulmonares no meio de expansão por 7-10 dias após a passagem via cisalhamento mecânico. Substitua o meio de expansão pelo meio PD. Incubar os organoides no meio dp por 14 dias em uma incubadora de cultura celular.
    2. Descarte o meio DP em cada poço. Adicione tampão de lise celular para colher o organoide diferenciado das vias aéreas para extração de RNA e detecção de expressão genética celular pelo ensaio RT-qPCR.
    3. Alternativamente, incubar os organoides a 37 °C por 60 minutos após a adição de 10 mM EDTA para desassociar os organoides em células únicas, seguido de análise de citometria de fluxo para examinar populações celulares. Os organoides estão prontos para várias manipulações experimentais.
  3. Organoide das vias aéreas 2D
    1. Prepare organoides pulmonares 3D suficientes para a cultura de diferenciação 2D. São necessárias 1,3 x 105 e 4,5 x 105 células para uma inserção de suporte permeável de 24 poços e uma inserção de suporte permeável de 12 poços, respectivamente.
    2. Após os organoides pulmonares 3D crescerem no meio de expansão por 2 semanas, digerir os organoides em células únicas e sementes nas pastilhas de 24 poços e 12 poços para gerar organoides das vias aéreas 2D.
    3. Pré-incubar as pastilhas com o meio basal durante a noite em uma incubadora de cultura celular. Adicione 250 μL e 500 μL de meio basal na câmara superior e inferior de uma placa de 24 poços, respectivamente. Para uma placa de 12 poços, adicione 500 μL e 1.000 μL de meio basal na câmara superior e inferior, respectivamente.
    4. Colher organoides pulmonares 3D conforme descrito na etapa 2.2.1. Resuspend os organoides com 1 mL de enzima dissociação e incubar em um banho de água de 37 °C por 3-5 min.
    5. Adicione 1 mL de meio basal ao tubo. Encarreça para cima e para baixo para transformar os organoides em células únicas com uma tubulação Pasteur e verificar as células sob um microscópio. Em seguida, adicione 40 μL de FBS para interromper a digestão.
    6. Filtre as células através de um coador de 40 μm em um tubo centrífuga de 50 mL. Transfira a suspensão da célula filtrada para um tubo de 15 mL. Cubra com meio basal a um volume total de 10 mL, seguido de centrifugação a 300 x g para 5 min a 4 °C.
    7. Resuspende a pelota, coletada de 24 gotículas (40 μL), em 1-2,5 mL de meio de expansão organoide pulmonar, dependendo da densidade celular nas gotículas. Conte o número de células com um contador de células sob um microscópio. Ajuste a concentração celular para 1,3 x 106/mL (para inserções de 24 poços) ou 9 x 105/mL (para inserções de 12 poços).
    8. Remova o meio basal das câmaras superior e inferior. Adicione 500 μL e 1.000 μL de meio de expansão na câmara inferior da inserção de 24 poços e inserção de 12 poços, respectivamente. Sementes 100 μL e 500 μL de suspensão celular preparada na etapa 3.3.7 na câmara apical da inserção de 24 poços e inserção de 12 poços, respectivamente.
    9. Incubar em uma incubadora de cultura celular por 2 dias. Substitua o meio de expansão pelo meio PD tanto na câmara apical quanto na parte inferior das placas. Incubar os organoides na incubadora de cultura celular por 14 dias e atualizar o meio DP a cada 3 dias.
      NOTA: Cílios móveis são perceptíveis nos organoides 3D e 2D sob um microscópio a partir do dia 7 após a incubação no meio PD. Após 14 dias de cultura de diferenciação no meio dp, os organoides das vias aéreas são maduros para várias manipulações experimentais.
    10. Meça a resistência elétrica trans-epitelial (TEER) a cada dois dias usando um sistema de medição de resistência elétrica de acordo com um protocolo padrão descrito em17.

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Resultados

Este protocolo permite a derivação de organoides pulmonares humanos com uma alta taxa de sucesso. Tecido pulmonar humano fresco é picado em pequenos pedaços, e depois decomposto com colagemnase. As células únicas resultantes estão embutidas na matriz do porão e incubadas no meio de expansão organoide pulmonar complementada com um coquetel de fatores de nicho para o crescimento das células-tronco epiteliais (passo 1.1.2). A Figura 1 mostra a microfotografia de células pulmonares re...

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Discussão

As vias aéreas humanas são forradas com o epitélio das vias aéreas, também conhecido como epitélio ciliado pseudostratificado. Os principais tipos celulares do epitélio das vias aéreas superiores são células ciliadas que permitem o movimento coordenado de seus cílios apical para expelir muco e partículas inaladas das vias aéreas, células de cálice que produzem e secretam muco, e células basais que revestem a membrana do porão e estão implicadas na regeneração. Nas pequenas vias aéreas, como os brônq...

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Divulgações

J. Z., C.L., e M.C.C. estão listados como inventores na patente de organoides das vias aéreas (publicação Nº: US-2021-0207081-A1). Os outros autores não declaram interesses concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos ao Centro de Ciências Panorômicas e Unidade de Microscópio Eletrônico, Li Ka Shing Faculty of Medicine, Universidade de Hong Kong, pela assistência em imagens confocal e citometria de fluxo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo financiamento do Fundo de Pesquisa Médica e de Saúde (HMRF, 17161272 e 19180392) da Secretaria de Alimentação e Saúde; Fundo Geral de Pesquisa (GRF, 17105420) do Conselho de Bolsas de Pesquisa; e Health@InnoHK, Comissão de Inovação e Tecnologia, o Governo da Região Administrativa Especial de Hong Kong.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents for lung organoid culture
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634010-
A8301Tocris2939500nM
B27 supplementInvitrogen17504-0441x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)Trevigen3533-010-070-80%
FGF-10Peprotech100-2620 ng/mL
FGF-7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMAX (glutamine)Invitrogen350500611x
HEPES 1MInvitrogen15630-05610 mM
Heregulin β-1Peprotech100-035 nM
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA91651.25 mM
NicotinamideSigma-AldrichN063610 mM
Noggin (conditional medium)home made-10x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Invitrogen15140-1221x
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
Rspondin1 (conditional medium)home made-10x
SB202190Sigma-AldrichS70671 µM
Y-27632Tocris12545 µM
Proximal differentiation medium
DAPTTocris263410 µM
Heparin SolutionStemCell Technology79804 µg/mL
Hydrocortisone Stock SolutionStemCell Technology79251 µM
PneumaCult-ALI 10X Supplementair liquid interface supplement
PneumaCult-ALI Basal MediumStemCell Technology05001air liquid interface basal medium
PneumaCult-ALI Maintenance Supplementair liquid interface maintenance supplement
Y-27632Tocris125410 µM
Equipment
Biological safety cabinetBaker1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 or 800Zeissconfocal microscope
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific42093483
Stereo-microscopeOlympus CorporationCKX31SF
CentrifugeEppendorf5418BG040397
Serological pipettorEppendorf
MicropipetteEppendorf
ZEN black or ZEN blue softwareZeissanalysis software
Consumables
12mm Trans-wellStemCell Technology#38023
12-well cell culture plateCellstar665970
15- and 50 ml conical tubesThermo Fisher ScientificL6BF5Z8118
24-well cell culture plateCellstar662160
6.5mm Trans-wellStemCell Technology#38024
Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µmSigma-AldrichSLGPR33RB
Microfuge tubesEppendorf
Micropipette tipsThermo Fisher ScientificTFLR140-200-Q21190531
Pasteur pipette glassThermo Fisher Scientific22-378893
Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)Thermo Fisher ScientificBA08003, 08004, 08005
Antibodies
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594InvitrogenA11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594InvitrogenA11037
Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Mouse Anti-Cytokeratin 5Abcamab128190
Mouse Anti-FOX J1Invitrogen14-9965-82
Mouse Anti-Mucin 5ACAbcamab3649
Mouse Anti-β-tubulin 4SigmaT7941
Rabbit Anti-p63Abcamab124762
Rat Anti-Uteroglobin/CC-10R&D SystemsMAB4218-SP
Other reagent
TrypLE Select Enzyme (10X)Thermo Fisher ScientificA1217701dissociation enzyme

Referências

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  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
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