Sensibilidade da membrana mitocondrial interna para na+ revela piscinas de COQ funcionais parcialmente segmentadas

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio comparativo, utilizando atividades complexas mitocondriais CI+CIII e CII+CIII na presença ou ausência de Na⁺, para estudar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas.

Resumo

As piscinas de ubiquinona (CoQ) na membrana mitocondrial interna (IMM) são parcialmente segmentadas para enzimas complexas I ou dependentes de FAD. Tal subdivisão pode ser facilmente avaliada por um ensaio comparativo usando NADH ou succinato como doadores de elétrons em mitocôndrias descongeladas congeladas, nas quais a redução do citocromo c (cyt c) é medida. O ensaio se baseia no efeito de Na⁺ no IMM, diminuindo sua fluidez. Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade naDH-cyt c oxidoreductase e atividades de succinato-cyt c oxidoreductase na presença de NaCl ou KCl. As reações, que dependem da mistura de reagentes em uma cuvette de forma stepwise, são medidas espectrofotometricamente durante 4 minutos na presença de Na⁺ ou K⁺. A mesma mistura é realizada em paralelo na presença dos inibidores específicos da enzima, a fim de subtrair a alteração inespecífica na absortância. A atividade nadh-cyt c oxidoreductase não diminui na presença de nenhuma dessas alcaações. No entanto, a atividade de succinato-cyt c oxidoreductase diminui na presença de NaCl. Este simples experimento destaca: 1) o efeito de Na⁺ na diminuição da fluidez do IMM e da transferência de CoQ; 2) que o supercomplexO I+III₂ protege a transferência de ubiquinona (CoQ) de ser afetada pela redução da fluidez do IMM; 3) que a transferência de CoQ entre CI e CIII é funcionalmente diferente da transferência de CoQ entre CII e CIII. Esses fatos sustentam a existência de piscinas de CoQ funcionalmente diferenciadas no IMM e mostram que podem ser reguladas pelo ambiente Na⁺ em mudança das mitocôndrias.

Introdução

O sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) é a principal via que conduz a síntese de triptosfato de adenosina (ATP), a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e o consumo de equivalentes redutores, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) ou succinato, por mitocôndrias. O sistema OXPHOS é composto por cinco complexos proteicos: Complexo I (CI) oxida NADH e reduz o CoQ em ubiquinol (CoQH₂). O Complexo II (CII) oxida o succinato em fumarate e reduz o CoQ em CoQH₂. Complexo III (CIII) oxida CoQH₂ de volta ao CoQ, reduzindo citocromo c (cyt c). Finalmente, o complexo IV (CIV) oxida o cit c e reduz o oxigênio à água. Esta cadeia de oxidoredução, a chamada cadeia de transporte de elétrons (mETC), é acoplada ao bombeamento de H⁺ através do IMM, que cria um gradiente eletroquímico usado pelo complexo V (CV) para fosfortar difosfato de adenosina (ADP) em ATP.

os complexos mETC podem estar sozinhos no IMM ou montar em estruturas quaternárias chamadas supercomplexos. O CIV pode montar com CIII, formando o III₂+IV ou Q-respirasome (como é capaz de respirar na presença de CoQH₂)^1,2,3 ou formando homodimers ou homooligomers⁴. O CIII pode interagir com a CI, formando o supercomplexo I+III₂₅. Finalmente, a CI também é capaz de interagir com o Q-respirasome, construindo o I+III₂+IV ou N-respirasome (pois pode respirar consumindo NADH)^1,6,7,8,9,10.

CoQ e cyt c são portadores de elétrons móveis encarregados da transferência de elétrons de CI/CII para CIII, e de CIII para CIV, respectivamente. Se os supercomplexos impõem ou não uma restrição local funcional para essas operadoras tem sido uma questão de intenso debate ao longo das últimas duas décadas 2,7,11,12,13,14,15,16,17. No entanto, vários grupos independentes demonstraram que o CoQ e o cyt c podem ser segmentados funcionalmente em piscinas no IMM. Em relação ao CoQ, ele pode ser segmentado funcionalmente em um pool específico de CoQ para CI (CoQ^NAD) e outro pool dedicado às enzimas dependentes de FAD (CoQ^FAD)1,7,12,18,19. No entanto, para diferenciar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas, foram necessárias a superexpressão da oxidase alternativa (AOX) e a geração de mutantes específicos de MTDNA, que podem montar IC na ausência de CIII, foram necessários ^1,19,20.

O mecanismo de produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) durante a hipóxia era desconhecido até recentemente. Após a hipóxia aguda, a IC sofre a transição ativa/deativa (A/D), que envolve a diminuição de sua atividade de oxidoreductase de bombeamento H⁺ . Tal diminuição no bombeamento H⁺ acidifica a matriz mitocondrial e dissolve parcialmente os precipitados de cálcio-fosfato na matriz mitocondrial, liberando ca²⁺solúvel. Esse aumento no Ca²⁺ solúvel ativa o trocador Na⁺/Ca²⁺ (NCLX), que extrude o Ca²⁺ em troca de Na⁺. Mitocondrial Na⁺ o aumento interage com fosfolipídios no lado interno do IMM, diminuindo sua fluidez e transferência de CoQ entre CII e CIII, finalmente produzindo ânion de superóxido, um sinal de redox²¹. Curiosamente, a transferência de CoQ só foi diminuída entre CII e CIII, mas não entre CI e CIII, destacando que 1) Na⁺ foi capaz de modular apenas uma das piscinas coq existentes nas mitocôndrias; 2) existem piscinas de CoQ funcionalmente diferenciadas no IMM. Assim, um protocolo amplamente utilizado para o estudo de atividades enzimárias mitocondriais pode ser utilizado para avaliar a existência das piscinas coq mencionadas.

O protocolo atual baseia-se na medição da redução do cit c oxidado, o substrato do CIII, por absorção na presença de succinato (ou seja, substrato CII) ou NADH (ou seja, substrato ci). A mesma amostra é dividida em duas, uma das quais será tratada com LCI, e a outra com a mesma concentração de NaCi. Dessa forma, dado que o Na⁺ diminui a fluidez do IMM, se o CoQ existisse em um pool único no IMM, tanto CI+CIII quanto CII+CIII diminuiriam na presença de Na⁺. No entanto, se o CoQ existisse em pools de CoQ funcionais parcialmente segmentados, o efeito de Na⁺ seria evidente principalmente (ou apenas) sobre a atividade CII+CIII, mas não no CI+CIII. Como publicado recentemente²¹, Na⁺ afeta apenas a transferência de CoQ entre CII e CIII (Figura 1C,D), mas não entre CI e CIII (Figura 1A,B).

Este protocolo, juntamente com uma panóplia de técnicas, tem sido utilizado para confirmar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas no IMM, uma dedicada à CI (ou seja, CoQ^NAD), e outra dedicada às enzimas ligadas à FAD (ou seja, CoQ^FAD)^1,3,7; observação que, embora continue a ser debatida²², foi corroborada independentemente por vários grupos ^7,19. Assim, a supermontagem da CI em supercomplexos impacta na mobilidade local do CoQ, facilitando seu uso pelo CIII dentro do supercomplexo 1,7,13,14,23,24,25.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo comitê de ética institucional do Centro Nacional de Investigações Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Espanha, de acordo com a Diretiva da União Europeia de 22 de setembro de 2010 (2010/63/UE) e com o Decreto Real Espanhol de 1 de fevereiro de 2013 (53/2013). Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados e seu sofrimento.

NOTA: Este ensaio comparativo para estudar a segmentação de piscinas de CoQ mitocondrial é descrito da seguinte forma:

1. Quantificação de proteínas

1. Congele e descongele as mitocôndrias isoladas²⁶ de um fígado de camundongo tipo selvagem três vezes (ou seja, membranas mitocondriais) antes da experimentação para tornar as organelas permeáveis aos substratos de reação.
2. Quantifique a quantidade proteica da amostra isolada de mitocôndrias pelos métodos de Bradford ou ácido bicinchonínico (BCA). No caso de Bradford, adicione 2 μL de amostra em 1 mL de reagente 1x Bradford.
3. Divida a amostra em quatro subsampleas de 20 μg cada (a: A, B, C, D; Figura 2A).

2. Medição da atividade CI+CIII

NOTA: Esta parte do protocolo utiliza as amostras A e B para medir a atividade CI+CIII (Figura 2B).

1. Divida as amostras A e B em duas subamostras de 10 μg cada (a1, A2, B1 e B2). Misture cada uma das subamplegas em um cuvette de 1 mL com 30 μL de cyt c (10 mg/mL), 10 μL de malonato de 100 mM e adicione tampão C1/C2 pré-aquecido (Tabela 1) a 37 °C até 980 μL (979 μL para cuvettes A2 e B2).
   ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso dos reagentes tóxicos malonato e cianeto de potássio.
   NOTA: cyt c (10 mg/mL) deve ser preparado fresco misturando 10 mg de cit c em 1 mL de 10 mM K₂HPO₄ solução, pH ajustado para 7,2, e deve ser mantido em gelo durante todo o experimento.
2. Adicione 10 μL de 1 M KCl nas cuvetas A1 e A2, e adicione 10 μL de 1 M NaCl nas cuvetas B1 e B2.
3. Adicione 1 μL de rotenona de 1 mM na cuvette contendo subsames A2 e B2.
   ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso do reagente tóxico rotenona.
4. Logo antes da medição, adicione 10 μL de NADH (10 mM) em todas as cuvetas.
   NOTA: O 10 μL é de preferência adicionado no degrau da cuvette, de modo que a reação começa após a mistura.
5. Misture a cuvette girando-a cuidadosamente três vezes. Coloque-o no leitor de cuvette de absorção (espectrofotômetro UV/VISJASCO).
6. Clique em Measure > Parâmetros > Geral e defina os parâmetros de medição em Comprimento de Onda: 550 nm e Tempo: 4 minutos de leitura; pressione os botões Aceitar e Iniciar para iniciar o experimento.
7. No final da medição, salve a inclinação que compreende o aumento linear da absorvância clicando em Arquivo e Salve As. A inclinação também pode ser coletada manualmente.

3. Medindo a atividade CII+CIII

NOTA: Esta parte do protocolo utiliza as amostras C e D para medir a atividade CII+CIII (Figura 2C).

1. Divida as amostras C e D em duas subamostras de 10 μg cada (ou seja, C1, C2, D1 e D2). Misture cada uma das subamplenas em um cuvette de 1 mL com 30 μL de cyt c (10 mg/mL), 1 μL de rotenona de 1 mM e adicione o tampão C1/C2 pré-aquecido a 37 °C até 980 μL (970 μL para cuvettes C2 e D2).
   ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso dos reagentes tóxicos cianeto de potássio e rotenona.
   NOTA: cyt c (10 mg/mL) deve ser preparado fresco misturando 10 mg de cit c em 1 mL de 10 mM K₂HPO₄ solução, pH ajustado para 7,2, e deve ser mantido em gelo durante todo o experimento.
2. Adicione 10 μL de 1 M KCl nas cuvetas C1 e C2, e adicione 10 μL de 1 M NaCl nas cuvetas D1 e D2.
3. Adicione 1 μL de 1 mM de antimicina A na cuvette contendo subsames C2 e D2.
   ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso da antimicina de reagente tóxico A.
4. Logo antes da medição, adicione 10 μL de succinato (1 M) em todas as cuvetas.
   NOTA: O 10 μL é de preferência adicionado no degrau da cuvette, de modo que a reação começa após a mistura.
5. Misture a cuvette com cuidado, virando-a três vezes. Coloque-o no leitor de cuvette de absorção (espectrômetro UV/VIS).
6. Clique em Measure > Parâmetros > Geral e defina os parâmetros de medição em Comprimento de Onda: 550 nm e Tempo: 4 minutos de leitura; pressione os botões Aceitar e Iniciar para iniciar o experimento.
7. No final da medição, salve a inclinação que compreende o aumento linear da absorvância clicando em Arquivo e Salve As. A inclinação também pode ser coletada manualmente.

Resultados

Os resultados típicos deste protocolo estão representados abaixo (Figura 3). Como a absorvência c reduzida se localiza a 550 nm, todas as subsampeções desinibidas devem mostrar um aumento na absorvância de 550 nm. Subsamples inibidas, o ideal é mostrar uma inclinação plana ou ligeiramente crescente (Figura 3). As encostas de subsamtras inibidas devem ser subtraídas de subsampleções desinibidas.

As amostras A e B, ambas cor...

Discussão

Embora este protocolo represente um procedimento muito simples para identificar a existência das piscinas de CoQ parcialmente segmentadas, existem algumas medidas críticas a serem tomadas em conta. Substratos (ou seja, NADH ou succinato) são preferencialmente adicionados por último, uma vez que a autooxidação desses compostos pode ocorrer. A inversão de Cuvette deve ter cuidado para evitar a formação de bolhas que possam interferir na leitura.

Além disso, a presente técnica apresent...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	10775835001
Bradford protein assay	Bio-Rad	5000001
Cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C7752
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Malonic acid	Sigma-Aldrich	M1296
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
Potassium cyanide	Sigma-Aldrich	207810
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Spectra Manager software	JASCO	version 2
Spectrophotometer	UV/VISJASCO
Succinate	Sigma-Aldrich	398055