Técnicas moleculares e imunológicas em um modelo de rato geneticamente modificado de tumor estrommal gastrointestinal

Resumo

O objetivo deste manuscrito é descrever o modelo de mouse Kit^V558Δ/+ e técnicas para dissecção e processamento bem-sucedidos de amostras de camundongos.

Resumo

O tumor estromal gastrointestinal (GIST) é o sarcoma humano mais comum e é tipicamente impulsionado por uma única mutação no receptor KIT. Entre os tipos de tumores, inúmeros modelos de camundongos foram desenvolvidos para investigar a próxima geração de terapias contra o câncer. No entanto, no GIST, a maioria dos estudos in vivo usa modelos de mouse xenoenxerto que têm limitações inerentes. Aqui, descrevemos um modelo de camundongos imunocompetente, geneticamente modificado, de tumor estromal gastrointestinal que abriga uma mutação Kit^V558Δ/+ Neste modelo, o KIT mutante, o oncogene responsável pela maioria dos GISTs, é impulsionado por seu promotor endógeno que leva a um GIST que imita a aparência histológica e o infiltrado imunológico visto em GISTs humanos. Além disso, este modelo tem sido usado com sucesso para investigar terapias moleculares e imunológicas direcionadas. Aqui, descrevemos a criação e manutenção de uma colônia de ratos Kit^V558Δ/+ Além disso, este artigo detalha o tratamento e a aquisição de GIST, drenando linfonodos mesentéricos e ceco adjacente em camundongos Kit^V558Δ/+ , bem como preparação de amostras para análises moleculares e imunológicas.

Introdução

GIST é o sarcoma mais comum em humanos com uma incidência de cerca de 6.000 casos nos Estados Unidos da América¹. GIST parece se originar das células pacemaker gastrointestinal chamadas células intersticiais de Cajal, e é tipicamente impulsionado por uma única mutação no KIT de quinase tyrosina ou PDGFRA². A cirurgia é o pilar do tratamento para GIST e pode ser curativa, mas pacientes com doença avançada podem ser tratados com o inibidor de tyrosina quinase (TKI), imatinib. Desde sua introdução, há mais de 20 anos, o imatinib transformou o paradigma do tratamento em GIST, melhorando a sobrevida em doenças avançadas de 1 para mais de 5 anos ^3,4,5. Infelizmente, o imatinib raramente é curativo devido às mutações adquiridas do KIT, por isso novos tratamentos são necessários para este tumor.

Os modelos de camundongos são uma importante ferramenta de pesquisa na investigação de novas terapias em câncer. Múltiplos modelos de xenoenxerto subcutâneo e xenoenxerto derivados do paciente foram desenvolvidos e investigados em GIST ^6,7. No entanto, camundongos imunodeficientes não representam totalmente o GIST humano, uma vez que os GISTs abrigam perfis imunológicos diferenciais dependendo de sua mutação oncogênica, e alterar o microambiente tumoral gastrointestinal melhora os efeitos da terapia TKI ^8,9. O mouse Kit^V558Δ/+ tem uma exclusão germinal heterozigous em Kit exon 11, que codifica o domínio justxtamembrano, o local mais comumente mutado no GIST¹⁰ humano. Os camundongos Kit^V558Δ/+ desenvolvem um único cecal GIST com 100% de penetração, e os tumores têm histologia semelhante, sinalização molecular, infiltração imunológica e resposta à terapia como GIST ^8,11,12,13. Aqui, descrevemos a reprodução, o tratamento e o isolamento e processamento de espécimes em camundongos Kit^V558Δ/+ para uso em pesquisas moleculares e imunológicas em GIST.

Protocolo

Todos os camundongos foram alojados em condições livres de patógenos na Universidade da Pensilvânia de acordo com as diretrizes do NIH e com a aprovação da IACUC da Universidade da Pensilvânia. A eutanásia foi realizada após os procedimentos operacionais padrão do Laboratório de Recursos Animais da Universidade da Pensilvânia.

1. Kit^V558Δ/+ reprodução de camundongos

1. Backcross do Kit^V558Δ/+ ratos mais de 10 vezes em um fundo C57BL/6J usando ratos C57BL/6J. Para isso, crie o kit^{macho V558Δ/+} com camundongos C57BL/6J fêmeas a uma proporção de 1:2.
   NOTA: O genótipo homozigoso kit^{V558Δ/V558Δ} é letal no útero. É possível criar camundongos kit^V558Δ/+ fêmeas com camundongos C57BL/6J machos, mas o tamanho da ninhada é cerca de metade do visto de camundongos fêmeas selvagens C57BL/6J. Além disso, camundongos kit^V558Δ/+ fêmeas produzem ninhadas limitadas após 4 meses de idade.
2. Genótipo os filhotes aos 7-14 dias de idade por recorte do dedo do pé para confirmar a presença do genótipo kit^V558Δ/+ Use o primer para a frente: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; repórter 1: CCTCGACAACCTTCCA; primer reverso: TTGCGTCGGGTCTATATTAAACAT; e repórter 2: TCTCCTCGACCTTCCA para genotipagem.

2. Kit^V558Δ/+ tratamento do mouse

1. Idade e sexo combinam com o Kit^V558Δ/+camundongos antes do tratamento. Use os camundongos com idade e sexo em coortes, pois os tumores de camundongos kit^V558Δ/+ femininos são maiores do que os de camundongos machos. Trate os camundongos com 8-12 semanas de idade, momento em que os tumores são estabelecidos (Figura 1).
2. Dar inibidores de tyrosina quinase oralmente ou por injeção intraperitoneal (i.p.); Os tumores ^{kit V558Δ/+} são sensíveis aos inibidores da quinase de tirasina. Forneça imatinibe em uma dose de 600 mg/L em água potável ou injeções i.p. de 45 mg/kg duas vezes por dia. Meça a redução do peso tumoral utilizando escamas digitais após a dissecção do tumor, como mostrado na etapa 3, que é de aproximadamente 50% em 1 semana e 80% em 4 semanas após o tratamento com imatinibe (Figura 2).

3. Kit^V558Δ/+ colheita de órgãos do rato

1. Eutanize camundongos por narcose CO₂ a uma taxa de fluxo de 60% de volume de câmara por minuto. Deixe os ratos na câmara por pelo menos 2 minutos após a respiração ter cessado, em seguida, realizar luxação cervical para confirmar a morte.
2. Esterilize todos os instrumentos, use luvas durante todo o procedimento e mantenha um campo estéril. Prepare a pele com 70% de etanol. Faça uma incisão vertical de 2 cm usando uma tesoura e entre na cavidade abdominal. Lise severamente qualquer aderência intra-abdominal.
3. Para remover o linfonodo mesentérico drenante, siga os passos descritos abaixo.
   1. Identifique o ceco e levante sua mesenteria superiormente. Aproximadamente no meio do caminho até a base da mesenteria colonia, identifique o linfonodo mesentérico e dissefique-o bruscamente. O linfonodo é off-white e cerca de 0,5 cm x 0,5 cm de tamanho.
   2. Divida o tecido linfático em terços para isolamento de proteínas, histologia e suspensão de células únicas, conforme necessário. Para suspensões de células únicas, coloque tecido linfático em 20 mL de mídia livre de soro (RPMI) e mantenha no gelo.
4. Para o isolamento do GIST e do ceco, siga os passos descritos abaixo.
   1. O ceco em camundongos Kit^V558Δ/+ é substituído principalmente por um GIST. Divida cuidadosamente a junção ileocólica da base do tumor. Para coletar o ceco, divida o cólon novamente, 2 cm proximal à base do tumor.
   2. Em 50%-60% dos camundongos Kit^V558Δ/+ , a cabeça do tumor contém uma tampa de tecido cecal, que normalmente contém fluido sêmérico, mas raramente pode conter pus (Figura 3). Disseca o tecido da tampa para longe do tecido tumoral.
   3. Divida o tecido tumoral e/ou ceco em terços para isolamento de proteínas, histologia e suspensão de células únicas, conforme necessário. Para suspensões unicelulares, coloque tecido tumoral ou ceco no HBSS com 2% de FCS, o suficiente para cobrir a amostra e manter no gelo.

4. Análise de manchas ocidentais do tecido GIST

1. Prepare o tampão de lise tecidual contendo 50 mM TrisHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, detergente 1% não dedesaturado, 2 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, 10 mM NaF e 20 μl/ml mistura inibidora de proteínaase.
2. Prepare uma solução salina tamponada 1x Tris com 1% de Tween 20 (TBST) combinando 1800 mL de água deionizada, 2 mL de Tween 20 e 200 mL de soro fisiológico 10x Tris-tamponado (TBS).
3. Resuspend tecido a partir do passo 3.4.3 em um tubo FACS em 5mL/g de tampão de lise tecidual e homogeneizar duas vezes com um homogeneizador mecânico a 15.000 rpm para 15 s no gelo. Incubar lysate por 30 minutos no gelo.
4. Transfira para um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL. Centrifugar em velocidade máxima por 20 min a 4 °C. Transfira supernante para um novo tubo de microcentrífuga.
5. Execute lysates em um gel de 4% a 15% de gradiente, depois transfira para uma membrana de nitrocelulose, como descrito em¹⁴.
6. Lave a membrana uma vez em 1x TBS por 5 min e depois bloqueie a membrana em 5% de leite por 1h. Novamente, lave a membrana uma vez em 1x TBS por 10 minutos.
7. Incubar membrana em anticorpo primário diluído 1:1000 em 5% BSA a 4 °C durante a noite. Lave a membrana 3x em 1x TBST por 10 min cada. Incubar a mancha com anticorpo secundário diluído 1:2500 em 2,5% de leite por 1h à temperatura ambiente.
8. Lave a membrana uma vez em 1x TBS por 5 min. Adicione substrato HRP suficiente para cobrir a membrana, tipicamente 200-500 μL, e use um imager digital para detectar e quantificar a quemiluminescência.

5. Imunohistoquímica do tecido GIST

1. Fixar tecido a partir da etapa 3.3.2 ou 3,4,3 em 4% de paraformaldeído a 4 °C durante a noite. Armazene tecido em 70% EtOH até estar pronto para processamento. Blocos de incorporação e seção com 5 μm de espessura em lâminas de vidro, como descrito^15,16.
2. Detecção imunohistoquímica completa usando um kit básico de imunodetecção, como descrito anteriormente¹⁷.

6. Suspensão celular única do linfonodo mesenérico

1. Despeje a mídia RPMI com a amostra do linfonodo da etapa 3.3.2 sobre um filtro de 100 μm. Mova o filtro para o novo linfonodo cônico de 50 mL e mash com a extremidade macia de uma seringa de plástico de 3 mL. Lave o filtro com 20 mL de mídia RPMI.
2. Centrifugar o filtrado a 450 x g a 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante.
3. Resuspend pelotas em 20 mL de 1% FBS em PBS (tampão de contas) e despeje sobre um filtro de 40 μm. Pegue o filtrado da célula. Conte células usando um hemócito.
4. Centrifugar o filtrado a 450 x g a 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante. Resuspend em tampão de contas a 6 x 10⁷ células/mL para citometria de fluxo.

7. Suspensão de célula única do GIST

1. Prepare o tampão de colagenase adicionando 250 mg de colagenase IV, um comprimido de inibidor de protease sem EDTA e 100 μL de DNase I a 50 mL de HBSS. Gire por 10 minutos à temperatura ambiente até dissolver.
2. Coloque GIST em um prato estéril e adicione 2,5 mL de tampão de colagenase. Tumor mince usando um bisturi estéril e uma tesoura até que o tumor esteja em fragmentos finos. Use uma pipeta grande para aspirar o tumor e colagenase em um tubo de 50 mL.
3. Incubar em uma incubadora a tremer a 100 rpm a 37 °C por 30 min. Sacie a reação com 2 mL de FBS.
4. Despeje colagenase com espécime GIST sobre um filtro de 100 μm e tumor de purê com a extremidade macia de uma seringa plástica de 3 mL e colete em um tubo de 50 mL. Lave o filtro com 20 mL de HBSS. Centrifugar o filtrado a 450 x g, 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante.
5. Resuspenda a pelota em 20 mL de tampão de contas e despeje sobre um filtro de 40 μm. Colete o filtrado e conte células usando um hemócito. Centrifugar o filtrado a 450 x g, 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante. Resuspend em tampão de contas a 6 x 10⁷ células/mL para citometria de fluxo.

8. Suspensão de célula única do ceco

1. Prepare o tampão de colagenase como na etapa 7.1. Usando uma tesoura, divida o ceco longitudinalmente para expor a mucosa interna. Corte em seções de 0,5 cm e coloque em um tubo de 50 mL com 5 mL de HBSS com 2% de FBS. Agite vigorosamente por 30 s, centrífuga a 450 x g por 20 s, depois aspire o supernatante.
2. Adicione 5 mL de HBSS com 2 mM EDTA. Incubar em uma incubadora de agitação a 37 °C a 100 rpm por 15 min. Centrifugar a 450 x g para 20 s. Aspire o supernatante.
3. Adicione 5 mL de HBSS. Agite vigorosamente por 30 s, centrífuga a 450 x g por 20 s, depois aspire o supernatante. Repita mais uma vez.
4. Adicione 5 mL de tampão de colagenase. Incubar em uma incubadora a 37 °C por 30 min a 100 rpm. Agite vigorosamente a cada 10 minutos. Sacie a reação com 2 mL de FBS.
5. Despeje colagenase com espécime de ceco sobre um filtro de 100 μm e amasse com a extremidade macia de uma seringa plástica de 3 mL. Lave o filtro com 20 mL de HBSS. Coletar filtrado.
6. Centrifugar o filtrado a 450 x g por 5 min a 4 °C. Aspire o supernatante. Resuspend pelotas em 20 mL de tampão de contas e despeje sobre um filtro de 40 μm. Coletar células filtras e contar usando um hemótmetro.
7. Centrifugar o filtrado a 450 x g por 5 min a 4 °C. Aspire o supernatante. Resuspend em tampão de contas a 6 x 10⁷ células/mL para citometria de fluxo.

Resultados

O modelo de mouse Kit^V558Δ/+ permite a investigação de terapêutica em um modelo de camundongo imunocompetente. Os camundongos Kit^V558Δ/+ têm uma vida útil média de 8 meses devido à obstrução intestinal progressiva (Figura 4). Tumores do Kit^V558Δ/+ camundongos expressam marcadores canônicos de GIST incluindo o KIT de quinase tyrosina e o canal transmembrano DOG1 (

Discussão

O modelo de mouse Kit^V558Δ/+ é uma poderosa ferramenta de pesquisa na análise molecular e imunológica do GIST. Embora a estratégia de reprodução exija uma única cruz, o uso de coortes de camundongos Kit^V558Δ/+ em experimentos que analisam a resposta ao tumor requer uma reprodução extensiva. Os camundongos devem ter idade e sexo compatível para garantir pesos tumorais semelhantes, e 10% dos camundongos morrem antes das 8 semanas de idade quando os tumores são estabeleci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 micron filter	EMSCO	1194-2360
1x RBC lysis buffer	Life Technologies	00-4333-57
3mL syringe	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl	Bio-Rad	4561083
4% Paraformaldehyde Solution	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 micron filter	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 micron filter	EMSCO	1194-2350
AKT antibody (C67E7)	Cell Signaling	4691
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Complete mini edta free protease inhibitor	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific
Disposable Scalpels	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 antibody	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenizer	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylate	Selleck Chemicals	S1026
KIT antibody (D13A2)	Cell Signaling	3074
KitV558Δ/+ Genotyping	Transnetyx
Microcentrifuge tubes (1.5mL)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm	Rio-Rad	1620145
Nonfat Dry Milk	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
p-AKT antibody (S473)	Cell Signaling	4060
p-ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9101
p-KIT antibody (Y719)	Cell Signaling	3391
PMSF Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	201154
Sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
vivaCT 80 platform	Scanco medical