Medição in vivo de neuropeptídeos por imunoprobe capacitivo no coração suíno

Resumo

Métodos imunoquímicos estabelecidos para medir transmissores de peptídeos in vivo dependem de microdiálise ou desenho de fluido a granel para obter a amostra para análise offline. No entanto, estes sofrem de limitações espessotemporais. O presente protocolo descreve a fabricação e aplicação de um biosensor de imunoprobe capacitivo que supera as limitações das técnicas existentes.

Resumo

A capacidade de medir biomarcadores in vivo relevantes para a avaliação da progressão da doença é de grande interesse para as comunidades científicas e médicas. A resolução dos resultados obtidos a partir dos métodos atuais de medição de certos biomarcadores pode levar vários dias ou semanas para ser obtida, pois podem ser limitados em resolução tanto espacial quanto temporal (por exemplo, microdiálise com compartimento fluido de fluido interssumatar analisado por ensaio imunossorbente ligado à enzima [ELISA], cromatografia líquida de alto desempenho [HPLC], ou espectrometria de massa); assim, sua orientação de diagnóstico e tratamento oportuno é interrompida. No presente estudo, é relatada uma técnica única para detectar e medir transmissores de peptídeos in vivo através do uso de um biosensor de imunoprobe capacitivo (sonda CI). O protocolo de fabricação e a caracterização in vitro dessas sondas são descritos. São fornecidas medidas de liberação in vivo de neuropeptídeo evocado por estimulação simpática (NPY). A liberação do NPY está correlacionada com a liberação simpática da norepinefrina para referência. Os dados demonstram uma abordagem para a medição rápida e localizada de neuropeptídeos in vivo. As aplicações futuras incluem avaliação intraoperatória em tempo real da progressão da doença e implantação minimamente invasiva de cateter dessas sondas.

Introdução

Vários métodos químicos para detectar e quantificar biomarcadores são rotineiramente utilizados tanto na química proteica quanto nos diagnósticos clínicos, particularmente nos diagnósticos de câncer e na avaliação da progressão de doenças cardiovasculares. Atualmente, métodos como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) e espectrometria de massa dependem da coleta de amostras do compartimento vascular ^1,2,3 por extrato de fluido a granel ou do compartimento intersticial por microdiálise. A microdiálise emprega um tubo de membrana semipermeável de comprimento conhecido que é colocado em uma região de interesse. O fluido de coleta é perfundido através do tubo ao longo de vários minutos⁴ para coletar a amostra para análise⁵, limitando assim a resolução temporal. Dessa forma, as amostras coletadas fornecem apenas um valor médio ao longo do tempo do microambiente local e são limitadas pela taxa de perfusão e coleta de volume amostral suficiente. Além disso, esses métodos requerem o agrupamento de dados experimentais e a média de sinais; portanto, eles podem deixar de explicar a variabilidade entre os sujeitos. É importante ressaltar que o tempo entre a coleta amostral e a análise offline subsequente impede a intervenção clínica imediata e a terapêutica.

No presente protocolo, é delineado o uso de um biosensor de imunoprobe capacitivo (teste CI) para a detecção elétrica de peptídeos bioativos específicos. Neuropeptídeo Y (NPY), liberado de neurônios simpáticos pós-gânglios que inervam a vasculatura, endocárdio, cardiomioces e gânglios intracardiac, é um grande transmissor de peptídeos neuromodulatórios no sistema cardiovascular 6,7,8,9. O método aqui apresentado é projetado para medir o NPY, e a viabilidade experimental é demonstrada em um modelo de coração suíno. No entanto, essa abordagem se aplica a qualquer peptídeo bioativo para o qual um anticorpo seletivo esteja disponível¹⁰. Este método conta com a junção capacitiva entre uma sonda de fio de platina e o fluido condutor na ponta funcionalizada^11,12. Nesta aplicação, a interação foi mediada através de um anticorpo contra o neuropeptídeo alvo (NPY), que estava ligado à ponta do eletrodo, interligando o ambiente de fluidos condutivos. Esta funcionalidade foi obtida através da eletrodeposição de polidopamina reativa na ponta da sonda de fio de platina ^10,13.

Quando a sonda funcionalizada por anticorpos é colocada em uma região de interesse em vivo, a liberação endógena do NPY evocada leva à ligação aos anticorpos de captura na ponta da sonda, e o fluido condutor na superfície do eletrodo é deslocado pela proteína NPY. A alteração local no ambiente elétrico resulta no deslocamento de fluido de alta mobilidade e alta dielétrica com uma molécula imóvel e estaticamente carregada. Isso altera a interface eletrodo-fluido e, portanto, sua capacitância, que é medida como uma mudança na corrente de carga em resposta a um potencial de comando passo-função. Um potencial de "reset" negativo é empregado imediatamente após cada ciclo de medição individual para repelir npy vinculado do anticorpo através da interação eletrostática, limpando assim os locais de ligação de anticorpos para rodadas subsequentes de medição¹⁰. Isso efetivamente permite a medição do NPY de forma resolvida no tempo. A técnica de CI única supera as limitações dos métodos imunoquímicos baseados em microdiálise descritos acima para medir os níveis dinâmicos de biomarcadores de um único experimento sem pool de dados ou média de sinais ao longo de vários experimentos⁹, fornecendo dados em tempo quase real. Além disso, a capacidade de adaptar este método a qualquer biomarcador de interesse para o qual existe um anticorpo adequado em escala pontual e localizada proporciona um grande avanço técnico na medição imunoquímica para a avaliação da progressão da doença e orientação de intervenções terapêuticas.

O software para aquisição e análise de dados foi escrito sob medida no IGOR Pro (um ambiente de software totalmente interativo). Um sistema de conversor analógico para digital (A/D) emitiu uma tensão de comando sob controle de computador e adquiriu dados de um amplificador personalizado. O amplificador possuía certas características únicas. Estes incluíram um resistor de feedback (comutação) para cada um dos quatro canais de aquisição, permitindo a escolha de 1 MOhm ou 10 circuitos de retenção de tensão de feedback MOhm para integrar a variabilidade do eletrodo. Uma unidade de palco com uma única cabeça e circuito mútuo de solo/referência para todos os quatro canais de aquisição também foi construída para colocar o dispositivo perto do peito em um único módulo físico. Uma configuração de resistor de feedback de 1 MOhm foi usada para coletar todos os dados relatados.

As configurações de filtro e ganho foram telegrafadas a partir do amplificador e registradas dentro do arquivo de dados. Os dados foram filtrados a 1 kHz através de um filtro Bessel analógico de 2 polos digitalizado a 10 kHz. A diferença de potencial entre a sonda e a solução condutora circundante cria uma camada capacitiva Helmholtz na ponta da sonda. A ligação de ligante ao anticorpo na ponta da sonda resulta em uma carga local alterada e, portanto, uma mudança na capacitância helmholtz. Esta mudança no componente capacitivo do circuito resulta em uma mudança na magnitude da carga injetada necessária para trazer a sonda ao potencial no protocolo de tensão de função de passo. Assim, a vinculação de um ligante específico à sonda funcionalizada resulta em uma alteração na medição da capacitância do eletrodo como uma mudança na corrente capacitiva máxima.

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Protocolo

Todos os experimentos em animais foram aprovados pela Universidade da Califórnia, Comitê de Pesquisa Animal de Los Angeles e realizados seguindo as diretrizes estabelecidas pelo Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição, 2011). Suínos yorkshire machos adultos de aproximadamente 75 kg foram utilizados para estudos in vivo ¹⁰.

1. Fabricação e funcionalização do imunoprobe capacitivo

1. Corte um fio de platina revestido de 25 cm de perfluoroalkoxy (PFA) (ver Tabela de Materiais) e retire aproximadamente 5 mm de revestimento PFA de uma extremidade usando um bisturi, tomando cuidado para não cortar no fio de platina.
2. Insira a extremidade despojada do fio de platina em um pino de conector masculino banhado a ouro de 1 mm e amasse os dentes do pino do conector ao redor da extremidade despojada do fio de platina usando alicate de nariz de agulha (ver Tabela de Materiais).
3. Soldar o fio de platina para o pino do conector banhado a ouro. Tenha cuidado para não usar uma quantidade excessiva de solda.
4. Prepare a solução de dopamina dissolvendo 50 mg de dopamina HCl em 50 mL de salina tamponada com fosfato de 10 mM (PBS, pH 6.0) mexendo.
5. Uma vez que a dopamina esteja completamente dissolvida, coloque a ponta do fio de platina no vaso contendo o PBS recém-feito com suplemento de dopamina. Conecte um pino de conector dourado em um canal do headstage (ver Tabela de Materiais).
6. Conecte o eletrodo do disco AgCl (eletrodo de terra, ver Tabela de Materiais) ao canal de terra no headstage. Coloque o disco AgCl no recipiente contendo PBS suplementado por dopamina e fio de platina; tenha cuidado apenas para submergir o eletrodo do disco e não qualquer comprimento do fio ou solda. Conecte um desvio de fio aos canais de referência do headstage antes de prosseguir.
7. Abra o software interativo de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais). Prepare um protocolo potencial de comando de eletrodeposição de dente-de-serra com os seguintes parâmetros: potencial de início = −0,6 V; potencial final = +0,65 V; taxa de varredura = 0,04 V∙^s-1; duração do depoimento = 420 s. Inicie o protocolo de deposição de polidopamina, garantindo que todos os fios estejam conectados corretamente.
8. Após completar a deposição de polidopamina, remova a pelota de terra agcl e a ponta do fio de platina do vaso, tomando cuidado para não perturbar a ponta do eletrodo do fio de platina. Coloque a ponta do fio em um microtubo contendo PBS (pH 7.4) por 2-5 min à medida que a solução de anticorpos estiver preparada; certifique-se de que a ponta do fio não entre em contato com as laterais ou a parte inferior do microtubo.
   NOTA: A solução de anticorpos pode ser feita durante a deposição de polidopamina; no entanto, a transferência do fio de platina do vaso contendo dopamina para o microtubo da PBS após a deposição de polidopamina não deve ser ignorada.
9. Prepare a solução de anticorpos. Combine o anticorpo de interesse com PBS (pH 7.4) em uma proporção de 1:20 em um vaso de tamanho apropriado (por exemplo, um microtubo).
   NOTA: O anticorpo monoclonal anti-NPY (ver Tabela de Materiais) utilizado aqui foi aliquotado a 1 mg/mL; um exemplo de preparação de anticorpos aqui seria de 4 μL de anticorpo a 76 μL de PBS.
10. Mergulhe a ponta depositada de polidopamina do eletrodo de platina na solução de anticorpos por um mínimo de 2h à temperatura ambiente, novamente garantindo que a ponta do fio de platina seja suspensa em solução e não repousando na superfície interna do microtubo.
    NOTA: A implementação recente desta técnica favoreceu o uso do eletrodo de fio de platina imediatamente após esta etapa em vez de armazenamento molhado ou seco para uso posterior.
11. Depois de mergulhar na solução de anticorpos, enxágue brevemente a ponta de imunoprobe capacitivo (teste CI) recém-funcionalizada em PBS (pH 7.4). A sonda está pronta para uso.

2. Configuração experimental para detecção in vitro e medição de peptídeos

1. Coloque a ponta funcional da sonda CI na câmara de fluxo, tomando cuidado para não perturbar a ponta do eletrodo de forma alguma, pois isso pode danificar a ponta sensorial da sonda.
   NOTA: A câmara de fluxo foi criada derramando elastômero de silicone (ver Tabela de Materiais) em um prato de cultura de 35 mm com um enchimento de espaço vazio alongado no centro do prato. Após o endurecimento, a forma ovoid é removida do elastômero. A câmara é então superfusada com soro fisiológico tris-tampão (TBS) e permite uma taxa de fluxo de 3 mL/min. Certifique-se de que a entrada e a saída mantenham o nível de fluido na câmara de tal forma que nenhuma ação de maré do superfusato seja observada. O fluxo deve permanecer no local enquanto a sonda CI estiver em uso.
2. Antes do primeiro teste experimental, realize uma corrida padrão TBS para condicionar a sonda CI. Configurar o seguinte protocolo de tensão de comando: potencial de passo positivo = +100 mV; potencial de passo negativo = −5 mV; duração do passo = 20 ms; duração da aquisição = 600 s.
   NOTA: É importante permitir o equilíbrio da sonda durante a fase inicial do potencial de comando de ciclismo antes da aquisição de dados.
3. Crie uma solução do peptídeo de interesse usando o mesmo TBS para manter a composição do superfusato. Configure um sistema múltiplo onde o superfusato pode ser alternado entre TBS e TBS complementados por peptídeos sem introduzir bolhas no sistema de tubos ou câmara de fluxo.
   NOTA: O peptídeo suíno sintético NPY (ver Tabela de Materiais) foi utilizado no presente estudo.
4. Configure o protocolo de aquisição de dados de sensoriamento de peptídeos usando parâmetros padrão TBS (ver passo 2.2.).
   NOTA: Nesta implementação, a duração de cada teste experimental foi de 360 s (TBS de 120 s, 120 s DE TBS complementada por peptídeos, TBS de 120 s).

3. Adaptação da sonda CI para uso in vivo

1. Antes da deposição de polidopamina (etapa 1.7.), rosque a ponta exposta do eletrodo do fio de platina através de uma agulha hipodérmica de 22 G, deixando aproximadamente 2 mm além da ponta da agulha. Usando fórceps, dobre suavemente a ponta do eletrodo do fio de platina, criando uma "barb" que pende do final da agulha hipodérmica.
   1. Retire suavemente a agulha da ponta farpada, deixando arame suficiente para colocar no vaso sem que a agulha entre em contato com o fluido. Prossiga com as etapas 1.4.-1.11.
      NOTA: Dependendo da configuração in vivo , pode ser necessário cortar um comprimento de fio de platina com mais de 25 cm.
2. Antes de conectar a sonda CI ao headstage, certifique-se de que toda a configuração elétrica esteja devidamente aterrada. Caso contrário, pode introduzir interferência elétrica indesejada durante as gravações experimentais.
3. Anestesiar os animais após um relatório publicado anteriormente¹⁰.
4. Realizar cirurgia para expor a região de interesse.
   NOTA: Uma esternotomia mediana foi realizada no presente estudo para expor o coração. Por favor, consulte Kluge et ^al.10 para obter detalhes sobre cirurgia animal.
5. Remova suavemente a ponta funcionalizada da lavagem PBS (passo 1.11.), encaminhe a agulha hidodérmica para a sonda de CIA farpada e implante-a suavemente na região de interesse antes de conectar o pino do conector de ouro no headstage. Uma vez implantado, retire a agulha hipodérmica, deixando o eletrodo no lugar.
   NOTA: Para o presente estudo, a sonda foi colocada na parede lateral média do miocárdio ventricular esquerdo¹⁰.
6. Depois de garantir a adequada configuração elétrica, proceda com protocolos de teste padrão e experimentais (etapa 2.2. e etapa 2.4.).
7. Após a conclusão dos experimentos, eutanize o animal seguindo técnicas institucionalmente aprovadas.
   NOTA: No presente estudo, os animais são eutanizados sob anestesia profunda por indução de fibrilação ventricular¹⁰.

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Resultados

Fabricação e caracterização de eletrodos
Um imunoprobe capacitivo flexível (sondas CI) foi fabricado, e uma imagem representativa é retratada na Figura 1A. O potencial do eletrodo foi definido por um circuito de grampo de tensão controlado por computador (Figura 1B), e o eletrodo foi imerso em uma solução de polidopamina feita em PBS. A polidopamina foi eletrodepositada na ponta do eletrodo condutor¹³ para fun...

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Discussão

O presente protocolo descreve a fabricação e o teste de um imunoprobe capacitivo (teste CI) capaz de detectar e medir biomarcadores de interesse tanto em configurações in vitro quanto in vivo . A detecção é alcançada prendendo o biomarcador na ponta do eletrodo. O evento de captura altera a junção capacitiva entre um imunoprobe capacitivo de fio de platina e o ambiente de fluido condutivo circundante, medido como uma mudança na corrente de carga em resposta a uma possível mudança na sonda. ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654