Bioreator de perfusão multi-fluxo integrado com fracionamento de saída para cultura celular dinâmica

Resumo

Este artigo apresenta um método de construção e operação de um sistema de cultura celular de perfusão multicanal de baixo custo para medir a dinâmica das taxas de secreção e absorção de solutos em processos celulares. O sistema também pode expor as células a perfis dinâmicos de estímulo.

Resumo

Certas funções celulares e teciduais operam dentro da escala de tempo dinâmica de minutos a horas que são mal resolvidas pelos sistemas de cultura convencionais. Este trabalho desenvolveu um sistema bioreator de perfusão de baixo custo que permite que o meio da cultura seja continuamente perfundido em um módulo de cultura celular e fracionado em um módulo a jusante para medir a dinâmica nesta escala. O sistema é construído quase inteiramente a partir de peças comercialmente disponíveis e pode ser paralelo à realização de experimentos independentes em placas convencionais de cultura celular multi-poço simultaneamente. Este artigo de vídeo demonstra como montar a configuração base, que requer apenas uma única bomba de seringa multicanal e um coletor de frações modificado para perfundir até seis culturas em paralelo. Variantes úteis no design modular também são apresentadas que permitem dinâmicas de estimulação controlada, como pulsos solutos ou perfis farmacocinéticos. É importante ressaltar que, à medida que os sinais solutos viajam pelo sistema, eles são distorcidos devido à dispersão de soluto. Além disso, é descrito um método para medir as distribuições de tempo de residência (RTDs) dos componentes da configuração de perfusão com um rastreador usando o MATLAB. Os RTDs são úteis para calcular como os sinais soluto são distorcidos pelo fluxo no sistema multipartidário. Este sistema é altamente robusto e reprodutível, de modo que pesquisadores básicos podem facilmente adotá-lo sem a necessidade de instalações especializadas de fabricação.

Introdução

Muitos processos biológicos importantes ocorrem nas culturas celular e tecidual na escala de tempo de minutos para^{horas 1,2,3}. Embora alguns desses fenômenos possam ser observados e registrados de forma automatizada usando microscopia de lapso de tempo⁴, bioluminescência¹ ou outros métodos, experimentos envolvendo a coleta de amostras supernantes culturais para análise química são frequentemente realizados manualmente em culturas celulares estáticas. A amostragem manual limita a viabilidade de certos estudos devido à inconveniência de pontos de tempo de amostragem frequentes ou pós-horas. Outras deficiências dos métodos de cultura estática incluem experimentos envolvendo exposições controladas e transitórias a estímulos químicos. Em culturas estáticas, os estímulos devem ser adicionados e removidos manualmente, e os perfis de estímulo são limitados a mudanças de passo ao longo do tempo, enquanto as alterações médias também adicionam e removem outros componentes médios, o que pode afetar as células de forma descontrolada⁵. Sistemas fluidos podem superar esses desafios, mas os dispositivos existentes representam outros desafios. Os dispositivos microfluidos vêm com os custos proibitivos de equipamentos especializados e treinamento para produzir e usar, exigem métodos microanalíticos para processar amostras, e as células são difíceis de recuperar dos dispositivos após a perfusão⁶. Poucos sistemas macrofluidos foram criados para os tipos de experimentos descritos aqui ^7,8,9,10, e eles são construídos de múltiplas peças personalizadas feitas internamente e requerem várias bombas ou coletores de frações. Além disso, os autores não estão cientes de quaisquer sistemas de cultura celular de perfusão macrofluida disponíveis comercialmente além de bioreatores de tanques agitados para cultura de suspensão, que são úteis para a biomagrafação, embora não sejam projetados para modelagem e estudo da fisiologia.

Os autores relataram anteriormente sobre o projeto de um sistema bioreator de perfusão de baixo custo composto quase inteiramente de peças disponíveis comercialmente¹¹. A versão base do sistema permite que várias culturas em uma placa de poço sejam mantidas em uma incubadora de CO₂ e continuamente perfundidas com meio de uma bomba de seringa, enquanto os fluxos médios de efluentes das culturas são automaticamente fracionados em amostras ao longo do tempo usando um coletor de frações com uma modificação personalizada. Assim, este sistema permite a amostragem automatizada de cultura média supernaciante e entrada soluto contínua para as culturas ao longo do tempo. O sistema é macrofluido e modular e pode ser facilmente modificado para atender às necessidades de novos projetos de experimentos.

O objetivo geral do método aqui apresentado é construir, caracterizar e usar um sistema de cultura celular de perfusão que permita experimentos nos quais as taxas de secreção ou absorção de substâncias por células ao longo do tempo são medidas, e/ou células são expostas a sinais de soluto precisos e transitórios. Este artigo de vídeo explica como montar a configuração base, que é capaz de perfundar até seis culturas celulares simultaneamente usando uma única bomba de seringa e coletor de frações modificada. Duas variantes úteis no sistema base que fazem uso de bombas e peças adicionais para permitir experimentos que expõem células a sinais transitórios de concentração de soluto, incluindo pulsos breves e perfis farmacocinéticos¹², também são apresentadas, mostradas na Figura 1.

Figura 1: Três variações no desenho do sistema de perfusão. (Topo) O sistema básico de perfusão. (Meio) O sistema de perfusão com uma torneira para múltiplas fontes médias. (Inferior) O sistema de perfusão com um tanque mexido para imitar um volume bem misturado de distribuição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Devido à dispersão e difusão dentro do fluxo, os sinais de solute ficam distorcidos ou "manchados" à medida que viajam pelo sistema de fluxo. Essa distorção pode ser quantificada através do uso de distribuições de tempo de residência (RTDs)¹³. Este artigo explica como realizar experimentos rastreadores em componentes do sistema de perfusão (Figura 2) e fornece scripts MATLAB para gerar RTDs a partir de dados medidos. Uma explicação detalhada desta análise pode ser encontrada no artigo anterior¹¹ dos autores. Scripts MATLAB adicionais se encaixam em funções apropriadas aos RTDs e extraem parâmetros físicos e executam a convolução de sinais usando RTDs para prever como a entrada de sinal soluto pelo usuário irá propagar e distorcer através do sistema de perfusão¹⁴.

Figura 2: Distribuição de tempo de residência. Os RTDs dos componentes do sistema de fluxo, como este comprimento da tubulação, são medidos inserindo um pulso de rastreador no sistema e medindo como ele "mancha" no momento em que ele sai para as frações coletadas. Este número foi modificado de Erickson et ^al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

1. Prepare as peças para perfusão de placas de poço

1. Preparar tubos
   1. Corte dois comprimentos de tubos de silicone (1,6 mm de diâmetro interno) para que cada cultura celular seja perfundida. Certifique-se de que a peça usada como tubo a montante é longa o suficiente para alcançar desde a bomba de seringa até a cultura celular dentro da incubadora, e que a peça a jusante pode chegar da cultura celular à posição mais distante do coletor de frações.
   2. Dê a cada pedaço de tubo uma etiqueta única em ambas as extremidades com fita rotulada.
2. Prepare rolhas para a placa de poço
   1. Obtenha uma rolha de silicone para cada poço da placa do poço a ser perfundida, com um diâmetro apropriado para caber aconchegantemente nos poços com uma vedação hermética.
   2. Corte o excesso de material das partes inferiores da rolha para que eles se encaixem nos poços, deixando espaço dentro para o ar acima do nível líquido pretendido.
   3. Empurre duas agulhas de 18 G contundentes através de cada rolha, para cima e para fora da parte inferior para servir como entrada e saída para o fluxo através do poço, diametralmente opostos umas às outras para maximizar a distância entre suas pontas dentro do poço.
   4. Ajuste as alturas das agulhas dentro do poço conectado, pois a altura da agulha de saída determinará a altura estável do nível líquido no poço durante a perfusão.
      NOTA: Se a perfusão for iniciada com a agulha de saída acima do nível líquido, o líquido se acumulará no poço até que o nível atinja a agulha. Se a perfusão for iniciada com a agulha de saída abaixo do nível líquido, o nível líquido permanecerá estável a menos que as bolhas de ar fluam para dentro do poço, o que fará com que a altura líquida diminua até que seja a mesma altura da agulha de saída.
3. Reúna peças adicionais
   1. Obtenha uma seringa estéril para que cada cultura celular seja perfusada que seja grande o suficiente para conter meio suficiente para toda a perfusão, além de uma quantidade adicional de meio para encher inicialmente o tubo.
   2. Para que cada cultura seja perfundida, obtenha um feminino-para-barb e dois conectores Luer macho-a-barb, bem como duas tampas femininas e dois luer masculinos.
4. Limpe e esterilize peças
   1. Se as peças tiverem sido usadas anteriormente, limpe-as perfundiando-as com 0,1 N NaOH, seguida de uma lavagem com água desionizada.
   2. Por autoclaving ou não, certifique-se da esterilidade de todas as peças listadas acima.

2. Corte a laser o distribuidor de várias cabeças e anexe-o a um coletor de frações

1. Recrie o modelo de distribuidor de várias cabeças da Figura 3 em um programa de design auxiliado por computador ou baixe o arquivo DXF do modelo fornecido (Arquivo Suplementar 1).
2. Use um cortador a laser para cortar o design de uma folha de acrílico de 1/8.
3. Remova os três parafusos que ligam a cabeça de distribuição à base móvel do coletor de frações.
4. Alinhe os três menores orifícios do distribuidor de várias cabeças com os orifícios de parafuso na base móvel e enrosque os parafusos de volta através dos orifícios para prender.
5. Ajuste o aperto dos três parafusos para angular o distribuidor de várias cabeças para cima e para baixo até que a linha de orifícios de distribuição esteja alinhada com os tubos de coleta abaixo dele.
6. Coloque cuidadosamente as pontas de pipeta de 300 μL através dos orifícios desejados para servir como dicas de distribuição.
   NOTA: O coletor de frações pode ser usado sem o distribuidor de várias cabeças para perfundir uma única cultura celular.

3. Medir os RTDs do componente e executar a convolução do sinal

1. Configure bombas e seringas para pulso rastreador, como mostrado na Figura 2.
   1. Obtenha duas bombas de seringa de canal único ou multicanal.
   2. Escolha uma solução de fundo para representar o meio que será usado no sistema de fluxo durante experimentos de cultura celular. Certifique-se de que a solução de fundo tenha propriedades de transferência de massa semelhantes para o meio. Em muitos casos, a água deionizada é uma escolha apropriada.
   3. Escolha uma substância rastreadora para representar o soluto que será de interesse durante experimentos de cultura celular. Certifique-se de que o rastreador tenha propriedades de transferência de massa semelhantes ao soluto de interesse, e sua concentração deve ser capaz de ser medida. Em muitos casos, o corante alimentar é uma escolha apropriada.
   4. Dissolva a substância rastreadora na solução de fundo para fazer a solução do rastreador.
   5. Encha uma seringa com uma solução de fundo e carregue-a em uma bomba de seringa. Encha outra seringa com solução de rastreador e carregue-a na segunda bomba de seringa.
   6. Conecte ambas as seringas a duas das três portas de uma torneira de quatro vias usando conectores Luer.
   7. Feche a torneira para a solução de fundo e bombeie a solução do rastreador para dentro da torneira até que comece a gotejar a porta aberta. Pare a bomba e não ajuste ainda mais a seringa.
      NOTA: É importante que a barra móvel da bomba de seringa seja empurrada contra os êmbolos da seringa antes que as porções cronometradas do experimento comecem. Isso permitirá que o fluxo comece imediatamente quando a bomba for iniciada. Caso contrário, a bomba pode ser iniciada, mas o fluxo não começará até que a barra de movimento pegue a posição do êmbolo.
   8. Feche a torneira para a solução do rastreador e bombeie a solução de fundo para dentro da torneira até que toda a solução de rastreador residual tenha sido liberada para fora da porta aberta. Pare a bomba e não ajuste ainda mais a seringa.
2. Configurar o componente do sistema de fluxo de interesse e o coletor de frações
   1. Configure o componente do sistema de fluxo desejado para análise de RTD. Certifique-se de que o componente a ser medido termina com um pedaço de tubo a jusante de comprimento e flexibilidade adequados para alcançar o coletor de frações durante a operação.
   2. Insira a extremidade da tubulação a jusante em um distribuidor de ponta de pipeta no distribuidor de várias cabeças, de tal forma que esteja aconchegantemente conectado.
   3. Conecte a porta aberta da torneira de quatro vias à entrada do componente a ser medida. Bombeie a solução de fundo através do componente até que ele seja totalmente preenchido como seria durante um experimento de cultura celular, e ele começa a gotejar para fora da ponta de distribuição de coletor de frações. Pare a bomba.
3. Injete pulso de rastreador, colete frações e meça rastreador
   1. Coloque a bomba para a solução do rastreador à taxa de fluxo desejada. Feche a torneira para a solução de fundo e inicie o fluxo da solução rastreadora. Ao mesmo tempo, inicie o coletor de frações.
   2. Continue o fluxo de solução rastreadora por um curto período de tempo para aproximar uma entrada de impulso do rastreador. Foi encontrada uma duração de pulso de 10 minutos para funcionar bem para RTDs a uma vazão de 1 mL/h.
      NOTA: Se o pulso do rastreador for muito breve, nenhum rastreador suficiente entrará no fluxo para ser mensurável. Se o pulso for muito longo, ele não se aproximará mais de um impulso e mudará a forma do RTD.
   3. No final do período de pulso da solução do rastreador, pare a bomba de solução do rastreador. Feche rapidamente a torneira para a solução de rastreador e inicie o fluxo da solução de fundo na mesma taxa de fluxo.
   4. Permita que a solução de fundo flua e as frações sejam coletadas até que todo o rastreador passe pelo sistema e pelas frações coletadas.
   5. Pare o sistema e meça a concentração do rastreador nas frações. Inclua apenas frações que foram distribuídas completamente. Se a coleção for interrompida parcialmente através da coleção de uma fração, não inclua essa fração.
4. Calcule a distribuição de tempo de residência (RTD) a partir de dados medidos no MATLAB
   NOTA: Uma explicação escrita da análise realizada por este roteiro matlab pode ser encontrada na publicação anterior dos autores¹¹, e as discussões sobre a teoria estão amplamente disponíveis na literatura¹³.
   1. Produzir um arquivo .xlsx contendo os dados de concentração no formato da planilha example_tracer_data.xlsx fornecida no Arquivo Suplementar 2. Digite os valores de concentração do rastreador nas frações (quaisquer unidades) em ordem cronológica da esquerda para a direita na linha 2. Digite o tempo decorrido desde o início do pulso até o final da última fração na célula A5, e digite o comprimento do pulso do rastreador em minutos na célula A8.
   2. Salve o arquivo .xlsx no diretório MATLAB.
   3. Abra o script RTD_From_Data.m, do Arquivo Complementar 3, no editor do MATLAB.
   4. Substitua o nome do arquivo .xlsx entre parênteses na primeira linha da seção Dados de carga do script com o nome do novo arquivo de dados .xlsx, seguindo as instruções escritas no arquivo do script. Executar o roteiro.
   5. Certifique-se de que o script executa com sucesso a análise rtd¹³, produzindo um gráfico do RTD e devolvendo o valor da integral numérica sobre o RTD igual a 1. Encontre o vetor de tempo (t) e o vetor de valores RTD (Et) fornecidos pelo script para o diretório MATLAB.
5. Encaixe uma função de modelo para o RTD no MATLAB
   1. Abra o script Fit_RTD_Function.m no editor MATLAB do Arquivo Complementar 4.
   2. Escolha uma das três funções do modelo comentou para caber no RTD: o modelo de dispersão axial¹³, que se encaixa em RTDs para fluxo laminar em tubos cilíndricos; o modelo CSTR¹³, que se encaixa em tanques bem mexidos; e o n-CSTR modelo¹⁵, que aproximadamente se encaixa em placas de poço maiores. Para encaixar outro modelo não incluído aqui, adicione-o ao script no mesmo formato.
   3. Remova os comentários na seção do script contendo o modelo escolhido para a montagem.
   4. Altere os valores dos palpites iniciais para os parâmetros apropriados para o RTD.
   5. Execute o script para produzir um gráfico da função fit sobreposta nos dados RTD e para imprimir os valores do parâmetro de ajuste para a função. Se o ajuste for muito ruim ou ocorrer erros, altere os palpites iniciais do parâmetro e execute o script novamente.
6. Realizar convolução de sinal no MATLAB
   1. Escolha um sinal e um RTD ou dois RTDs para convolve.
   2. Abra o script Signal_Convolution.m,do Arquivo Suplementar 5, no editor do MATLAB.
   3. Para que cada um dos dois sinais seja convolved (ou seja, um sinal e um RTD, ou dois RTDs), defina um vetor de pontos de tempo espaçados uniformemente nas unidades desejadas e um vetor correspondente de valores de sinal nesses momentos.
      NOTA: Os vetores dos dois sinais devem ter o mesmo número de elementos e as etapas de tempo do mesmo tamanho. É por isso que é útil ter o RTD como uma função contínua que pode ser amostrada para um número arbitrário de pontos a qualquer intervalo de tempo.
   4. Digite os dois sinais no MATLAB e execute o script para obter os vetores de tempo e sinal do sinal de saída.

4. Configure o sistema básico de perfusão com células em uma placa de poço

1. Prepare a placa do poço
   1. Certifique-se de que a cultura da placa do poço tenha a profundidade média apropriada para o experimento de perfusão. Realize quaisquer alterações médias finais, estímulos ou outras etapas desejadas antes do início da perfusão. Se as células de suspensão estiverem sendo perfumadas, centrifufique a placa para garantir que elas estejam na parte inferior.
   2. Em condições estéreis, insira as rolhas com agulhas nas culturas da placa do poço com as agulhas puxadas para cima. Depois que a rolha estiver no lugar, abaixe as agulhas para a altura desejada para perfusão, pois a altura da agulha de saída determina o nível líquido estável.
   3. Tampe as agulhas com tampas luer machos e mantenha toda a placa de poço em uma incubadora até usar.
2. Prepare as seringas e o tubo a montante
   1. Em condições estéreis, encha uma seringa para que cada cultura seja perfundida com meio suficiente para a duração desejada da perfusão, além de meio adicional suficiente para encher o tubo a montante.
   2. Conecte a tubulação a montante à seringa usando um conector Luer feminino para barb. Na outra extremidade do tubo, insira um conector Luer macho-a-barb.
   3. Dispense o meio da seringa até que o tubo a montante esteja totalmente preenchido com meio.
   4. Tampe a extremidade aberta do tubo com uma tampa luer fêmea.
      NOTA: Todas as seringas de réplica devem ter exatamente o mesmo volume neste momento. Se seus volumes não forem iguais, seus êmbolos estarão em posições diferentes, e nem todos se encaixarão bem em uma única bomba de seringa multicanal.
3. Em condições estéreis, insira um conector Luer macho-para-barb em uma extremidade da tubulação a jusante, e tampe-o com uma tampa luer fêmea.
4. Leve cuidadosamente todas as tubulações preparadas, seringas e a placa de poço para a incubadora que será usada para perfusão.
5. Coloque a bomba de seringa e o coletor de frações nos locais desejados próximos à incubadora. Coloque a bomba de seringa em cima ou perto da incubadora, e coloque o coletor de frações ao lado da incubadora, perto do porto.
6. Junte as extremidades tampadas de todos os tubos rio acima e rio abaixo e empurre-os do lado de fora da incubadora para o interior através da porta.
7. Carregue as seringas na bomba de seringa e insira as extremidades abertas dos tubos a jusante nas pontas de pipeta de distribuição do distribuidor multi-cabeça do coletor de frações.
8. Dentro da incubadora, puxe o máximo de folga possível dos tubos a montante possível para a incubadora para maximizar o comprimento da tubulação através da qual o meio fluindo pode receber calor e CO2 do ar da incubadora. Enquanto os seguram no lugar, puxe os tubos a jusante para fora da incubadora, apenas o suficiente para que eles sejam capazes de alcançar o ponto mais distante estendido no coletor de frações enquanto ainda mantém as extremidades tampadas dentro da incubadora.
9. Para cada poço plugado, despreze rapidamente as agulhas e os tubos rio acima e rio abaixo para que bem e conecte-os junto com seus conectores Luer.
10. Uma vez que todas as peças estejam conectadas, execute brevemente a bomba de seringa a uma velocidade relativamente alta para garantir que todos os fluxos estejam fluindo corretamente.
11. Neste ponto, se desejar iniciar o experimento com os tubos a jusante cheios do meio, continue funcionando a bomba até que todos estejam cheios. Caso contrário, pare a bomba.
12. Defina a taxa de fluxo da bomba de seringa e a frequência de coleta de frações e inicie ambas as máquinas simultaneamente para iniciar o experimento. Colete frações para a duração desejada do experimento.

5. Configure o sistema de perfusão com uma torneira para múltiplas fontes médias

1. Realize todas as sub-etapas da etapa 4.1 acima.
2. Prepare as duas mídias para serem utilizadas na perfusão, rotulando o meio que será dispensado primeiro como 1, e o outro como médio 2.
3. Para que cada cultura seja perfundida, encha uma seringa com meio 1 suficiente durante a sua dispensação, além de volume suficiente para preencher inicialmente o sistema de perfusão. Encha uma segunda seringa com meio 2 suficiente durante a sua dispensação.
4. Conecte ambas as seringas a duas das três portas de uma torneira de quatro vias.
   NOTA: Pode ser necessário um comprimento de tubulação para conectar as seringas às torneiras.
5. Prepare a torneira e as seringas de forma semelhante aos passos 3.1.7-3.1.8 acima, fechando a torneira para o meio 1 e distribuindo o meio 2 na torneira até que comece a escorrer o porto aberto.
6. Feche a torneira para o meio 2 e dispense o meio 1 na torneira até que todo o meio residual 2 tenha sido liberado para fora da porta aberta.
7. Conecte a tubulação a montante à porta da torneira aberta usando um conector Luer feminino-para-barb. Na outra extremidade do tubo, insira um conector Luer macho-a-barb.
8. Dispense o meio 1 da seringa até que o tubo a montante esteja totalmente preenchido com meio.
9. Prossiga com as etapas 4.3-4.11 acima, carregando ambas as seringas em bombas de seringa separadas e distribuindo apenas o meio 1.
10. Defina a taxa de fluxo da bomba de seringa para médio 1 e a frequência de coleta de frações, e inicie ambas as máquinas simultaneamente para iniciar o experimento.
11. Quando a fonte média for alterada, pare rapidamente a bomba de seringa para o médio 1, gire a torneira fechada para médio 1 e inicie a bomba de seringa para o médio 2. Se desejar mais tarde, mude a fonte de volta para médio 1 de forma semelhante.
12. Colete frações para a duração desejada do experimento.

6. Configure o sistema de perfusão com um tanque mexido para imitar farmacocinética

1. Obtenha dados farmacocinéticos para a droga de interesse e certifique-se de que consiste em um pico de concentração seguido de uma decadência exponencial.
2. Depois de definir o pico para o tempo 0 e remover pontos de dados antes do pico, use o script Stirred_Tank_Fit.m (Arquivo Suplementar 6) para encaixar a equação RTD do tanque mexido aos dados. Entrada v (a taxa de fluxo de perfusão desejada) e os dados a serem encaixados como um par de vetores diretamente no script, juntamente com t e C para valores de tempo e valores de concentração, respectivamente. Execute o script para imprimir o parâmetro V, que é o volume de tanque agitado necessário.
3. Planeje um layout para o sistema de perfusão para incluir duas bombas de seringa e um agitador de placas a montante da incubadora.
4. Meça os RTDs dos componentes do sistema de perfusão além da torneira e realize a convolução de sinal dos RTDs com várias durações e concentrações de pulso de droga para encontrar um perfil farmacocinético apropriado. Use a equação RTD do tanque de ajuste neste cálculo.
5. Prossiga com as etapas 5.1-5.8 acima.
6. Use uma placa de poço adicional de tamanho apropriado como o tanque mexido para a configuração. Cada poço pode servir como um tanque agitado para uma cultura perfumada. Encha o poço com o volume necessário de médio, V, e conecte o poço com as agulhas inicialmente puxadas para cima, em seguida, empurrado para o fundo do poço, e tampar as agulhas.
7. Coloque as seringas nas bombas de seringa e conecte rapidamente o tubo das seringas às agulhas de entrada tampadas dos tanques agitados. Em seguida, conecte as entradas do tubo a montante da cultura celular às agulhas de saída dos tanques agitados.
8. Prossiga com as etapas 5.9-5.10.
9. No tempo desejado, mude para o meio 2 que contenha a droga, conforme descrito na etapa 5.11. Mude de volta para o meio 1 quando a infusão da droga estiver completa.
10. Prossiga com a etapa 5.12.

Figura 3: O distribuidor de várias cabeças. Projeto para o distribuidor multi-cabeça cortado a laser. Este número foi modificado de Erickson et ^al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

O sistema de perfusão com múltiplas fontes médias da seção 5 do protocolo foi usado para medir a dinâmica de expressão de um gene repórter impulsionado pelo fator nuclear kappa-light-chain-chain-enhancer de células B ativadas (NF-κB) fator de transcrição em células de rim embrionário humano 293 (HEK293) em resposta a um pulso de 1,5 h de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). As células HEK293 foram transduzidas com vetores lentivirais com uma construção genética contendo a Gaussia luciferase (GLuc), i...

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Discussão

Este trabalho descreve a montagem e o funcionamento de um sistema de cultura celular de perfusão com múltiplas fontes médias demonstradas com um exemplo específico no qual a dinâmica da expressão genética orientada pelo NF-κB em resposta a um pulso transitório de TNF-α foram medidas. Os RTDs dos componentes do sistema de perfusão foram medidos e modelados, e a convolução de sinal foi usada para prever tanto a exposição das células ao pulso TNF-α quanto a distribuição de α TNF nas frações médias col...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines	Grainger	5FVK2
293T Cells	ATCC	CRL-3216	HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-Well Clear Bottom Plates, Corning	VWR	89091-010	Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
BioFrac Fraction Collector	Bio-Rad	7410002	Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8"	McMaster-Carr	4615T93	This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells	Millipore Sigma	CLS3548	Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells	Fisher Scientific	720081	Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Laser	Cutting Edge Systems	Epilog Zing 24	Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129	Microcentrifuge tubes for collecting fractions.
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End	Fisher Scientific	14-961-26	Glass tubes for collecting fractions.
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered	Fisher Scientific	2707410	300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	21600010	Phosphate buffered saline.
Labline 4625 Titer Shaker	Marshall Scientific	Labline 4625 Titer Shaker	Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16"	Cole-Parmer	EW-45508-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-1600
Rack Set F1	Bio-Rad	7410010	Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF	Bio-Techne	10291-TA-020	Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm	Saint Gobain	DX263015-50	Fits 48-well plates.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm	Saint Gobain	DX263027-10	Fits 12-well plates.
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems	SolidWorks	CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Plate reader.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue	Michaels	10404779	Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.