Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

Resumo

O protocolo fornece um método detalhado de imagem neuronal na fatia cerebral usando um método de limpeza tecidual, ScaleSF. O protocolo inclui preparação de tecidos cerebrais, esclarecimento de tecidos, manuseio de fatias limpas e microscopia de varredura a laser confocal de estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos.

Resumo

Um protocolo detalhado é fornecido aqui para visualizar estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos em tecidos cerebrais. Estruturas neuronais que vão desde circuitos neurais até estruturas neuronais subcelulares são visualizadas em fatias cerebrais de camundongos adequadamente limpas com ScaleSF. Este método de compensação é uma versão modificada do ScaleS e é um método de limpeza de tecido hidrofílico para fatias teciduais que alcança potente capacidade de limpeza, bem como um alto nível de preservação de sinais de fluorescência e integridade estrutural. Uma câmara de imagem digital 3D digitalizado (3D) personalizável é projetada para uma montagem confiável de tecidos cerebrais limpos. Cérebros de camundongos injetados com um vetor de vírus associado ao adeno carregando um gene de proteína fluorescente verde aprimorado foram corrigidos com 4% de paraformaldeído e cortados em fatias de espessura de 1 mm com um cortador de tecido vibrante. As fatias cerebrais foram limpas seguindo o protocolo de compensação, que incluem incubações sequenciais em três soluções: solução ScaleS0, soro fisco tampão de fosfato (–), e solução ScaleS4, totalizando 10,5-14,5 h. As fatias cerebrais limpas foram montadas na câmara de imagem e embutidas em gel de 1,5% de agarose dissolvido na solução ScaleS4D25(0). A aquisição de imagem 3D das fatias foi realizada utilizando um microscópio de varredura a laser confocal equipado com uma lente objetiva de multi-imersão de uma longa distância de trabalho. Começando com imagens neuronais mesoscópicas, conseguimos visualizar estruturas neuronais subcelulares finas, como espinhas dendríticas e boutons axonais, nas fatias cerebrais adequadamente limpas. Este protocolo facilitaria a compreensão das estruturas neuronais desde circuito até escalas de componentes subcelulares.

Introdução

Os métodos de limpeza tecidual melhoraram a imagem independente de profundidade de amostras biológicas e clínicas com microscopia leve, permitindo a extração de informações estruturais em tecidos intactos ^1,2. Técnicas de compensação óptica também poderiam potencialmente acelerar e reduzir o custo para análise histológica. Atualmente, três grandes abordagens de compensação estão disponíveis: métodos à base de hidrofílico, hidrofóbico e hidrogel ^1,2. As abordagens hidrofílicas superam na preservação de sinais de fluorescência e integridade tecidual e são menos tóxicas em comparação com as outras duas abordagens ^3,4.

Um método de compensação hidrofílica, ScaleS, mantém uma posição distinta com sua preservação da integridade estrutural e molecular, bem como potente capacidade de compensação (espectro de preservação de desmatamento)⁵. Em um estudo anterior, desenvolvemos um protocolo de compensação rápida e isométrica, ScaleSF, para fatias de tecido (~1 mm de espessura) modificando o procedimento de compensação do ScaleS⁶. Este protocolo de compensação requer incubações sequenciais de fatias cerebrais em três soluções para 10,5-14,5 h. O método é apresentado com um espectro de alta preservação de compensação, que é compatível mesmo com a análise de microscopia eletrônica (EM) (Figura Suplementar 1), permitindo imagens tridimensionais (3D) de alta resolução em larga escala com reconstrução precisa do sinal⁶. Assim, o ScaleSF deve ser eficaz especialmente no cérebro, onde as células neuronais elaboram processos exuberantes de comprimento tremendo, e organizam estruturas subcelulares finas especializadas para transmitir e receber informações. Extrair informações estruturais com escalas de circuito para níveis subcelulares em células neuronais é bastante útil para uma melhor compreensão das funções cerebrais.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para visualizar estruturas neuronais com escamas do mesoscópico/circuito ao nível microscópico/subcelular usando ScaleSF. O protocolo inclui preparação tecidual, esclarecimento de tecidos, manuseio de tecidos limpos e microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM) de tecidos limpos. Nosso protocolo se concentra em interrogar estruturas neuronais de circuito para escalas de componentes subcelulares. Para um procedimento detalhado para a preparação das soluções e injeção estereotaxica de vetores de vírus associados ao adeno (AAV) em cérebros de camundongos, consulte Miyawaki et al. 2016⁷ e Okamoto et al. 2021⁸, respectivamente.

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Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Juntendo (Aprovação nº 2021245, 2021246) e realizados de acordo com as Diretrizes Fundamentais para a Conduta Adequada dos Experimentos Animais pelo Conselho Científico do Japão (2006). Aqui, camundongos C57BL/6J machos injetados com vetor AAV que transportam genes de proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) e parvalbumina (PV)/myristoylation-EGFP-low-density lipoprotein receptor C-terminal bacteriano bacteriano camundongos transgênicos (BAC) camundongos transgênicos (pv-FGL mice)⁹ . Os camundongos PV-FGL foram mantidos em fundo C57BL/6J. Não foram encontradas diferenças baseadas em sexo em relação a este estudo.

1. Preparação tecidual

1. Fixação porfusão
   NOTA: Realizar as etapas 1.1.1 a 1.1.3 em um capô de fumaça para limitar a exposição ao paraformaldeído (PFA).
   1. Anestesiar camundongos machos adultos (8 a 16 semanas de idade) por uma injeção intraperitoneal de overdose de pentobarbital de sódio (200 mg/kg). Confirme a adequação da anestesia pela ausência de abstinência do dedo e reflexos piscando os olhos.
   2. Abra a cavidade torácica e corte o apêndice atrial direito com uma tesoura cirúrgica. Perfume os camundongos com 20 mL de soro fisco de fosfato gelado (PBS) usando uma agulha de 23 G presa a uma seringa de 20 mL, seguida por perfusão de 20 mL de PFA gelada de 4% em tampão fosfato de 0,1 M (PB) usando outra seringa de 20 mL.
      ATENÇÃO: O PFA é tóxico e teratogênico. Evite a inalação ou contato com a pele, olhos e membrana mucosa.
   3. Remova os tecidos cerebrais do crânio com pinças. Transfira os tecidos cerebrais para um tubo de 15 mL contendo 4% de PFA em 0,1 M PB, proteja as amostras da luz e arrase suavemente durante a noite a 4 °C em um shaker a 50-100 rpm.
   4. NOTA: Os tecidos cerebrais colhidos podem ser armazenados por várias semanas em azida de sódio de 0,02% (NaN₃) na PBS a 4 °C.
      ATENÇÃO: A NaN₃ é tóxica. Evite a inalação ou contato com a pele, olhos e membrana mucosa. Manuseie-o dentro de um capô de fumaça.
2. Preparação de fatias cerebrais
   1. Prepare 4% de ágar em PBS adicionando 2 g de ágar a 50 mL de PBS. Micro-ondas a mistura até que o ágar esteja totalmente dissolvido. Deixe a solução esfriar para 40-45 °C.
      NOTA: A propriedade viscosa fornecida pela agaropectina, um componente importante do ágar, melhora a facilidade de corte de fatias de tecido.
   2. Adicione 10 mL da solução de ágar a uma placa de cultura de 6 poços. Submergir o tecido cerebral na solução de ágar usando fórceps. Deixe o ágar solidificar no gelo.
   3. Remova o tecido cerebral incorporado do poço e corte o ágar com uma lâmina de barbear. Fixar o bloco de ágar na parte inferior do banho de vibratome com supercola e despeje 0,1 M PB na bandeja de tampão.
   4. Limpe outra lâmina de barbear usando um papel de tecido sem fiapos embebido em etanol e conecte a lâmina ao suporte da lâmina do cortador de tecido vibratório.
   5. Defina a velocidade de secção para 0,14 mm/s com amplitude de 1,4 mm e a frequência para 75-77 Hz. Corte o tecido cerebral em fatias de 1 mm de espessura e colete as fatias em uma placa de cultura celular de 6 poços contendo PBS.
      NOTA: As fatias cerebrais podem ser armazenadas por várias semanas em 0,02% naN₃ em PBS a 4 °C.

2. Esclarecimento de tecidos

NOTA: As composições das soluções ScaleS utilizadas estão listadas na Tabela 1. As amostras devem ser protegidas da luz cobrindo com uma folha. As etapas de compensação são mostradas na Figura 1A.

1. Adicione 8 mL de solução ScaleS0 a um poço de uma placa de cultura celular de 6 poços e adicione 8 mL de solução ScaleS4 a outro poço da placa e pré-aqueça a 37 °C em uma incubadora.
2. Transfira as fatias cerebrais para a solução ScaleS0 pré-aquecida com uma espátula e incubar por 2h a 37 °C em uma incubadora de agitação a 90 rpm.
3. Transfira as fatias cerebrais permeabilizadas em 8 mL de PBS(–) em uma placa de cultura celular de 6 poços com uma espátula e lave por 15 minutos mantendo-se em um agitador orbital a 40-60 rpm. Repita isso duas vezes.
4. Transfira as fatias cerebrais na solução pré-aquecida de 8 mL de ScaleS4 com uma espátula e limpe-as incubando em uma incubadora a 90 rpm por 8-12 h a 37 °C. Uma fatia de cérebro limpa pode ser vista na Figura 1.

3. Montagem de fatias cerebrais

NOTA: Uma câmara de imagem personalizável é usada para uma montagem confiável de fatias cerebrais limpas (Figura 2)⁶. A câmara consiste no quadro da câmara e na tampa inferior. Os adaptadores de estágio do microscópio também são projetados para montar a câmara de imagem em estágios de microscópio diretamente (Figura 2A,B). Os adaptadores de estágio de quadro de câmara e microscópio podem ser impressos em 3D usando serviços internos ou terceirizados de impressão 3D. Os dados de design com auxílio ao computador 3D da câmara de imagem são fornecidos em Furuta et al. 2022⁶.

1. Para preparação da câmara, conecte o quadro da câmara a um deslizamento de tampa usando um adesivo sensível à pressão.
2. Prepare 1,5% de agarose na solução ScaleS4D25(0) (ScaleS4 gel) adicionando 1,5 g de agarose a 100 mL da solução em uma garrafa. Misture bem a solução mexendo e micro-ondas a solução até que a agarose esteja totalmente dissolvida. Uma vez feito, deixe a solução esfriar a 37 °C.
3. Monte a fatia do cérebro limpa na tampa inferior da câmara de imagem com uma espátula. Limpe a solução em excesso da fatia limpa usando um papel de tecido limpo sem fiapos.
4. Adicione o gel ScaleS4 na fatia cerebral usando uma micropipette para encher a câmara de imagem. Coloque outra mancha de cobertura em cima com fórceps e coloque um pedaço de papel de tecido sem fiapos e um deslizamento de vidro na tampa nesta ordem.
5. Transfira a câmara de imagem para uma geladeira a 4 °C. Coloque pesos metálicos no escorregador de vidro e deixe-os por 30 minutos.
6. Remova os pesos metálicos, o deslizamento de vidro, o papel de tecido sem fiapos e o deslizamento da câmara de imagem e limpe o excesso de gel (Figura 2A,B).
7. Coloque a câmara de imagem em uma placa de Petri de vidro de 60 mm e conecte a borda da câmara de imagem à placa com um adesivo sensível à pressão. Anexe a câmara em vários pontos à placa de Petri.
8. Despeje a solução ScaleS4 no prato e agite suavemente por 1 h a 20-25 °C em um agitador orbital a 40-60 rpm. Substitua com uma solução fresca e remova bolhas de ar na superfície do gel raspando suavemente a superfície usando uma ponta de pipeta de 200 μL. Monte a câmara de imagem imersa em um estágio de microscópio (Figura 2C).

4. Imagem CLSM

1. Adquira imagens utilizando um CLSM equipado com uma lente objetiva de multi-imersão de uma longa distância de trabalho (WD) (abertura numérica de 16x/0,60 [NA], WD = 2,5 mm).
   NOTA: As lentes objetivas de NA altas podem fornecer uma resolução limitada à alta difração.
2. Ligue todos os equipamentos de imagem relevantes (estação de trabalho, microscópio, scanner, lasers e lâmpada de mercúrio) e lance um software de imagem CLSM.
3. Coloque a coleira de correção da lente objetiva de multi-imersão para 1,47. A solução ScaleS4 tem um índice de refração (RI) de cerca de 1,47 ^5,7. Aberrações induzidas por incompatibilidade de RI podem perturbar a formação de imagem (Figura 3).
4. Mergulhe a lente objetiva na solução e deixe-a aproximar-se lentamente da fatia. Remova quaisquer bolhas de ar presas na ponta da lente objetiva. Encontre regiões de interesse (ROIs) nos tecidos limpos usando epifluorescência.
5. Defina parâmetros de aquisição de imagens testando as configurações apropriadas.
   1. Determine a profundidade do bit para aquisição de imagens. O tamanho dos dados da imagem aumenta com a profundidade do bit.
   2. Defina o comprimento de onda de detecção. Ajuste o portão apropriado para o detector de acordo com o espectro de emissões. Certifique-se de que o comprimento de onda de detecção não cobre nenhuma linha laser.
   3. Defina a resolução xy . Formatos maiores fornecem melhores resoluções de xy , mas leva mais tempo para coletar as imagens.
   4. Defina a velocidade de varredura. Uma velocidade de varredura mais lenta fornece uma alta relação sinal-ruído. No entanto, também aumenta o tempo de moradia dos pixels e o risco de fotobleaching. Escolha de acordo.
   5. Ajuste o tamanho do orifício. O tamanho do pinhole controla a espessura da seção óptica. Um tamanho menor do pinhole cria uma seção óptica mais fina e, portanto, melhor resolução z , mas reduz o sinal de fluorescência. Tornar o tamanho do orifício maior fornece uma seção óptica mais espessa com sinal de fluorescência mais forte.
   6. Defina a potência do laser, o ganho do detector/amplificador e o deslocamento. Aumente gradualmente a potência do laser e o ganho do detector/amplificador até que uma imagem adequada seja obtida. Uma alta potência laser traz o risco de fotobleaching. Ajuste o deslocamento (contraste) adequadamente para obter uma alta relação sinal-ruído.
   7. Determine a área de plantio necessária com base no tamanho do ROI. Certifique-se de que todo o comprimento e largura do ROI seja capturado.
   8. Navegue pelos tecidos limpos em todos os planos e defina os pontos de partida e fim da pilha. Defina o tamanho da etapa z de acordo com a resolução z desejada.
6. Colete imagens quando satisfeito com as configurações de aquisição de imagens e grave imagens capturadas. Processe as imagens usando um software de análise de imagem.

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Resultados

A limpeza óptica de uma fatia cerebral do rato de 1 mm de espessura foi alcançada usando este protocolo. A Figura 1B representa imagens de transmissão de uma fatia cerebral de camundongos antes e depois do tratamento de compensação. O método de limpeza tecidual tornou transparente uma fatia cerebral de camundongo de 1 mm de espessura. Uma ligeira expansão nos tamanhos finais das fatias cerebrais foi encontrada após a incubação na solução de compensação por 12h (expansão linear: 102,5% ± 1...

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Discussão

Passos críticos dentro do protocolo
Existem alguns passos críticos no protocolo que devem ser conduzidos com a máxima cautela para obter resultados significativos. A fixação uniforme das amostras é imprescindível para imagens 3D dentro de tecidos de grande escala. A lente objetiva, a amostra e o fluido de imersão devem ter ri correspondente. A incompatibilidade de RI entre eles levará a imagens altamente perturbadas de células expressas por EGFP dentro das fatias cerebrais limpas (Fi...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x multi-immersion objective lens	Leica Microsystems	HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar	Nacalai Tesque	01028-85
Agarose	TaKaRa Bio	L03
Dimethyl sulfoxide	Nacalai Tesque	13407-45
D-Sorbitol	Nacalai Tesque	06286-55
γ-cyclodextrin	Wako Pure Chemical Industries	037-10643
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Huygens Essential	Scientific Volume Imaging	ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris	Bitplane	ver. 9.0.0
Leica Application Suite X	Leica Microsystems	LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo Chemical Industry	M1356
Paraformaldehyde	Merck Millipore	1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)	Nacalai Tesque	27575-31	10x PBS(–)
Sodium azide	Nacalai Tesque	31233-55
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
TCS SP8	Leica Microsystems	N/A
Triton X-100	Nacalai Tesque	35501-15
Urea	Nacalai Tesque	35940-65
Vibrating tissue slicer	Dosaka EM	PRO7N