Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo para uma triagem genética supressora de múltiplas cópias em Schizosaccharomyces pombe. Esta tela usa uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma para identificar clones supressores de um fenótipo de perda de função associado a uma cepa mutante de consulta. Novos supressores genéticos do mutante nulo ell1 foram identificados usando esta tela.

Resumo

A identificação de interações genéticas é uma ferramenta poderosa para decifrar as funções do(s) gene(s), fornecendo insights sobre suas relações funcionais com outros genes e organização em vias e processos biológicos. Embora a maioria das telas genéticas tenha sido inicialmente desenvolvida em Saccharomyces cerevisiae, uma plataforma complementar para a realização dessas telas genéticas foi fornecida pela Schizosaccharomyces pombe. Uma das abordagens comuns usadas para identificar interações genéticas é a superexpressão de clones de uma biblioteca de plasmídeos de alto número de cópias em todo o genoma em um mutante de perda de função, seguida pela seleção de clones que suprimem o fenótipo mutante.

Este artigo descreve um protocolo para a realização desta triagem genética baseada em "supressão multicópia" em S. pombe. Esta triagem ajudou a identificar o(s) supressor(es) de múltiplas cópias do fenótipo genotóxico sensível ao estresse associado à ausência do fator de alongamento de transcrição Ell1 em S. pombe. A triagem foi iniciada pela transformação da cepa mutante nula ell1 com uma biblioteca plasmídica de cDNA de alto número de cópias e seleção dos supressores em placas EMM2 contendo 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO), um composto genotóxico indutor de estresse. Posteriormente, o plasmídeo foi isolado de duas colônias supressoras pré-selecionadas e digerido por enzimas de restrição para liberar o DNA inserido. Os plasmídeos que liberam um fragmento de DNA de inserção foram retransformados na cepa de deleção ell1 para confirmar a capacidade desses clones plasmídeos supressores de restaurar o crescimento do mutante de deleção ell1 na presença de 4-NQO e outros compostos genotóxicos. Os plasmídeos que apresentaram resgate do fenótipo de deleção foram sequenciados para identificar o(s) gene(s) responsável(is) pela supressão do fenótipo sensível ao estresse genotóxico associado à deleção ell1.

Introdução

Redes de interações genéticas fornecem informações funcionais sobre genes e delineiam caminhos e processos biológicos em que esses genes podem estar envolvidos in vivo. Além disso, eles também podem fornecer insights sobre como diferentes genes interagem uns com os outros, resultando em um fenótipo específico ^1,2,3. Ao longo dos anos, uma variedade de telas genéticas foram projetadas por pesquisadores para responder a questões biológicas fundamentais e estudar doenças humanas. Telas para a identificação de interações genéticas podem ser realizadas de várias maneiras. Interações genéticas identificadas em diferentes telas genéticas podem representar relações mecanicistas distintas entre genes. Além disso, estudos têm revelado que um conjunto comum de interações genéticas é compartilhado por genes que codificam proteínas pertencentes à mesma via ou complexo ^4,5. Assim, redes de interação genética podem ser usadas para estabelecer a organização funcional em uma célula, em que genes que compartilham os perfis mais semelhantes pertencem ao mesmo complexo ou via, esses genes que compartilham perfis um pouco menos semelhantes pertencem ao mesmo processo biológico e os genes que exibem perfis sobrepostos, mas mais diversos, refletem membros pertencentes ao mesmo compartimento celular⁶.

As telas de interação genética baseadas na supressão da dosagem ('supressão de cópia alta ou multicópia') são uma das abordagens comumente usadas. Essas telas podem ser realizadas por meio da transformação de uma cepa mutante de consulta com uma biblioteca genômica ou cDNA de alto número de cópias, seguida de ensaios/técnicas de seleção adequadas para identificar a supressão ou o aumento das interações genéticas ^7,8,9. Para garantir uma cobertura abrangente de todo o genoma, essas telas também foram realizadas superexpressando um gene específico de interesse em uma coleção de mutantes de perda de função em todo o genoma ou superexpressando uma biblioteca genômica ou cDNA codificada por plasmídeo de alto número de cópias em um mutante de consulta de perda de função 9,10,11,12,13,14,15 . A estratégia de multicópia também poderia funcionar usando uma abordagem dominante/superexpressão usando um promotor regulável.

As principais vantagens do uso de telas baseadas em supressores são que a supressão de um fenótipo preexistente em uma cepa mutante por outro gene estabelece uma relação genética entre esses dois produtos genéticos que pode não ter sido demonstrada usando outras abordagens. Em segundo lugar, observou-se que a presença de uma mutação preexistente sensibiliza uma via particular, permitindo que componentes adicionais dessa via sejam identificados pelo isolamento de supressores, que podem não ter sido identificados por seleções genéticas mais diretas. Além disso, essa tela pode ser utilizada para identificar supressores que possuem diferentes mecanismos de supressão¹⁶. As interações supressoras geralmente ocorrem entre genes que estão funcionalmente relacionados e podem ser usados para elucidar hierarquias em vias. O mecanismo exato subjacente de supressão pode diferir com base em vários fatores, incluindo o tipo de mutação de consulta usada na tela, condições experimentais e o nível de expressão gênica. Um dos mecanismos comuns de supressão de dosagem envolve genes que codificam produtos que funcionam juntos no mesmo complexo ou em paralelo no mesmo processo celular / biológico. Os resultados de tais telas em organismos modelo mais simples, como a levedura, podem ser estendidos a organismos eucarióticos superiores, uma vez que a maioria das vias e processos biológicos fundamentais são conservados ao longo da evolução.

Essas telas genéticas também podem ser modificadas de várias maneiras para responder a diferentes questões biológicas. Por exemplo, genes ortólogos de diferentes organismos que podem suprimir o fenótipo da cepa mutante de consulta podem ser identificados. Também tem sido usado para delinear potenciais mecanismos de resistência e determinar alvos proteicos de novos compostos antibacterianos ^17,18, antifúngicos ^19,20, antiparasitários ²¹ e anticancerígenos²². Esta tela também tem sido explorada para identificar supressores da atividade de drogas farmacêuticas cujo mecanismo de ação não é conhecido. Assim, em princípio, essas telas supressoras de multicópia podem ser otimizadas e usadas em uma variedade de aplicações em diferentes organismos. Embora a maioria das telas genéticas empregadas por pesquisadores de leveduras tenha sido inicialmente desenvolvida em S. cerevisiae, S. pombe emergiu como um sistema modelo complementar para a realização de várias telas e ensaios genéticos²³. Além disso, a organização genômica e os processos biológicos em S. pombe, como a ocorrência de íntrons em mais genes, a complexidade das origens da replicação do DNA, a estrutura dos centrômeros, a organização do ciclo celular e a presença da maquinaria de RNAi, mostram maior semelhança entre S. pombe e eucariotas superiores^23,24, ressaltando a importância do desenho e uso de ferramentas genéticas em S. pombe.

Este artigo descreve um protocolo para identificar interatores genéticos com base na "supressão da dosagem" de um fenótipo mutante de perda de função em S. pombe. A base deste protocolo é que é um método rápido e eficiente para rastrear uma biblioteca de cDNA superexpressando genes do tipo selvagem em um plasmídeo multicópia e / ou de um promotor forte. Este protocolo tem quatro etapas principais: transformação da biblioteca em uma cepa mutante de consulta, seleção de clones plasmídicos que suprimem o fenótipo desejado da cepa mutante de consulta, recuperação do(s) plasmídeo(s) desses clones supressores e identificação do gene responsável pela supressão do fenótipo. Como é verdade para qualquer método baseado na seleção e identificação de cDNAs de uma biblioteca, o sucesso da tela depende do uso de uma biblioteca de alta qualidade e alta complexidade, pois a tela pode recuperar apenas os clones de cDNA que estão presentes na biblioteca.

Usando este protocolo, identificamos com sucesso dois novos supressores do fenótipo genotóxico sensível ao estresse do mutante nulo S. pombe ell1. A família ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) de fatores de alongamento de transcrição suprime a pausa transitória da RNA polimerase II em moldes de DNA em ensaios bioquímicos in vitro e são conservados em vários organismos, desde leveduras de fissão até humanos²⁵. Trabalhos anteriores forneceram evidências de que um mutante nulo de S. pombe ell1 mostra sensibilidade ao estresse genotóxico na presença de óxido de 4-nitroquinolina 1 (4-NQO) e metanossulfonato de metila (MMS)²⁶. Portanto, transformamos uma biblioteca de cDNA multicópia codificada por plasmídeo de S. pombe na consulta S. pombe ell1 mutante nulo e identificamos dois supostos clones que exibiam a capacidade de suprimir a sensibilidade ao estresse genotóxico do mutante nulo de S. pombe ell1 na presença de 4-NQO, um composto que induz lesões de DNA. O sequenciamento subsequente da inserção presente nos clones plasmídicos identificou que os genes que codificam rax2+ e osh6⁺ foram responsáveis por suprimir a sensibilidade ao estresse genotóxico do mutante nulo ell1 quando superexpresso no mutante nulo ell1.

Protocolo

1. Transformação da biblioteca cDNA na cepa mutante de consulta S. pombe para triagem de supressores de multicópia

NOTA: O método padrão de acetato de lítio²⁷ foi seguido para transformar a biblioteca de cDNA de S. pombe na cepa de consulta S. pombe ell1Δ com algumas modificações:

1. Cultivar a cepa de S. pombe ell1Δ a 32 °C em uma placa de meio YE (Tabela 1) suplementada com 225 μg/mL de adenina, leucina e uracilo cada. Inocular uma alça cheia de inóculo da cepa ell1Δ da placa acima em 15-20 mL de meio YE suplementado com 225 μg/mL cada de adenina, leucina e uracila. Incubá-lo durante a noite a 32 °C com agitação (200-250 rpm).
2. No dia seguinte, diluir a cultura noturna em 100 mL de meio YE fresco com os suplementos desejados a uma OD de 600 nm (densidade óptica a₆₀₀ nm) de 0,3 e incubá-la a 32 °C com agitação a 200-250 rpm até que a OD_{600 nm} atinja a fase intermediária.
3. Divida a cultura de 100 mL em dois tubos de centrífuga de 50 mL, seguidos de centrifugação à temperatura ambiente por 10 min a 4.000 × g.
4. Descarte o sobrenadante e lave o pellet celular com 1 mL de água estéril, ou seja, ressuspenda as células em 1 mL de água estéril e centrifugar a 4.000 × g por 5 min à temperatura ambiente.
5. Rejeitar o sobrenadante e lavar cada pellet celular com 1 ml de solução de 1x LiAc-TE (acetato de lítio 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), conforme descrito no passo 1.4.
6. Remova o sobrenadante e ressuspenda cada pellet celular em 250 μL de 1x LiAc-TE. Use estas células competentes de S. pombe (500 μL) para transformação com o DNA de interesse. Transferir 125 μL das células competentes para quatro tubos de microcentrífuga estéreis diferentes para as etapas de transformação subsequentes.
7. Ferva o DNA transportador de testículos de salmão ou esperma de arenque por 1 min e coloque imediatamente no gelo. Para cada transformação, adicionar 10 μL de 10 mg/mL de DNA transportador desnaturado de fita simples ao tubo de microcentrífuga contendo 125 μL das células competentes, seguido de uma mistura suave usando uma ponta de micropipeta. Subsequentemente, adicionar 50 μg da biblioteca de cDNA de S. pombe ao tubo de microcentrífuga contendo mistura de DNA portador de células competente.
8. Incubar os tubos de microcentrífuga à temperatura ambiente durante 10 min e, em seguida, adicionar 260 μL de solução de acetato de polietilenoglicol-lítio (40% [p/v] PEG 4.000, acetato de lítio 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) aos tubos e misturar suavemente com a ajuda de uma ponta de micropipeta.
9. Incubar os tubos de microcentrífuga que contêm a mistura de transformação a 32 °C durante 2 h sem agitar. Adicione 43 μL de sulfóxido de dimetilo pré-aquecido (DMSO) ao tubo de microcentrífuga e misture suavemente. Subsequentemente, expor os tubos a choques térmicos a 42 °C durante 5 min.
10. Pellet as células a 4.000 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e remover a solução residual de PEG-LiAc-TE com a ajuda de uma ponta de micropipeta.
11. Ressuspender as células em 100 μL de água estéril e placa em uma placa EMM2 (Tabela 1) (150 mm) com os suplementos necessários e 0,2 μg/mL de 4-NQO.
12. Incubar as placas a 32 °C durante 5-6 dias para permitir que as colónias apareçam nas placas. Estrie as colônias obtidas na mesma placa média na presença de 0,2 μg/mL de 4-NQO e use para triagem adicional.
13. Para um experimento de transformação de biblioteca, use 500 μL de células competentes (125 μL de células competentes x 4 tubos de microcentrífuga) para transformação, conforme descrito nas etapas 1.8 a 1.14 acima.
14. Como controle, placa 1/10 da mistura de transformação em uma placa EMM2 (150 mm) com suplementos necessários, mas sem 4-NQO, para calcular o número total de clones de biblioteca obtidos após a transformação^da biblioteca e triagem para isolamento dos clones supressores.

2. Testar e validar o resgate/supressão do fenótipo associado à cepa mutante de consulta pelo supressor putativo

NOTA: Ensaios de ponto de estresse foram realizados conforme descrito abaixo para testar e validar o resgate/supressão da sensibilidade ao estresse 4-NQO associada à deleção ell1 pelo(s) supressor(es) putativo(s).

1. Adicione 100-200 μL de água estéril em cada um dos diferentes poços de uma placa de microtitulação estéril de 96 poços.
2. Pegue uma pequena quantidade de inóculo de cada uma das diferentes colônias obtidas após a transformação da biblioteca de cDNA na placa contendo 4-NQO usando um palito de dente estéril ou uma ponta de micropipeta de 20-200 μL. Adicionar o inóculo de cada uma das diferentes colónias em poços independentes separados da placa de microtitulação contendo 100-200 μL de água estéril. Homogeneizar.
3. Spot 3 μL da suspensão celular de cada poço em placas de ágar EMM2 contendo adenina (225 μg/mL) e uracilo (225 μg/mL), mas sem leucina (o marcador auxotrófico selecionável presente no vetor plasmidial utilizado para a construção da biblioteca utilizada neste trabalho). Adicione concentrações apropriadas de 4-NQO às placas, conforme necessário.
4. Incubar as placas a 32 °C durante 3-4 dias para permitir que as células cresçam. Identifique as colônias que mostram crescimento na presença de diferentes concentrações de 4-NQO como supressores putativos.
5. Para validar ainda mais os supressores, cultive os supressores selecionados juntamente com cepas de controle apropriadas durante a noite a 32 °C com agitação (200-250 rpm) em meio EMM2 contendo 225 μg/mL cada de adenina e uracilo mas sem leucina.
6. No dia seguinte, diluir as células para uma OD de 600 nm de 0,3 em meio EMM2 fresco e cultivá-las a 32 °C com agitação até a fase intermediária (aproximadamente OD_{600 nm de} 0,6-0,8).
7. Detectar diluições seriadas apropriadas (1:10 ou 1:5) de culturas em placas EMM2 com suplementos necessários contendo 0,4 μM 4-NQO ou 0,01% MMS. Para controle, identifique as cepas em uma placa EMM2 com os suplementos necessários, mas sem qualquer agente prejudicial ao DNA.
8. Incubar as placas a 32 °C durante 3-5 dias para monitorizar o crescimento.
   NOTA: Ensaios adequados com base no fenótipo associado à cepa mutante de consulta devem ser usados para testar o resgate ou supressão do fenótipo. Por exemplo, se os supressores de um fenótipo sensível ao frio de uma cepa mutante de consulta precisarem ser identificados, o ensaio para teste e validação dos clones supressores envolveria o crescimento de transformadores a baixa temperatura.
9. Observe as cepas mutantes transformadas com o gene de interesse de comprimento total (Spell1 neste caso) ou vetor vazio como controles positivos e negativos, respectivamente, juntamente com os transformadores da biblioteca.

3. Isolamento do plasmídeo dos clones supressores de S. pombe

NOTA: O isolamento plasmídico de S. pombe foi realizado seguindo o protocolo descrito em Fissão levedura: um manual de laboratório²⁸ com algumas modificações.

1. Inocular uma única colónia de levedura em meio EMM2 contendo 225 μg/ml de adenina e uracilo e cultivar as células durante a noite a 32 °C com agitação a 200-250 rpm. No dia seguinte, colha 5 células O.D. (ou seja, 10 mL de cultura de O.D. 0,5) por centrifugação por 2 min a 4.000 × g à temperatura ambiente.
2. Remova o sobrenadante e ressuspenda a pastilha celular em 0,2 mL de tampão de lise (Triton X-100 a 2%, SDS a 1%, NaCl 100 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,0) e EDTA 1 mM Na₂).
3. Adicionar 0,2 ml de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e 0,3 g de grânulos de vidro lavados com ácido ao tubo de microcentrífuga. Vórtice do tubo de microcentrífuga durante 2 min a 4 °C e incubar no gelo durante 1 min. Repita esta etapa 6x.
4. Centrifugar o tubo a 10.000 × g durante 15 min à temperatura ambiente. Transferir a camada aquosa superior para um tubo de microcentrífuga fresco e adicionar 200 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1).
5. Centrifugar o tubo a 10.000 × g durante 10 min. Transfira a camada aquosa superior para um tubo fresco e adicione dois volumes de etanol a 100% (~400 μL) e 1/10 volume de acetato de sódio (3 M, pH 5,8) (~20 μL) ao tubo. Incubar o tubo de microcentrífuga -70 °C durante 1 h.
6. Precipitar o ADN por centrifugação a 10 000 × g durante 15 minutos a 4 °C e remover o sobrenadante. Lave o pellet de DNA com etanol a 70% (~500 μL) e mantenha-o à temperatura ambiente para secar ao ar.
7. Ressuspender o DNA em 20 μL de água estéril. Use 2-5 μL de DNA plasmídico para a transformação de células competentes de E. coli.
   NOTA: O plasmídeo também pode ser isolado de células de levedura usando qualquer um dos kits de isolamento de plasmídeos de levedura comercialmente disponíveis.

4. Identificação do gene codificado pelo clone supressor

1. Transformar os plasmídeos de levedura isolados em cepas E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] usando o protocolo padrão²⁹ e espalhar as células em placas LB (Caldo de Luria) com antibióticos necessários.
2. Isolar o(s) plasmídeo(s) dos transformadores de E. coli utilizando o protocolo padrão de lise alcalina²⁹ e seguir as combinações apropriadas de enzimas de restrição para verificar a liberação do fragmento de DNA da inserção por digestão de restrição.
   NOTA: O plasmídeo supressor 84 foi digerido com a enzima de restrição Bam HI e o plasmídeo supressor 104 foi digerido com as enzimas de restrição PstI/BamHI.
3. Retransforme os plasmídeos mostrando liberação de inserção após digestão de restrição na cepa ell1 Δ para verificar sua capacidade de resgatar o fenótipo genotóxico sensível ao estresse da cepa ell1Δ.
4. Selecione os clones plasmídicos que apresentam supressão da sensibilidade ao estresse genotóxico e sequencie o fragmento de DNA de inserção presente nesses clones plasmídicos usando primers para frente e para trás específicos do vetor.
   NOTA: Neste estudo, foi utilizado o primer universal forward específico do promotor adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')³⁰.
5. Para identificar o gene responsável pela supressão, alinhe a sequência obtida usando o blasto de nucleotídeos NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) ou a ferramenta de alinhamento de sequência Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Selecione a sequência que mostra o alinhamento máximo e identifique-a como o gene para o plasmídeo supressor de multicópia.

Resultados

Triagem para sugador(es) de múltiplas cópias de sensibilidade ao estresse genotóxico associado à deleção ell1 em S. pombe
Realizamos a triagem genética utilizando o protocolo descrito acima para identificar supressores multicópia do fenótipo de perda de função da cepa mutante de deleção de consulta ell1. A sensibilidade relacionada ao crescimento da cepa de deleção ell1 observada na presença do agen...

Discussão

As leveduras têm sido amplamente utilizadas para investigar os processos biológicos básicos e as vias que são conservadas evolutivamente em organismos eucarióticos. A disponibilidade de ferramentas genéticas e genômicas, juntamente com sua amenidade a vários procedimentos bioquímicos, genéticos e moleculares, tornam as leveduras um excelente organismo modelo para a pesquisa genética^34,35,36. Ao longo dos anos, várias...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-NQO	Sigma	N8141
Acetic Acid, glacial	Sigma	1371301000
Adenine Sulphate	Himedia	GRM033
Agar	Himedia	GRM026
Agarose	Lonza	50004L
Ammonium Chloride	Himedia	MB054
BamHI	Fermentas	ER0051
Biotin	Himedia	RM095
Boric Acid	Himedia	MB007
Calcium Chloride	Sigma	C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1	Sigma	C0549
Citric Acid	Himedia	RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous	Himedia	GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes	Sigma	D7656
EDTA disodium	Sigma	324503
Ferric Chloride Hexahydrate	Himedia	RM6353
Glucose	Amresco	188
Ionositol	Himedia	GRM102
Isopropanol	Qualigen	Q26897
Leucine	Himedia	GRM054
Lithium Acetatae	Sigma	517992
Magnesium Chloride Hexahydrate	Himedia	MB040
Molybdic Acid	Himedia	RM690
Nicotinic Acid	Himedia	CMS177
PEG, MW 4000	Sigma	81240
Pentothinic Acid	Himedia	TC159
Phenol	Himedia	MB082
Plasmid Extraction Kit	Qiagen	27104
Potassium Chloride	Sigma	P9541
Potassium hydrogen Pthallate	Merc	DDD7D670815
Potassium iodide	Himedia	RM1086
RNAse	Fermentas	EN0531
SDS	Himedia	GRM205
Sodium Hydroxide	Himedia	GRM1183
Sodium Sulphate	Himedia	RM1037
Tris free Base	Himedia	MB209
Uracil	Himedia	GRM264
Yeast Extract Powder	Himedia	RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate	Merc	DJ9D692580