Fabricação de Microesferas Porosas Altamente Abertas (HOPMs) via Tecnologia Microfluídica

Resumo

O presente protocolo descreve a fabricação de microesferas porosas altamente abertas (HOPMs) à base de poli(ácido lático-co-glicólico) através da tecnologia microfluídica fácil baseada em formulação de emulsão única. Essas microesferas têm aplicações potenciais em engenharia de tecidos e triagem de medicamentos.

Resumo

Em comparação com andaimes a granel e injeção direta de células sozinhas, as unidades modulares injetáveis atraíram enorme interesse em reparar tecidos com defeito devido à conveniência na embalagem das células, melhor retenção de células e invasividade mínima. Além disso, a conformação porosa desses portadores de microescala poderia aumentar a troca de meios e melhorar o nível de nutrientes e suprimentos de oxigênio. O presente estudo ilustra a fabricação conveniente de microesferas porosas altamente abertas à base de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA-HOPMs) pela tecnologia microfluídica fácil para aplicações de entrega celular. Os PLGA-HOPMs monodispersos resultantes possuíam tamanhos de partículas de ~400 μm e poros abertos de ~50 μm com janelas interligadas. Resumidamente, as gotículas de óleo emulsionadas (solução PLGA em diclorometano, DCM), envoltas com a fase aquosa gelatinosa a 7,5% (p/v), foram introduzidas na solução aquosa de poli(álcool vinílico) (PVA) de fluxo contínuo a 1% (p/v) através do bocal coaxial na configuração microfluídica personalizada. Posteriormente, as microesferas foram submetidas a procedimentos de extração e liofilização com solvente, resultando na produção de HOPMs. Notavelmente, várias formulações (concentrações de PLGA e porogênio) e parâmetros de processamento (potência emulsificante, medidor de agulha e taxa de fluxo de fase dispersa) desempenham papéis cruciais nas qualidades e características dos HOPMs PLGA resultantes. Além disso, essas arquiteturas podem potencialmente encapsular várias outras pistas bioquímicas, como fatores de crescimento, para a descoberta prolongada de medicamentos e aplicações de regeneração de tecidos.

Introdução

Microesferas carregadas de células oferecem vantagens favoráveis, como maior capacidade de retenção celular in situ, entrega eficiente de células e subsequente capacidade de proliferação celular in vivo¹. Até o momento, inúmeras investigações foram apresentadas para o desenvolvimento de uma estrutura de andaimes bem-sucedida para suportar um ambiente propício para células para regeneração tecidual ou aplicações de triagem de drogas². No entanto, o ambiente de hipóxia é muitas vezes inevitável no interior devido ao fornecimento insuficiente de nutrientes/oxigênio e acúmulo de resíduos metabólicos³. Para superar esses problemas, microesferas (MPs) altamente porosas têm sido desenvolvidas utilizando diversos biomateriais ^4,5,6. Além disso, em cultura dinâmica, os andaimes sofrem de tensão de cisalhamento excessiva⁷, e o estado instável do meio de cultura pode quebrar a fidelidade dos PMs. Alternativamente, o poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) poderia ser usado para processar PMs com boa resistência mecânica para cultura dinâmica¹. Por exemplo, demonstramos a co-injeção de microbastonetes ocos de poli(etilenoglicol) carregados de PLGA carregados de mioblastos (C2C12) de camundongos e microbastonetes ocos de poli(etilenoglicol) carregados de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) para curar a perda muscular volumétrica, alcançando notável melhora da regeneração muscular esquelética in situ ⁸.

Notavelmente, os PMs são caracterizados por grandes áreas superficiais e altas porosidades, o que é de interesse específico para a adesão e crescimento celular para a entrega celular minimamente invasiva⁹. Diante desses aspectos, diversos materiais biocompatíveis têm sido empregados para a fabricação dos MPs^10,11. Esses PMs projetáveis cocultivados com células oferecem excelente aderência, considerável resistência mecânica e janelas altamente interconectadas, o que poderia melhorar a proliferação celular para reparar tecidos danificados¹². Nesse sentido, diversas tecnologias também têm sido desenvolvidas para fabricar esferas porosas^13,14. Por um lado, os PMs foram produzidos por meio de agentes formadores de gás, como o NH₄HCO₃, que foram contidos devido à insuficiente interconectividade^15,16,17. Por outro lado, os PMs foram tosquiados diretamente após a emulsificação, o que levou a PMs polidispersos¹⁸. No final, a tecnologia microfluídica de gotículas baseada na abordagem de modelagem de emulsão talvez seja um método eficiente para a construção de PMs, pois muitas vezes resulta em partículas de tamanho uniforme¹⁹. Notavelmente, os atributos morfológicos das microesferas muitas vezes dependem da qualidade das gotículas de emulsão geradas (ou seja, água em óleo, W/O ou óleo em água, O/W), o que pode afetar significativamente os atributos dos biomateriais²⁰. Vale a pena notar que a plataforma microfluídica pré-projetada pode ser aplicada para gerar as microfibras ou microesferas. Em um exemplo, Yu et al. demonstraram a produção de estruturas microfibrosas carregadas de células baseadas em plataformas microfluídicas baseadas em capilares, que poderiam ser usadas para montar redes celulares para imitar tecidos naturais²¹. Em outro caso, Ye et al. fabricaram microcápsulas de cristal fotônico pela replicação de molde de esferas de cristal coloidal de sílica por meio de tecnologias microfluídicas, o que poderia superar muitas limitações das técnicas atuais que requerem rotulagem complexa e aparelhos específicos²².

De fato, a lógica por trás da utilização dessa técnica se deve a várias vantagens, como ser fácil por natureza, não exigir equipamentos sofisticados e sua conveniência na síntese de PMs de tamanho uniforme para entrega celular e aplicações de medicina regenerativa. Neste contexto, com componentes pré-projetados de emulsão-modelagem, PMs com altas porosidades e interconectividade podem ser convenientemente obtidos a partir de um dispositivo microfluídico montado a partir de tubos de poli(cloreto de vinila) (PVC), um capilar de vidro e uma agulha. Uma emulsão-precursora de W/O é preparada homogeneizando uma solução aquosa de gelatina e uma solução orgânica de PLGA. Ao injetar seletivamente a porção aplicável da emulsão na plataforma microfluídica, os PMs com tamanhos de partículas uniformes e poros interconectados em toda a superfície para o interior são fabricados. O presente protocolo tem como objetivo fabricar os PLGA-HOPMs por emulsão-modelagem na plataforma microfluídica. Acredita-se que este protocolo permite a produção reprodutível de PLGA-HOPMs e será potencialmente aplicável em seus campos relacionados de engenharia de tecidos e triagem de medicamentos.

Protocolo

1. Preparação de soluções

1. Preparar a solução-mãe de PVA com antecedência, aquecendo a solução de PVA em banho-maria a 80 °C e, subsequentemente, colocando-a no frigorífico a 4 °C. Arrefecer até à temperatura ambiente (RT) para utilização experimental.
2. Preparar o precursor da emulsão adicionando a solução aquosa de gelatina (1 ml, 7,5%, p/v) à fase orgânica do PLGA (2 ml, 2%, p/v em diclorometano, DCM) (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Geralmente, a tecnologia microfluídica envolve diferentes fases para formar as microesferas. A fase contínua ou coletora compreende um poli(álcool vinílico) aquoso (PVA, 600 mL, 1%, p/v).

2. Montagem de dispositivos microfluídicos de gotículas e fabricação de PLGA-HOPMs

Observação : os itens consumíveis necessários para esta montagem estão listados na tabela de materiais.

1. Personalize o conjunto do gerador de gotas.
   1. Construa um gerador microfluídico de co-fluxo usando um capilar de vidro (OD, 1 mm), tubos de PVC (ID, 1 mm) e uma agulha de dosagem de 26 G.
   2. Conecte o capilar de vidro à extremidade do tubo de PVC e, em seguida, perfure com uma agulha na conexão da estrutura acima.
   3. Coloque a outra extremidade do tubo de PVC na fase contínua durante a geração de gotículas. Usando cola UV, sele as lacunas na articulação após a cura.
      NOTA: A agulha precisa ser dobrada curvada cerca de 45° para uma perfuração conveniente no tubo de PVC, e o ponto da agulha esticado no tubo capilar para formar a estrutura coaxial.
2. Prepare a plataforma microfluídica da gota.
   1. Use duas bombas de seringa, como mostra a Figura 1. Use uma seringa de 50 mL para carregar a fase contínua e uma seringa de 5 mL para formação de emulsão.
   2. Defina as taxas de fluxo das fases contínua e de dispersão em 2 mL/min e 0,08 mL/min, respectivamente.
   3. Colocar um copo de 500 ml num banho de gelo e enchê-lo com uma solução aquosa de PVA pré-arrefecida (passo 1.1).
      NOTA: A extremidade do capilar de vidro deve ser imersa na fase de coleta. Sugere-se agitar (1 h, 60 rpm) o sobrenadante da fase coletora com a haste de vidro após a formação de emulsão-gotículas na plataforma. As gotículas de emulsão são produzidas na ponta do ponto da agulha. Em geral, o calibre da agulha influencia o tamanho dos PMs, em que o menor calibre corresponde ao menor tamanho dos PMs. Além disso, o diâmetro dos poros está correlacionado principalmente com a concentração de porógenos, capaz de aumentar com a concentração adequada de gelatina¹.
3. Realizar a emulsificação e geração de gotículas.
   1. Prepare a emulsão seguindo as etapas abaixo.
      1. Preparar a emulsão decantando imediatamente a solução aquosa de gelatina na solução DCM de PLGA (passo 1.2) e emulsionando utilizando o dispositivo ultra-sónico (ver Tabela de Materiais).
      2. Ajuste a potência ultra-sônica para 400 W e defina o tempo total de processamento como 90 s (intervalo 2 s, tratamento ultrassônico 1 s), acompanhado pela mudança constante da posição da sonda manualmente.
      3. Estabilize a emulsão resultante para sucção de seringas e geração de gotículas em aproximadamente 20 min.
         NOTA: Coloque a sonda do disjuntor de células ultra-sônico na interface óleo-água. Sugere-se não deixar a sonda ultra-sônica entrar em contato com o recipiente.
   2. Execute a geração de gotículas.
      1. Carregar a emulsão preparada (passo 2.3.1) rapidamente na seringa de 5 ml da plataforma microfluídica após tratamento ultra-sónico.
      2. Introduza a emulsão de W/O instável (que está no curso da separação de fase) no dispositivo microfluídico como a fase descontínua. Ao mesmo tempo, use a solução aquosa de PVA como a fase contínua.
      3. Recolher as microesferas que contêm a emulsão no fundo do copo coletor (PVA, 1%, p/v) depois de injetar porções adequadas da emulsão no dispositivo microfluídico.
      4. Colocar a amostra a 4 °C durante a noite para uma maior estabilização.
   3. Enxaguar e liofilizar as microesferas preparadas (PLGA-HOPMs) seguindo os passos abaixo.
      NOTA: Os PLGA-HOPMs gerados contêm poros arbitrários no interior e na superfície.
      1. Conservar as microesferas a 4 °C antes de normalizar para RT e agitar por uma haste de vidro (1 h, 60 rpm) para eliminar o DCM residual.
      2. Filtre cuidadosamente a fase de coleta no copo de 500 mL e lave as microesferas coletadas três vezes com água deionizada para lavar o PVA residual na superfície dos PMs.
      3. Colocar as microesferas PLGA em banho-maria a 37 °C durante 30 minutos para dissolver a gelatina envolta na espinha dorsal do PLGA.
      4. Enxaguar os PLGA-HOPMs resultantes duas vezes com a água desionizada para remover a gelatina residual e pré-resfriar para liofilização a -80 °C por 24 h.
      5. Conservar os PLGA-HOPMs secos a -20 °C para experiências complementares.

3. Imagem do microscópio eletrônico de varredura (MEV)

1. Depositar PLGA-HOPMs no estádio de amostra de MEV (ver Tabela de Materiais) no RT e colocar o estádio de amostra na célula de pulverização do sputter magnetron. Ligue o transformador e o magnetron um por um. Introduza a amostra no MEV depois de ser revestida com ouro por 1 min.
2. Obtenha as imagens de MEV ajustando a tensão de aceleração em 5 kV.
3. Além disso, quantifique o tamanho das partículas de PLGA-HOPMs usando 100 PMs no campo variável de imagem de MEV. Meça o resultado representativo para quantificar a distribuição do tamanho dos poros.
   1. Abra os gráficos com a Imagem J e use a "linha reta" para corresponder à barra de escala da imagem SEM, o que faz com que o software identifique o pixel até o comprimento.
   2. Clique em analisar > escala definida, defina a "distância conhecida" para a barra de escala da imagem SEM e clique em > global OK.
   3. Clique em analisar > Ferramentas > gerenciador de ROI ... para medir o tamanho do poro ou partícula dos PMs PLGA e clique em adicioná-lo. Meça o número de amostras com base no requisito.
   4. Clique em Medir para obter os dados quantitativos dos gráficos para um cálculo mais aprofundado.

4. Cultura celular e imagem de fluorescência

NOTA: Células-tronco mesenquimais da medula óssea de ratos (BMSCs) foram utilizadas para o presente trabalho. As células foram obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Cultivar as células em meio Eagle modificado de Dulbecco suplementado com L-glutamina (DMEM/F-12), soro fetal bovino a 10% (v/v) e 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂.
2. Passar os BMSCs de ratos em uma proporção de 1:2 após atingir 90% de confluência.
3. Execute a adesão celular seguindo as etapas abaixo.
   1. Incubar os PLGA-HOPMs com álcool etílico (5 mL, 70%, v/v) e centrifugar a 500 x g por 10 min no RT para esterilização.
   2. Lave os PLGA-HOPMs esterilizados duas vezes com solução tampão fosfato.
   3. Incubar os HOPMs (cinco em número) com a suspensão celular (5 mL, 1 x 10⁵ células/mL) em tubo centrífugo estéril (50 mL) sob cultura dinâmica para adesão de BMSCs a PLGA-HOPMs.
   4. Realizar a cultura dinâmica em um agitador asséptico termostático (37 °C, 90 rpm) colocando um tubo de centrífuga selado de 50 mL no agitador (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: A cultura dinâmica pretende aumentar a taxa de aderência de BMSCs nos andaimes, em vez de incubar diretamente os PMs e células na placa de plástico. As células e os PMs PLGA são adicionados a um tubo de centrífuga estéril de 50 mL, incubando o tubo em um agitador asséptico termostático (37 °C, 90 rpm) e trocando o meio a cada 2 dias.
4. Execute o ensaio de dupla mancha viva e morta.
   1. Enxaguar os PMs carregados de células três vezes para eluir BMSCs sem fixação a PLGA-HOPMs.
   2. Coloque os PMs carregados de células na placa de fundo de vidro de 35 mm. Adicionar 1 ml de tampão corante (ver Tabela de Materiais), incluindo 1 μL de calceína-AM e iodeto de propídio (PI), respetivamente, à amostra pré-lavada com PBS.
   3. Avaliar as amostras por microscopia confocal de varredura a laser (ver Tabela de Materiais). Ligue a luz de excitação de 488 nm e 552 nm no detector correspondente. Para a análise de sobreposição z, defina o z-wide para capturar as diferentes camadas da amostra pelo movimento do eixo z do microscópio.
      NOTA: Vale a pena notar que as outras manchas podem ser apropriadamente empregadas para análise.

Resultados

Com base em trabalhos anteriores que otimizaram os principais parâmetros¹, o PLGA foi dissolvido no solvente DCM evaporado. A emulsão primária de W/O foi preparada por homogeneização com gelatina sob tratamento com sonda ultrassônica. A estrutura fluídica de co-fluxo personalizada foi montada de forma simplista, na qual uma seringa foi empregada para introduzir os fluxos constantemente. Além disso, foram realizados procedimentos de enxágue suficientes para eliminar o PVA e a gelatina das ...

Discussão

Este artigo descreve uma estratégia eficiente para fabricar arquiteturas baseadas em PLGA, ou seja, os PLGA-HOPMs. Deve-se notar que várias etapas críticas devem ser tomadas com cuidado, incluindo evitar a volatilização do solvente do PLGA e o ajuste suave da potência ultra-sônica para a posição alvo durante a preparação da emulsão. Além disso, a saída líquida da seringa de 20 mL pode ser ajustada até certo ponto para resolver a separação de fases de precursores emulsionados. No entanto, uma limitação...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100