Isolamento das células de linhagem monócito-macrófago dos ossos de ratos por método de adesão secundário

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de BMMs de ratos SD, chamado de método de adesão secundária.

Resumo

Com uma diminuição da densidade mineral óssea, os ossos são mais propensos a fraturar, afetando negativamente a qualidade de vida do paciente. O crescimento e o desenvolvimento dos ossos são regulados principalmente por osteoblastos e osteoclartos. Tem sido amplamente aceito que os osteoclatos são derivados de células monócito-macrófagos de medula óssea (MMC). BMMs e outras células-tronco hematopoiéticas estão localizados na cavidade da medula óssea. Portanto, isolar BMs estáveis de diferentes populações de células heterogêneas é um grande desafio. Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de BMMs de ratos SD, chamado de método de adesão secundária. Foram coletadas células aderentes cultivadas por 24-48 h na cultura primária. A análise citométrica de fluxo mostrou que aproximadamente 37,94% das células eram CD11b/c+ (antígeno da superfície monocito-macrófago). A coloração de fosfattase de ácido resistente ao tartarato (TRAP) e a análise da mancha ocidental demonstraram que os BMMs poderiam se diferenciar em osteoclartos in vitro. Os achados acima sugeriram que as células de adesão secundárias poderiam ser consideradas como um modelo celular adequado para a pesquisa de diferenciação de osteoclatos.

Introdução

Foi relatado que as células de linhagem monocito-macrófago existentes na medula óssea podem se diferenciar em monócitos sanguíneos e macrófagos^{teciduais 1,2}. As células acima, que podem se diferenciar em osteoclastas para equilibrar o crescimento e o desenvolvimento ósseo, são comumente utilizadas como modelo celular para induzir osteos in vivo ^3,4. A medula óssea é um tecido especial que contém vários tipos diferentes de células, que incluem, mas não se limitam apenas a células-tronco mesenquimais de medula óssea, células monócito-macrófagos de medula óssea (MMMs), células-tronco hematopoiéticas, células endoteliais e células imunes. De fato, vários estudos anteriores sugeriram que as células aderentes que saíram correndo da cavidade da medula óssea do osso longo poderiam se diferenciar em osteoblastos, osteoclatos, condrócitos ou adipócitos 5,6,7,8. Embora diferentes métodos de isolamento e cultura tenham sido usados para produzir diferentes populações celulares homogêneas, ainda há grandes desafios em isolar e cultivar BMMs de uma variedade de tipos de células diferentes.

Vários métodos foram desenvolvidos para extrair macrófagos mononucleares de medula óssea (BMSCs). No entanto, a maioria desses métodos são complexos ^9,10,11. Por exemplo, a centrifugação de gradiente de densidade requer um kit especializado e a operação é demorada e complicada. Este método é adequado para o isolamento de BMMs de amostras de sangue de alto volume, mas não a partir de amostras de medula óssea ^9,12,13. Além disso, extrair amostras de tecido usando digestão de colagem é um procedimento complexo e demorado; este método não é recomendado para o isolamento de BMMs a partir de amostras de medula óssea^14,15. Além disso, embora a separação do fluxo possa resultar em populações de monócitos/macrófagos altamente purificados, requer tamanhos amostrais muito grandes e requisitos elevados de instrumentos e equipamentos^10,16. Além disso, o método de enriquecimento de microesferas é extremamente caro e não é viável em um laboratório geral¹⁷.

Portanto, no presente estudo foi proposto um método conveniente, rápido e barato para o isolamento de macrófagos mononucleares da medula óssea. As células de medula óssea aderidas para diferentes pontos de tempo foram utilizadas para isolar os BMMs utilizando um método secundário de adesão. Os BMMs extraídos com o método acima poderiam induzir a formação de osteoclatos in vitro, fornecendo assim um modelo celular simples e conveniente para o estudo futuro da osteoporose in vitro.

Protocolo

Todos os experimentos deste estudo foram realizados de acordo com as diretrizes de experimento animal do Centro de Pesquisa Animal do Laboratório da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (Aprovação Nº: IACUC-20181029-11).

1. Extração celular

1. Coloque os ratos Sprague-Dawley (ratos SD, 1-10 dias de idade, masculino ou feminino) nas gaiolas de eutanásia preenchidas com CO₂ a uma taxa equilibrada de 30%-70% de volume de contêiner/minuto. Depois que os ratos perdem a consciência (20-60 min), eutanize o rato por luxação cervical para garantir uma morte indolor.
2. Mergulhe os ratos em 75% de álcool por 10 minutos para desinfecção.
3. Remova cuidadosamente todos os membros do rato com tesouras e fórceps, aspire com PBS usando uma pipeta e lave o sangue aderindo aos membros.
4. Adicione 5 mL de solução de penicilina/estreptomicina em 500 mL de DMEM e misture bem. Pegue um tubo de centrífuga estéril de 50 mL, adicione 5 mL de FBS e 45 mL de meio DMEM e misture bem para obter um DMEM de 10% FBS contendo 1% de solução de penicilina/estreptomicina. Adicione 2 mL do meio de cultura acima em um tubo de 5 mL.
5. Transfira os ossos do membro para o tubo de 5 mL. Use uma tesoura para cortar os ossos do membro no tubo em pequenos pedaços (1-3 mm) e misture o homogeneado para suspender novamente as células de medula óssea no meio da cultura. Fique por 5 minutos até que os fragmentos de tecido se instalem na parte inferior do tubo.
6. Adicione 10 mL de 10% FBS DMEM em um prato de cultura de 100 mm, e depois transfira o supernasce para o prato de cultura. Ao aspirar o supernante, evite transferir os detritos teciduais para o prato de cultura.
7. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por aproximadamente 24 h. Após esse período de incubação, a maioria das células-tronco mesenquimais aderirá à parede de pratos da cultura e crescerá lentamente, enquanto a maioria dos BMMs ainda será suspensa no meio da cultura.
8. Transfira a suspensão celular no prato de cultura de 100 mm para um novo frasco^{de 25 cm 2} e continue a cultivar as células a 37 °C e 5% de CO₂ por mais 24 h. Os BMMs aderirão à parede de frascos a 24-48 h de cultura. Remova o meio antigo cuidadosamente e substitua-o por meio fresco após os BMMs terem aderido à parede do frasco.
9. Subcultura quando as células do frasco atingiram 80%-90% de confluência.
   NOTA: Todas as células foram cultivadas a 37 °C e 5% de CO₂. Durante a cultura, a morfologia celular foi gradualmente unificada. As células eram grandes, de forma irregular, de crescimento radial e presas ao frasco em uma forma de disco, onde múltiplos núcleos podiam ser observados.

2. Mancha FACS da célula

1. Digestão de trippsina usando 1-2 mL de trippsina comercial a 37 °C e 5% DE CO₂ por 5 min e conte células aderentes secundárias para garantir uma contagem final de células de 100.000/amostra (células de contagem com hemocitômetro Neubauer).
2. Divida as células em três grupos (500 μL de PBS contém 100.000 células): (1) o grupo de controle em branco contendo células não manchadas; (2) o grupo controle do isótipo; e (3) o grupo experimental (coloração CD11b/c).
3. Incubar anticorpos primários (sem anticorpos para o grupo controle em branco; controle isótipo anti-CD11 para o grupo controle do isótipo, 0,6 μL de anticorpo/amostra, 1 μg/amostra; anti-CD11b/c para o grupo experimental, 1 μL de anticorpo/amostra, 1 μg/amostra) no gelo por 30 minutos.
4. Centrifugar a 300-350 x g por 5 min, descartar o supernaspeuta e resuspensar as células com 500 μL de PBS. Repita o procedimento acima uma vez para garantir que os anticorpos primários desvinculados sejam lavados.
5. Incubar o anticorpo secundário correspondente (sem anticorpo para o grupo de controle em branco; IgG anti-coelho de cabra para o controle do isótipo e os grupos experimentais, 0,25 μL anticorpo/amostra, 1:2.000) no gelo no escuro por 30 minutos.
6. Centrifugar a 300-350 x g por 5 min, descartar o supernaspeuta e resuspensar as células com 500 μL de PBS. Repita o procedimento acima uma vez para garantir que os anticorpos desvinculados sejam lavados.
7. Detecte as células positivas do CD11b/c por citometria de fluxo (10.000 células/amostra) e analise os dados por software (por exemplo, FlowJo 7.5).
   NOTA: Para obter o percentual final das células CD11b/c+, utilizou-se a seguinte fórmula: Percentual de células CD11b/ c + no grupo experimental - a porcentagem de células CD11 + no grupo de controle de isótipo.

3. Manchas wright-giemsa

1. Sementes as células secundárias aderentes que foram passagemdas três vezes para folhas de escalada de^{células de} 35 mm 2 (1 × 10⁶ células/bem) e cultura a 37 °C e 5% de CO₂ por 24 h.
2. Descarte o meio de cultura e lave três vezes com PBS.
3. Adicione a solução de corante Wright-Giemsa (0,5 mL-0,8 mL) à folha de escalada celular por 1 min.
4. Misture o corante com água destilada (0,5 mL-0,8 mL) com um cotonete e suporte por 10 minutos.
5. Lave a solução de corante com água destilada e depois seque por 1-3 min. Observe sob um microscópio.

4. Coloração de armadilha

1. Sementes as células secundárias aderentes que foram passagemdas três vezes para folhas de escalada de^{células de} 35 mm 2 (1 × 10⁶ células/bem) e cultura a 37 °C e 5% de CO₂ por 24 h.
2. Substitua o médio antigo pelo meio de indução de 10% FBS DMEM ou osteoclante complementado por 50 ng/mL receptor de ligante de fator nuclear-κB (RANKL) e 30 ng/mL de fator estimulante de colônia macifágica (M-CSF), e cultura a 37 °C e 5% CO₂ por mais 7 dias.
3. Manche as células com o kit de coloração TRAP de acordo com o protocolo do fabricante e observe sob um microscópio.
   NOTA: As células TRAP-positivas foram definidas como osteoclastas, que eram roxas sob um microscópio leve. O número de células TRAP-positive foi medido usando o software ImageJ.

5. Mancha ocidental

1. Sementes as células secundárias aderentes que foram passagem três vezes em folhas de escalada de^{células de} 35 mm 2 (1 × 10⁶ células/bem) e cultura por 24 h.
2. Substitua o médio antigo por um MMEM de 10% fresco ou meio de indução de osteoclato (50 ng/mL de RANKL e 30 ng/mL de M-CSF) e cultura por mais 7 dias a 37 °C e 5% de CO₂.
3. Extrair proteínas celulares totais com tampão RIPA, separar por 10% de SDS-PAGE e transferir para membranas de flúor de polivinida ^18,19.
4. Bloqueie com 5% de pó de leite desnatado (25 mL) por 2h e lave três vezes, por 10 minutos cada vez, com TBS-Tween 20 (TBST).
5. Incubar anticorpos primários a 4 °C durante a noite (anticorpo/banda diluído anti-β, anti-TRAP e anti-catepsina K; todos os anticorpos primários foram diluídos 1:1.000, 10 mL de anticorpo/banda diluído), e lavaram três vezes com TBST.
6. Incubar o anticorpo secundário (anti-coelho de cabra IgG, diluição de 1:2.000, anticorpo/banda diluído de 10 mL) à temperatura ambiente por 2 h, e lavar três vezes com TBST. Visualize as bandas de proteínas usando uma solução em desenvolvimento.
   NOTA: Os níveis de expressão das proteínas acima foram normalizados para β-actina.

Resultados

A população de células aderentes secundárias era estável e uniforme. Com a proliferação contínua das células, a maioria das células tornou-se maior, com forma irregular e cresceu em um disco aderente radial (Figura 2C,D). A citometria de fluxo mostrou que a porcentagem de células expressando CD11b/c, um marcador molecular na superfície das células de linhagem monocito-macrófago, foi de aproximadamente 37,94% (

Discussão

Os osteoclatos são um dos tipos celulares mais significativos envolvidos na ocorrência e desenvolvimento de doenças ósseas, bem como um dos principais objetos da pesquisa de^{doenças ósseas 20}. Monócitos/macrófagos podem se diferenciar em osteoclatos. Como os macrófagos mononucleares (células RAW264.7) são muito caros para comprar e são facilmente ativados durante a cultura, é difícil realizar experimentos de diferenciação in vitro usando esta linha celular. Embora vários m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm2 cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Anti-cathepsin K	Abcam	ab19027	1:1,000
Anti-CD11 isotype control	Abcam	ab172730	1 μg/test,1.675 mg/Ml
Anti-CD11b/c	Absin	abs124232	1μg/test, 1 mg/mL
Anti-TRAP	Abcam	ab191406	1:1,000
Anti-β-actin	Beyotime	AF5003	1:1,000
Cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Cell culture dish	corning	430167
Cell culture flask	corning	430168
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C
Goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab150077	for IF, 1:2,000
goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab6721	for WB, 1:2,000
M-CSF	Pepro tech	400-28
PBS	Biosharp	BL302A
RANKL	Pepro tech	400-30
SD rat	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd		1-10 days old
SDS-PAGE gel preparation kit	Solarbio	P1200
TRAP/ALP Staining Kit	Wako	294-67001
Trypsin-EDTA solution	Biosharp	BL512A
Wright-Giemsa solution	Keygen Biotech	KGA225-1