Um modelo experimental de infarto do miocárdio para estudar o reparo e remodelamento cardíaco em camundongos knockout

Resumo

Descrevemos aqui um modelo experimental de infarto do miocárdio, um procedimento de ecocardiografia para estudar o remodelamento e a função cardíaca e procedimentos para quantificar fibrose e hipertrofia em cortes corados com picrosirius vermelho e rodamina, bem como o tamanho do infarto e o índice de expansão em cortes corados com tricrômico de Masson.

Resumo

A doença cardiovascular é a causa de morte mais prevalente nos países ocidentais, sendo o infarto agudo do miocárdio (IM) a forma mais prevalente. Este artigo descreve um protocolo para estudar o papel da galectina 3 (Gal-3) na evolução temporal da cicatrização e remodelação cardíaca em um modelo animal experimental de IM.

Os procedimentos descritos incluem um modelo experimental de IM com ligadura coronária permanente em camundongos machos C57BL/6J (controle) e Gal-3 knockout (KO), um procedimento de ecocardiografia para estudar remodelamento cardíaco e função sistólica in vivo, uma avaliação histológica de fibrose miocárdica intersticial com cortes corados com lectina corados com picrosirius vermelho e conjugado com rodamina para estudar a hipertrofia de miócitos pela área de secção transversa (MCSA), e a quantificação do tamanho do infarto e remodelamento cardíaco (afinamento cicatricial, espessura do septo e índice de expansão) por planimetria em cortes corados com tricrômico de Masson e cloreto de trifenil tetrazólio. Gal-3 Camundongos KO com IM mostraram remodelamento cardíaco interrompido e um aumento na taxa de afinamento da cicatriz e no índice de expansão. No início do IM, a função miocárdica e o remodelamento cardíaco também foram gravemente afetados. Às 4 semanas após o IM, a evolução natural da fibrose em camundongos Gal-3 KO infartados também foi afetada.

Em resumo, o modelo experimental de IM é um modelo adequado para estudar a evolução temporal do reparo e remodelamento cardíaco em camundongos com deleção genética de Gal-3 e outros modelos animais. A falta de Gal-3 afeta a dinâmica do reparo cardíaco e interrompe a evolução do remodelamento cardíaco e da função após o infarto do miocárdio.

Introdução

O infarto do miocárdio (IAM) é a forma mais prevalente de doença cardiovascular. Após o IM, o miocárdio sofre alterações morfológicas e funcionais seriadas, incluindo a cicatrização da zona de infarto do IM, remodelamento ventricular (RV) e disfunção miocárdica¹. A cicatrização do IM é um processo dinâmico e bem orquestrado associado à infiltração inflamatória profunda que termina na formação de uma cicatriz fibrótica ^2,3. O modelo experimental de IM em camundongos é atualmente utilizado para estudar o remodelamento cardíaco em condições patológicas ^4,5, e o conhecimento do protocolo cirúrgico preciso é essencial para desenvolver um procedimento reprodutível e eficaz para induzir uma ligadura coronária permanente. Esse método é necessário para estudar a cicatrização do IM e sua relevância na evolução temporal do remodelamento ventricular esquerdo (RVE) e na disfunção cardíaca associada ao IM.

As galectinas são um grupo de lectinas que reconhecem carboidratos específicos em ligantes intracelulares, receptores de membrana e glicoproteínas extracelulares. A galectina 3 (Gal-3) é um membro dessa família que atua por meio do reconhecimento e reticulação de N- e O-glicanos em glicoconjugados na superfície celular, sendo amplamente expressa no sistema imunológico⁶. Estudos anteriores investigaram o papel da Gal-3 como regulador da inflamação e fibrose em doenças cardiovasculares 7,8,9,10,11,12. Como o direcionamento dos fatores regulatórios da inflamação durante a cicatrização é altamente relevante porque a inflamação pode afetar notavelmente a evolução do remodelamento, nosso objetivo foi descrever um protocolo para estudar a evolução temporal do remodelamento ventricular pós-IM e as etapas e métodos para determinar como a mutação genética de Gal-3 modifica a evolução temporal da cicatrização no IM e afeta o remodelamento cardíaco e a função em camundongos.

Protocolo

NOTA: Todos os experimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Pesquisa Animal da Universidade de Buenos Aires (CICUAL), em consonância com o Comitê do Conselho Nacional de Pesquisa (EUA) para a Atualização do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório¹³. Para os experimentos, use camundongos machos C57BL / 6J e Gal-3 KO da mesma idade (8-10 semanas de idade) pesando 30-35 g, que permitem uma melhor manipulação para cirurgia. Permita que os animais tenham acesso à água e comida ad libitum. Os camundongos Gal-3 KO foram criados em um fundo C57BL / 6J nas mesmas instalações de biorrecursos que os camundongos C57BL / 6J controle.

1. Área cirúrgica e instrumentos

1. Antes de iniciar a cirurgia, verifique se o ventilador está conectado a uma fonte de alimentação e funcionando corretamente. Confirme se há solução anestésica suficiente. Prepare a solução no dia da cirurgia, calculando o número de animais a serem usados.
2. Confirme se todos os instrumentos cirúrgicos estão esterilizados, incluindo tesouras de aço inoxidável, microtesouras, porta-agulhas para agulhas grandes e pequenas, afastadores, pinças curvas e extra afiadas, pinças serrilhadas e pinças de tecido. Limpe a área de trabalho com etanol 70%.
3. Certifique-se da disponibilidade de pequenas bolas de algodão, hissopos e gaze para cauterização imediata de qualquer hemorragia potencial.
4. Mantenha suturas de seda trançadas revestidas de silicone 10-0 a 7-0 prontas para ligadura da artéria coronária descendente esquerda (LDA), sutura de náilon para fechamento do tórax e fio de linho para fechamento da pele.

2. Anestesia e intubação

1. Pese os camundongos para determinar a dose de anestesia.
2. Pré-aqueça uma almofada de aquecimento cercada por uma base de isopor a 40 °C.
3. Anestesiar os camundongos com administração intramuscular de 0,1 mL / 10 g de peso corporal de uma solução contendo cetamina (65 mg / kg), xilazina (13 mg / kg) e acepromazina (1,5 mg / kg).
4. Uma vez que o mouse esteja anestesiado e antes de iniciar o procedimento cirúrgico, verifique a profundidade do anestésico induzindo um estímulo levemente doloroso, como pressionar os pés com os dedos. Se o animal responder ao estímulo, ajuste a profundidade do anestésico.
5. Coloque o rato em decúbito dorsal e prenda suas pernas na base de trabalho acima da almofada de aquecimento, colocando-o sob um microscópio estéreo binocular. Hiperestenda o pescoço com uma rosca que prende os dentes maxilares presos à base de trabalho.
6. Em seguida, para a parte de intubação, expor os anéis traqueais através de uma incisão mínima no pescoço e canalizá-los com um cateter intravenoso 20 G conectado a um ventilador de roedores (volume corrente: 250 mL/AVC) a uma frequência respiratória de 34-38 ciclos/min, conforme descrito anteriormente¹⁴.
7. Colocar o animal em decúbito lateral para realizar a toracotomia lateral esquerda no quarto ou quinto espaço intercostal. Faça uma incisão na pele do animal; Observe os músculos abaixo e espalhe-os cuidadosamente para separá-los da parede torácica para ver claramente o espaço intercostal. Neste ponto, certifique-se de que o animal esteja conectado corretamente ao ventilador; Em seguida, abra o espaço intercostal fazendo um furo com a pinça extra afiada.
   NOTA: O LDA deve ser identificável ao longo da parede do ventrículo esquerdo (VE) livre nos espaços intercostais mencionados acima.
8. Realize a pericardiectomia e identifique o LDA contrastando as artérias coronárias com as veias coronárias e a ramificação do LDA abaixo da aurícula esquerda. Em seguida, execute a ligadura do LDA usando o 8-0 fio de seda ~2 mm da borda da aurícula. Por fim, feche o tórax por camadas usando o fio de seda 6-0 - feche as costelas, garantindo que não haja pneumotórax em seu interior (faça isso com cuidado, forçando os pulmões a se expandirem com o ventilador) e aproxime-se dos músculos ou suture-os antes de fechar a pele.
9. Uma vez que a pele esteja fechada, desconecte lentamente o camundongo do ventilador em decúbito ventral e remova o tubo endotraqueal quando a frequência respiratória se recuperar. Deixe o animal se recuperar da anestesia em um ambiente silencioso e, de preferência, com temperatura ambiente estável a 27 °C.
10. Espere que os animais se recuperem da anestesia, comecem a mover seus membros e que sua frequência respiratória normal seja restaurada. Em seguida, aloje-os em gaiolas individuais até o final do protocolo.
11. Realizar o mesmo procedimento nos animais de controlo ou simulados, mas sem a ligadura do LDA.

3. Desenho do estudo

1. Para testar a evolução temporal da cicatrização e remodelação ventricular após o infarto do miocárdio, randomize os camundongos nos seguintes grupos:
   1. Para estudar a fase inicial da remodelação ventricular após 1 semana de evolução do IM, atribua os camundongos aos seguintes grupos: 1) C57 Sham (1 semana); 2) Gal-3 KO Sham (1 semana); 3) IM C57 (1 semana); 4) Gal-3 KO MI (1 semana).
   2. Para estudar a fase tardia da remodelação ventricular em 4 semanas de IM, atribua os camundongos aos seguintes grupos: 5) C57 Sham (4 semanas); 6) Gal-3 KO Sham (4 semanas); 7) IM C57 (4 semanas); 8) Gal-3 KO MI (4 semanas).

4. Ecocardiografia

NOTA: Para ecocardiogramas de camundongos, transdutores lineares acima de 10 MHz devem ser usados para visualização adequada dos diâmetros das paredes e tamanhos das cavidades. Este procedimento pode ser realizado sob anestesia com avertin intraperitoneal (IP) a 1,15 mL/kg ou em animais conscientes. No entanto, este último pode levar a resultados confusos em camundongos com infarto do miocárdio devido ao estresse e ansiedade causados pela manipulação.

1. Para anestesiar um rato, pegue-o, segure-o de costas para a palma da mão e vire-o para alcançar a superfície do abdômen. Nessa posição, injete a anestesia IP em um ângulo de 45° entre o animal e a agulha subcutânea.
2. Depois que o mouse estiver anestesiado, raspe o peito e coloque-o sobre uma almofada de aquecimento pré-aquecida na posição de decúbito dorsal. Para obter incidências paraesternais de eixo longo e eixo curto, mova o transdutor 90°. Uma vez obtida a visualização correta do eixo, coloque o cursor no nível do músculo papilar, pressione a tecla 2-D M-mode para capturar as imagens e use o software de análise de imagem para medir os seguintes parâmetros:
   1. Meça as dimensões do VE, incluindo a espessura da parede (LVWT), as áreas do VE na sístole (S) e na diástole (D) e a área diastólica do ventrículo esquerdo (LVDA) e a área sistólica do ventrículo esquerdo (LVSA) em pelo menos três batimentos.
   2. Além disso, calcule a função ventricular pela fração de ejeção (FE, %), a fração de encurtamento (SF, %) e a massa cardíaca (suponha um cubo não corrigido) usando a equação (1), a equação (2) e a equação (3), conforme descrito anteriormente¹⁵.
      SF (%) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100 (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      Massa do VE = 1,055 × ([IVST + LVEDD + PWT]³− [LVEDD]³) (3)
      Onde LVEDD é o diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo, LVESD é o diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo, IVST é a espessura intraventricular e PWT é a espessura da parede posterior.

5. Avaliação histológica

1. Durante a necropsia, extraia o coração do animal abrindo o tórax de um lado para o outro e cortando todas as estruturas que o cercam. Limpe o coágulo sanguíneo que está dentro das cavidades aplicando uma leve pressão usando papel de seda.
2. Colha e pese o coração em uma balança de precisão de laboratório. Mergulhe-o em formaldeído a 10% por pelo menos 72 h em temperatura ambiente. Corte o coração manualmente do ápice à base em fatias transversais de 1 mm de espessura usando uma lâmina e processe as fatias embedindo-as em parafina. Faça cortes em série nas seções embebidas em parafina de 5 μm de espessura com um micrótomo.
3. Coloque cada seção entre as lâminas e core-as com hematoxilina e eosina (H & E), tricrômico de Masson, seções coradas com lectina conjugadas com rodamina ou vermelho de Picrosirius^15,16.
   1. Usando um fotomicroscópio apropriado, tire imagens digitalizadas a 400x para quantificação de morfometria, fibrose e MCSA. Verifique se o microscópio está conectado a uma câmera digital e a um computador com software de análise de imagem. Para cada análise morfométrica, certifique-se de que as imagens estejam nas mesmas áreas, com um mínimo de 10 campos de alta potência a 400x por seção (septo, zona infartada e zona remota) e sem sobreposição dos campos.
      1. Para medir o MCSA, esteja ciente das posições dos miócitos cardíacos e conte apenas os miócitos que são cortados transversalmente e circundados por pelo menos três capilares próximos.
      2. Nas fatias manchadas de vermelho Picrosirius, identifique as áreas da cicatriz e do septo e visualize o colágeno intersticial em ambas as zonas. Carregue as imagens no software de análise e abra a guia de limite para destacar todas as áreas de colágeno positivas e negativas Para obter os dados, pressione a guia de medição e salve os resultados. Para o cálculo da porcentagem de colágeno por região, utilizar a equação (4), somar as zonas positivas para colágeno e dividi-las pelo tecido total, incluindo as áreas positivas para colágeno, conforme descrito em outro artigo^15,16.
         Colágeno (%) = área vermelha de Picrosirius/Área total do tecido (4)
      3. Quantifique o MCSA a partir das imagens digitalizadas obtidas das seções coradas com lectina conjugadas com rodamina das amostras embebidas em parafina. Para obter a imagem correta, use um software de análise de imagem para traçar os contornos vermelhos dos miócitos ao redor das membranas celulares. Selecione a guia de área , trace os contornos e pressione a função de guia de medição . Por fim, salve os resultados das áreas das células¹⁶.

6. Determinação quantitativa do tamanho do infarto e planimetria para avaliar o remodelamento cardíaco

1. Medir o tamanho do infarto do miocárdio, a espessura da parede e o comprimento das circunferências endocárdica e epicárdica usando planimetria das imagens histológicas dos cortes corados com tricrômico de Masson obtidas com um microscópio óptico (4x) e o software apropriado.
   1. Para a quantificação do tamanho do infarto, identifique a zona do infarto (azul) e a zona remota (vermelho). Traçar e medir o comprimento total da zona do infarto e da zona remota nos lados endocárdico e epicárdico. Calcule a média dos traçados endocárdico e epicárdico em porcentagem da circunferência total do VE¹⁷.
   2. Da mesma forma, meça a espessura da cicatriz (a média de cinco medidas equidistantes) e a espessura do septo (a média de três medidas equidistantes) em uma seção média do coração e use essas medidas para determinar a razão da espessura da cicatriz (equação [5]) e o índice de expansão (equação [6]¹⁸).
      NOTA: Todos os valores podem ser registrados em uma planilha.
      Razão da espessura da cicatriz = Espessura da cicatriz/Espessura do septo (5)
      Índice de expansão = (área da cavidade do VE/área total do VE) × (espessura do septo/espessura da cicatriz) (6)
      NOTA: Como o remodelamento pode modificar a expansão, resultando em subestimação ou superestimação do tamanho do infarto, pode ser necessário algum tempo para realizar um experimento piloto para medir o tamanho do infarto em 24 h, seguido de eutanásia. Neste caso, anestesiar o animal com a mesma solução anestésica IP utilizada para o procedimento de IM.
2. Coloque o animal em decúbito dorsal e intube-o conforme descrito anteriormente. Uma vez que o animal esteja anestesiado, faça uma incisão diagonal profunda que atinja a pele, músculos e ossos costais da apófise xifóide até a cavidade axilar.
3. Isole o arco aórtico, faça um pequeno orifício na aorta ascendente e introduza um cateter para perfundir o coração com o azul de Evan. Em seguida, remova manualmente o coração manchado do animal e corte-o do ápice até a base com uma lâmina afiada. Colocar as fatias de coração em cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 1% em tampão fosfato isotónico (pH 7,4) e incubar a 37 °C durante 30 ^min4 para confirmar que os animais são comparáveis em termos de tamanho de enfarte.

Resultados

Sobrevida e necropsia pós-infarto do miocárdio
Ao longo de 4 semanas de acompanhamento, 17% (4/23) dos camundongos C57 versus 40% (8/20) dos camundongos Gal-3 KO foram encontrados mortos. A necropsia foi realizada; os camundongos Gal-3 KO mortos mostraram corações maiores do que os camundongos C57 (Figura 1), e 38% dos camundongos C57 em comparação com 32% dos camundongos Gal-3 KO tinham coágulos torácic...

Discussão

O modelo experimental de IM por ligadura permanente da artéria coronária é utilizado para estudar uma ampla variedade de mecanismos fisiopatológicos de reparo e remodelamento cardíaco5,14,17. Este artigo resume os diferentes métodos atualmente utilizados neste laboratório para estudar a evolução temporal do reparo cardíaco e seus efeitos no remodelamento ventricular^p?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-0 silk suture	Ethicon
C57BL/6J mice	Department of Bioresources of the Faculty of Veterinary of the University of Buenos Aires, Argentina
Forceps
Hardvard 386 respirator	Hardvard company
Heating pad			maintain animal's temperature during surgery
Image Pro-Plus 6.0	Media Cybernetics		Image Analysis Software
Ketamine	Holiday
Masson Trichrome	BIOPUR
Picrosirius red	BIOPUR
Retractors
Rodent Ventilator Model 683	Harvard Apparatus		Mechanical ventilator
Scissors
Stereoscopic magnifying glass	Arcano
Vivid 7 machine (General Electric Medical Systems, Horten, Norway)	General Electric		Any tracking software can be utilized with this protocol
WGA no. RL-1022, Vector Laboratories, Burlingame	Vector Laboratories
Xylazine	Pro-Ser