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Resumo

O presente protocolo descreve a criação de culturas 3D 'no topo' de uma linha celular epitelial de mama não transformada, MCF10A, que foi modificada para estudar a transformação induzida pelo Fator de Ativação de Plaquetas (PAF). A imuno-fluorescência tem sido usada para avaliar a transformação e é discutida em detalhes.

Resumo

Vários modelos foram desenvolvidos para estudar o câncer, como modelos de roedores e linhas celulares estabelecidas. Insights valiosos sobre carcinogênese foram fornecidos por estudos que utilizam esses modelos. As linhas celulares têm proporcionado uma compreensão da desregulamentação da sinalização molecular associada à tumorigênese mamária, enquanto modelos de roedores são amplamente utilizados para estudar características celulares e moleculares do câncer de mama in vivo. O estabelecimento de culturas 3D de células epiteliais e cancerosas mamárias auxilia na ponte entre modelos in vivo e in vitro , imitando as condições in vivo in vitro. Este modelo pode ser usado para entender a desregulamentação de eventos complexos de sinalização molecular e as características celulares durante a carcinogênese mamária. Aqui, um sistema de cultura 3D é modificado para estudar uma transformação induzida por mediadores fosfolipídides (Fator de Ativação de Plaquetas, PAF). Os imunomoduladores e outras moléculas secretadas desempenham um papel importante na iniciação e progressão do tumor na mama. No presente estudo, culturas acinadoras 3D de células epiteliais mamárias são expostas a características de transformação expostas ao PAF, como perda de polaridade e características celulares alteradas. Este sistema de cultura 3D ajudará a lançar luz sobre perturbações genéticas e/ou epigenéticas induzidas por várias pequenas entidades de moléculas no microambiente tumoral. Além disso, este sistema também fornecerá uma plataforma para a identificação de novos, bem como genes conhecidos que podem estar envolvidos no processo de transformação.

Introdução

Uma miríade de modelos estão disponíveis para estudar a progressão do câncer, sendo cada um deles único e representando um subtipo dessa doença complexa. Cada modelo fornece insights únicos e valiosos sobre a biologia do câncer e melhorou os meios para imitar a condição real da doença. Linhas celulares estabelecidas cultivadas como monocamadas forneceram insights valiosos sobre processos vitais in vitro, como proliferação, invasividade, migração e apoptose1. Embora a cultura celular bidimensional (2D) tenha sido a ferramenta tradicional para investigar a resposta das células mamíferas a várias perturbações ambientais, a extrapolação desses achados para prever respostas em nível tecidual não parece suficientemente convincente. A maior limitação das culturas 2D é que o microambiente criado difere em grande parte do do próprio tecido mamário2. A cultura 2D carece da interação das células com a matriz extracelular, que é vital para o crescimento de qualquer tecido. Além disso, as forças de tração experimentadas pela célula nas culturas de monocamadas dificultam a polaridade dessas células, alterando assim a sinalização celular e o comportamento 3,4,5. Sistemas de cultura tridimensionais (3D) abriram uma nova avenida no campo da pesquisa sobre câncer com sua capacidade de imitar as condições in vivo in vitro. Muitas pistas microambientais cruciais que são perdidas na cultura celular 2D poderiam ser restabelecidas usando culturas 3D de matriz extracelular rica em laminino (lrECM)6.

Vários estudos identificaram a importância do microambiente tumoral na carcinogênese 7,8. Fatores associados à inflamação são uma parte importante do microambiente. O Fator de Ativação de Plaquetas (PAF) é um mediador fosfolipídide secretado por várias células imunes que media múltiplas respostas imunes 9,10. Altos níveis de PAF são secretados por diferentes linhas de células cancerígenas de mama e estão associados à maior proliferação11. Estudos do nosso laboratório mostraram que a presença prolongada de PAF em culturas acinar leva à transformação das células epiteliaismamárias 12. O PAF ativa o receptor PAF (PAFR), ativando o eixo de sinalização PI3K/Akt13. O PAFR também está associado ao EMT, invasão e metástase14.

O presente protocolo demonstra um sistema modelo para estudar a transformação induzida pelo PAF, utilizando culturas 3D de células epiteliais mamárias, como foi descrito anteriormente por Chakravarty et al.12. As células epiteliais mamárias cultivadas na matriz extracelular (culturas 3D) tendem a formar esferoides polarizados presos pelo crescimento. Estes são chamados de acini e se assemelham muito ao acini do tecido mamário, a menor unidade funcional da glândula mamária, in vivo15. Estes esferoides (Figura 1A,B) consistem em uma monocamada de células epiteliais polarizadas estreitamente embaladas em torno de um lúmen oco e anexadas à membrana do porão (Figura 1C). Este processo de morfogênese foi bem descrito na literatura16. Quando semeadas no LrECM, as células passam por divisão e diferenciação para formar um aglomerado de células, que então polarizam a partir do dia 4. Até o dia 8, o acini consiste em um grupo de células polarizadas que estão em contato direto com a matriz extracelular e um aglomerado de células não polarizadas dentro das células externas polarizadas, sem contato com a matriz. Essas células não polidas são conhecidas por serem submetidas à apoptose até o dia 12 da cultura, formando um lúmen oco. Até o dia 16, as estruturas presas pelo crescimento são formadasem 16.

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Figura 1: Núcleos de células em acini manchadas com uma mancha nuclear. (A) construção 3D do acini. (B) Imagem de contraste de fase do acini MCF10A cultivada em Matrigel por 20 dias. (C) A seção mais central mostra a presença de um lúmen oco. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ao contrário das culturas 2D, as culturas acinar ajudam a distinguir células normais e transformadas através de mudanças aparentes de morfologia. Células epiteliais de mama não transformadas formam acini com um lúmen oco, imitando o acini mamário humano normal. Esses esferoides, após a transformação, mostram uma morfologia interrompida caracterizada por uma grande perda de polaridade (uma das marcas do câncer), ausência de lúmen, ou interrupção do lúmen oco (devido à evasão da apoptose) que pode ser induzida devido à desregulamentação de vários genes 17,18,19,20 . Essas transformações podem ser estudadas utilizando técnicas comumente utilizadas, como a imunofluorescência. Assim, o modelo de cultura celular 3D pode funcionar como um método simples para investigar o processo de morfogênese acinar mama e carcinogênese mamária. A criação de um sistema de cultura 3D para entender o efeito de um mediador fosfolipídico, PAF, ajudará na triagem de medicamentos pré-clínicos de alto rendimento.

Este trabalho adaptou o protocolo de cultura 3D 'no topo'16,21 para estudar a transformação induzida pelo PAF22. As alterações fenotípicas induzidas pela exposição do acini ao mediador fosfolipídico foram estudadas por meio da imunofluorescência. Vários marcadores de polaridade e epitelial para transição mesenquimal (EMT)foram utilizados no estudo. A Tabela 1 menciona sua localização normal e seu fenótipo esperado após a transformação.

AnticorposMarcasLocalização normalFenótipo transformado
α6-IntegrinBasolateralBasal com mancha lateral fracaMancha lateral forte / Apical
β-CateninJunção celularBasolateralLocalização anormal / nuclear ou citoplasmática
VimentinaEmtPresença ausente/fracaUp-regulation

Tabela 1: Marcadores utilizados no estudo. Diferentes marcadores utilizados com sua localização na presença e ausência de tratamento paf.

Este método pode ser melhor utilizado para estudar/testar drogas plausíveis e genes-alvo para vários subtipos de câncer de mama. Isso pode fornecer um dado de resposta a medicamentos mais próximo do cenário in vivo , auxiliando no desenvolvimento mais rápido e confiável de medicamentos. Além disso, este sistema pode ser usado para estudar a sinalização molecular associada à resposta a drogas e resistência a drogas.

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Protocolo

1. Semeando células MCF10A em lrECM

  1. Manter as células MCF10A (células epiteliais mamárias aderentes) no meio de crescimento. Passagem pelas celas a cada 4 dias.
    NOTA: Composição do meio de crescimento: DMEM de alta glicose sem piruvato de sódio contendo soro de cavalo (5%), insulina (10 μg/mL), hidrocortisona (0,5 μg/mL), fator de crescimento epidérmico, EGF (20 ng/mL), de toxina de cólera (100 ng/mL) e penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL) (ver Tabela de Materiais).
  2. Descongele lrECM (ver Tabela de Materiais) no gelo 20 min antes do início do experimento. O dia da semeadura das células é geralmente considerado o dia 0.
  3. Para tentarpsinizar as células, aspire o meio e lave com 2 mL de PBS. Adicione 900 μL de 0,05% Trypsin-EDTA e incubar a 37 °C por ~15 min ou até que as células estejam completamente experimentadas.
  4. Prepare uma cama de lrECM em oito poços de um escorregador de vidro de cobertura câmara (ver Tabela de Materiais).
    1. Quando as células estiverem experimentpsinizando, cubra cada poço com 60 μL de lrECM e coloque-a em uma incubadora de CO2 de 37 °C por um máximo de 15 minutos.
  5. Prepare a suspensão do celular seguindo as etapas abaixo.
    1. Após a desalojadeira completa das células, adicione 5 mL de meio de re-suspensão para saciar a atividade de trypsin e gire as células a 112 x g por 10 min a 25 °C.
      NOTA: Composição do meio de re-suspensão: DMEM de alta glicose sem piruvato de sódio, suplementado com soro de cavalo (20%) e penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL).
    2. Aspire o meio gasto e suspenda as células em 2 mL de meio de ensaio. Misture bem a suspensão para garantir a formação de uma única suspensão celular.
      NOTA: Composição do médio ensaio: DMEM de alta glicose sem piruvato de sódio, suplementado com soro de cavalo (2%), hidrocortisona (0,5 μg/mL), toxina de cólera (100 ng/mL), insulina (10 μg/mL) e penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL).
    3. Conte as células usando um hemócito e calcule o volume de suspensão celular necessário para semear 6 x 103 células em cada poço.
      NOTA: É geralmente preferível incluir um poço extra no cálculo para explicar quaisquer erros de pipetação.
    4. De acordo com o número de poços necessários, diluir a suspensão celular em meio de sobreposição.
      NOTA: A composição média de sobreposição para um único poço é a seguinte: 400 μL de médio ensaio, 8 μL de lrECM (2% final) e 0,02 μL de 100 μg/mL de EGF (final de 5 ng/mL).
  6. Realize a semeadura das células.
    1. Adicione 400 μL da suspensão da célula diluída aos leitos LrECM preparados (etapa 1.4), garantindo cuidadosamente não perturbar a cama lrECM. Incubar a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2 .

2. Tratamento PAF

  1. Adicione PAF 3 h após a semeadura das células. Prepare um estoque de 100 μM de PAF em PBS e adicione o volume necessário de 0,2 μL em cada poço (o que corresponde a 200 nM).
  2. Adicione a mesma concentração de PAF durante cada alteração de mídia.

3. Re-alimentação com mídia fresca

  1. Reabastecer as células com meio fresco a cada 4 dias (ou seja, dia 4, dia 8, dia 12 e dia 16).

4. Estudo de imunofluorescência para detectar alterações fenotípicas induzidas pela exposição prolongada ao PAF

  1. Após 20 dias de cultivo, cuidadosamente pipeta o meio de cada poço e lave os poços com 400 μL de PBS pré-aquecido.
  2. Fixar as estruturas acinar adicionando 400 μL de 4% de paraformaldeído (recém-preparado por diluição de 16% de paraformaldeído em 1x PBS) e incubação por 20 minutos à temperatura ambiente.
  3. Enxágüe os poços uma vez com PBS gelado e permeabilize com PBS contendo 0,5% Triton X-100 por 10 min a 4 °C.
  4. Depois de 10 min, imediatamente mas cuidadosamente pipeta a solução Triton-X 100 e enxágue com 400 μL de PBS-glicina (recém-preparada adicionando uma pitada de glicina em 1x PBS). Isso é repetido três vezes por 15 minutos cada.
  5. Adicione 400 μL da solução de bloqueio primário que compreende 10% de soro de cabra (ver Tabela de Materiais) no tampão de imunofluorescência (IF) e incubar à temperatura ambiente por 60 minutos.
    NOTA: Composição do buffer IF: 0,05% azida de sódio, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 e 0,05% Tween (20 em 1 PBS).
  6. Remova a solução de bloqueio primário, adicione 200 μL de anticorpo de bloqueio secundário de 2% (F(ab')2 fragmento de anticorpo levantado em cabra contra antígeno de camundongos, veja Tabela de Materiais) preparado em solução de bloqueio primário e deixe-o por 45-60 min à temperatura ambiente.
  7. Prepare o anticorpo primário (ver Tabela de Materiais) em solução de anticorpos de bloqueio secundário de 2% em uma diluição de 1:100. Depois de remover a solução de bloqueio secundário, adicione o anticorpo recém-preparado e incubar durante a noite a 4 °C.
  8. A etapa anterior pode provocar liquefação da membrana do porão. Antes de prosseguir com o experimento, espere até que o slide atinja a temperatura ambiente. Pipete cuidadosamente a solução de anticorpos primários e lave-a três vezes com 400 μL de tampão IF.
  9. Durante a última lavagem com tampão IF, prepare uma diluição de 1:200 do anticorpo secundário conjugado por fluorohore (ver Tabela de Materiais) na solução de bloqueio primária. Incubar os slides na solução de anticorpos secundários por 40-60 min em temperatura ambiente.
  10. Enxágüe os slides com 400 μL de tampão IF por 20 minutos, seguido por duas lavagens com PBS por 10 minutos cada.
  11. Contra-colori a contrapeso dos núcleos com PBS contendo 0,5 ng/mL de mancha nuclear (ver Tabela de Materiais) por 5-6 min em temperatura ambiente. Lave os slides três vezes com 400 μL de PBS para remover o excesso de mancha.
  12. Pipeta cuidadosamente toda a PBS e garanta a remoção da solução residual. Adicione uma gota de reagente de montagem (ver Tabela de Materiais) em cada poço e deixe-o ficar à temperatura ambiente durante a noite.
  13. Armazene os slides à temperatura ambiente e imagem dos slides o mais rápido possível.
  14. Imagem abaixo de 40x ou 63x de ampliação em um microscópio confocal (ver Tabela de Materiais), tomando seções ópticas Z de tamanho de passo de 0,6 mm (NA = 1,4).
  15. Abra as imagens adquiridas com um software de processamento de imagens (ver Tabela de Materiais). Demonstre as diferenças morfológicas usando projeções 3D.
    NOTA: A seção Z óptica mais central pode ser melhor usada para mostrar diferenças na localização de marcadores de polaridade. Estes podem ser quantificados manualmente para representar a porcentagem de esferoides mostrando esse padrão de coloração específico.
  16. Para ilustrar diferenças na expressão das proteínas, realize uma análise semi-quantitativa medindo o valor cinza médio ou calculando a fluorescência celular total corrigida (CTCF)23. Represente os dados como gráficos de violino ou ponto.

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Resultados

As células MCF10A, após a exposição ao tratamento de PAF, formam estruturas acinar com fenótipos muito distintos. α6-integrin foi encontrado como deslocalizado com manchas mais apical. Alguns acini também mostraram manchas descontínuas (Figura 2A). Ambos os fenótipos indicam a perda da polaridade basal, evidenciada pela literatura24,25. Relatórios anteriores indicam o controverso papel do α6-integrin na metástase do cânc...

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Discussão

Modelos baseados em linhas celulares estabelecidos são amplamente utilizados para estudar o processo de carcinogênese. As culturas monocamadas das células continuam a fornecer insights sobre as várias vias de sinalização molecular que mediam mudanças características nas célulascancerosas 32. Estudos sobre o papel de oncogenes conhecidos como Ras, Myc e p53 mutado foram relatados pela primeira vez usando culturas monocamadas como o sistema modelo 33,34,35,36.

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Divulgações

Os autores não declaram potenciais conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos ao IISER Pune Microscopy Facility pelo acesso a equipamentos e infraestrutura e suporte para os experimentos. Este estudo foi apoiado por uma bolsa do Departamento de Biotecnologia (DBT), Govt. da Índia (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB), Govt. of India (EMR/2016/001974) e em parte pelo IISER, fundo Pune Core. A. K. foi financiada pela bolsa CSIR-SRF, L.A. foi financiada através de bolsa DST-INSPIRE, V.C foi financiada pela DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin EDTAInvitrogen25300062
16% paraformaldehydeAlfa AesarAA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488InvitrogenA11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488InvitrogenA-11008
BSASigmaA7030
Chamber CoverglassNunc155409
Cholera ToxinSigmaC8052-1MG1 mg/mL in dH2O
Confocal MicroscopeLeicaLeica SP8
DMEMGibco11965126
EDTASigmaE6758
EGFSigmaE9644-0.2MG100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigenJackson Immunoresearch115-006-006
GM130 antibodyAbcamab52649
Goat SerumAbcamab7481
HoechstInvitrogen33258
Horse SerumGibco16050122
HydrocortisoneSigmaH08881 mg/mL in ethanol
Image Processing SoftwareImageJ
InsulinSigmaI188210 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel)Corning356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)InvitrogenS36937
Nuclear Stain  (Hoechst)Invitrogen33258
PAFCayman Chemicals91575-58-5Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-StreptomycinLonza17-602E
Sodium AzideSigmaS2002
Tris BaseSigmaB9754
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
Vimentin antibodyAbcamab92547
α6-integrin antibodyMilliporeMAB1378

Referências

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