Estudo das Funções e Atividades do Co-Transportador Neuronal K-Cl KCC2 Usando Western Blotting

Resumo

O presente protocolo destaca a aplicação da técnica de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K-Cl KCC2. O protocolo descreve a investigação da fosforilação de KCC2 em sítios reguladores de quinase Thr906/1007 via western blotting. Além disso, métodos adicionais para confirmar a atividade do KCC2 são brevemente destacados neste texto.

Resumo

Os cotransportadores de cloreto de potássio 2 (KCC2) são um membro da família de transportadores de solutos 12 (SLC12) dos cotransportadores de cloreto de catião (CCCs), encontrados exclusivamente no neurônio e são essenciais para o bom funcionamento da ^{Cl-homeostase} e, consequentemente, da inibição funcional do GABAérgico. A falha na regulação adequada da KCC2 é deletéria e tem sido associada à prevalência de várias doenças neurológicas, incluindo epilepsia. Houve avanços consideráveis no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, credenciados ao desenvolvimento de técnicas que permitam aos pesquisadores estudar suas funções e atividades; por meio de investigações diretas (avaliando a fosforilação dos sítios reguladores da quinase) ou indiretas (observando e monitorando a atividade do GABA). Aqui, o protocolo destaca como investigar a fosforilação de KCC2 em locais reguladores de quinase - Thr906 e Thr1007 - usando a técnica de western blotting. Existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2, como o ensaio de absorção de íons rubídio e íons tálio. Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto. Algumas dessas técnicas adicionais serão brevemente discutidas neste manuscrito.

Introdução

Os cotransportadores de cloreto de potássio 2 (KCC2) são membros da família de transportadores de solutos 12 (SLC12) dos cotransportadores de cloreto de cátions (CCCs), encontrados exclusivamente no neurônio e são essenciais para o bom funcionamento da ^{Cl-homeostase} e, consequentemente, para a inibição funcional do GABAérgico 1,2,3,4. A manutenção da baixa concentração intraneuronal de Cl- ([Cl-]_i) a 4-6 mM pelo KCC2 facilita a hiperpolarização do ácido ^{γ-aminobutírico} (GABA)/glicina e a inibição sináptica no cérebro e na medula espinhal⁵. A falha na regulação adequada da KCC2 tem sido associada à prevalência de várias doenças neurológicas, incluindo a epilepsia⁴. Além disso, a diminuição da extrusão de Cl⁻ mediada por KCC2 e as correntes hiperpolarizantes hiperpolarizantes GABA_A e/ou mediadas pelo receptor de glicina têm sido implicadas na epilepsia, dor neuropática e espasticidade ^6,7. O KCC2 neuronal é modulado negativamente via fosforilação de resíduos reguladores chave dentro de seu domínio intracelular C-terminal pelo complexo^{de sinalização 1} da quinase com não-lisina (WNK)-STE20/SPS1-related proline/alanine-rich (SPAK)/Oxidative stress-responsive (OSR), o que facilita a manutenção da atividade despolarizada do GABA em neurônios imaturos 2,8,9 . O WNK-SPAK/OSR1 fosforila os resíduos de treonina 906 e 1007 (Thr906/Thr1007) e, posteriormente, regula negativamente a expressão gênica de RNAm do KCC2, levando a uma consequente deterioração de sua função fisiológica ^8,10. Mais importante, no entanto, já é um fato que o complexo quinase WNK-SPAK/OSR1 é conhecido por fosforilar e inibir a expressão de KCC2 1,2,4,11,12, e que a inibição das vias de sinalização do complexo quinase para o fosforilato Thr906/Thr1007 tem sido associada ao aumento da expressão do gene mRNA KCC2 ^13,14,15 . É importante ressaltar que a regulação da expressão neuronal de KCC2 e Na+-K⁺-^{2Cl-cotransportadores} 1 (NKCC1) via fosforilação proteica funciona concomitantemente e em padrões inversos 1,4,16.

Houve avanços consistentes e consideráveis no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, credenciados ao desenvolvimento de técnicas que permitam aos pesquisadores estudar suas funções e atividades; por meio de investigações diretas (avaliando a fosforilação dos sítios reguladores da quinase) ou indiretas (observando e monitorando a atividade do GABA). O protocolo aqui apresentado destaca a aplicação de técnicas de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K⁺-Cl^- KCC2, investigando a fosforilação do cotransportador em sítios reguladores de quinase Thr906/1007.

Western blot é um método usado para detectar proteínas específicas de interesse de uma amostra de tecido ou célula. Este método primeiro separa as proteínas por tamanho através de eletroforese. As proteínas são então transferidas eletroforeticamente para um suporte sólido (geralmente uma membrana) antes que a proteína-alvo seja marcada usando um anticorpo específico. Os anticorpos são conjugados a diferentes tags ou anticorpos conjugados com fluoróforos que são detectados usando métodos colorimétricos, quimioluminescência ou fluorescência. Isso permite que uma proteína-alvo específica seja detectada a partir de uma mistura de proteínas. Essa técnica tem sido utilizada para caracterizar sítios fosfoespecíficos de KCCs¹ e tem sido utilizada para identificar inibidores de quinase que inibem a fosforilação de KCC3 Thr991/Thr1048¹⁷. Seguindo este protocolo, pode-se detectar especificamente KCC2 total e fosforilado a partir de lisatos celulares / teciduais. Em princípio, a detecção de anticorpos conjugados com proteínas por esta técnica é altamente instrumental, pois ajuda a melhorar a compreensão das atividades cooperativas nos fosfo-locais do KCC2, o que lança luz sobre os mecanismos moleculares envolvidos em suas regulações fisiológicas. A análise quantitativa da expressão proteica total é representativa da função e atividade do KCC2. Existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2, como o ensaio de absorção de íons rubídio e íons tálio. Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto.

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Protocolo

NOTA: O protocolo descreve o método de western blotting para detectar proteínas específicas de interesse.

1. Cultura celular e transfecção

1. Aquecer todos os reagentes no banho de grânulos (37 °C) antes do procedimento de cultura celular. Preparar o meio de cultura, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% cada de 2mM de L-glutamina, 100x aminoácido não essencial, piruvato de sódio 100 mM e 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina.
2. Descongelar as células 293 do rim embrionário humano do rato KCC2b transfectado de forma estável (^{HEK293 rnKCC2b})¹⁸ completamente no banho de grânulos (37 °C). Transfira as células do tubo criovial para um tubo de centrífuga contendo 5 mL de meio fresco. Gire a célula a 1200 ×g por 3-5 min.
3. Use uma pipeta aspiradora (fixada a uma bomba de vácuo) para aspirar o sobrenadante e adicione 10 mL de meio fresco para ressuspender as células. Transfira a suspensão da célula para uma placa de prato de 10 cm.
4. Coloque o prato na incubadora e deixe-o crescer por 48 h a 37 ° С em uma atmosfera umidificada a 5% de CO₂ . Monitore o período de incubação para garantir o crescimento celular saudável. Dividimos ainda mais as células quando elas atingiram mais de 90% de confluência após o período de incubação.
5. Aspirar o meio antigo para fora do prato de células e enxaguar suavemente as células com 2 mL de solução salina tampão fosfato (PBS). Adicione 2 mL de tripsina e incube por cerca de 1-2 min à temperatura ambiente.
6. Use 2 mL de meio completo para lavar suavemente as células tripsinizadas no prato. Adicione 9 mL de mídia fresca a novos pratos e adicione 1 mL de solução do prato antigo a cada um dos novos. Transfira os pratos de células divididas de volta para a incubadora por 48 h para atingir ≥ de 90% de confluência.
7. Trate as células com dimetilsulfóxido (DMSO) como controle, estaurosporina 8 μM ou N-etilmaleimida (NEM) 0,5 mM por 15 minutos antes de colher as células em tampão de lise.

2. Preparação de lisados celulares e carregamento de amostras

1. Aspirar a mídia no prato de cultura (a partir de procedimentos de transfecção). Coloque a cultura celular no gelo e lave as células com PBS gelado.
2. Aspirar o PBS e, em seguida, adicionar 1,0 ml de tampão de lise gelado contendo 50 mM de ácido tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de etilenoglicol-bis(éter β-aminoetílico)-N,N,N,N′,N′-tetraacético (EGTA), 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 50 mM de fluoreto de sódio, 5 mM de pirofosfato de sódio, 10 mM de sódio-β-glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sódio, 1% (p/v) de Tritão X-100, 0,27 M de sacarose, 1 mM de benzamina, 0,1% (v/v) de 2-mercaptoetanol e 2 mM de fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) para o prato.
   NOTA: O volume de tampão de lise durante a colheita celular varia com o tamanho do prato, por exemplo, 1 mL de tampão de lise é adequado por 1 x 10⁷ células/prato de 100 mm/frasco de 150 cm 2, enquanto 0,5 mL é adequado por frasco de 5 x 10⁶ células/60 mm/balão de 75 cm².
3. Use um raspador de células de plástico frio para raspar as células do fundo do prato e, em seguida, use suavemente uma pipeta para transferir a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga já no gelo. Agite constantemente o tubo durante 30 minutos a 4 °C.
4. Gire a célula lisada em uma centrífuga fria (4 °C) a 16.000 x g por 20 min, remova o tubo suavemente da centrífuga e coloque-o no gelo. Recolha o sobrenadante num tubo fresco pré-arrefecido e descarte o pellet.
   NOTA: Pode ser necessário variar a força de centrifugação e o tempo, dependendo do tipo de célula. No entanto, as diretrizes gerais incentivam a centrifugação a 16.000 x g por 20 min. No entanto, isso deve ser determinado para cada experimento. Por exemplo, células delicadas como leucócitos precisam de uma velocidade de centrifugação muito leve.

3. Preparação de imunoprecipitantes a partir de lisados celulares

1. Pipetar 300 μL de proteína-G-sefarose para um tubo de microcentrífuga. Gire a solução a 500 x g durante 2 min e elimine o sobrenadante.
2. Adicione 500 μL de PBS e vortex a solução bem. Gire a solução a 500 x g durante 2 min e elimine o sobrenadante. Repita esta etapa.
3. Misture 1 mg de anticorpos anti-KCC2 Thr906 e anti-KCC2 Thr1007 com 200 μL de esferas de proteína G-sefarose e compense o volume até 500 μL com PBS. Agitar sobre uma plataforma vibratória ou roda rotativa durante 2 h a 4 °C. Lave 2x com PBS.
4. Realizar a quantificação de proteínas em todos os lisados celulares e adicionar 1 mg do lisado celular às contas lavadas. Incubar suavemente num rotador de ponta a ponta durante 2 h a 4 °C. Gire as contas e lave-as 3x com PBS contendo cloreto de sódio (NaCl) a 150 mM.
5. Lavar os imunoprecipitantes (miçangas) 3x com 200 μL de PBS. Ressuscite o pellet final em 100 μL de 1x tampão de amostra de dodecil sulfato de lítio (LDS).
6. Agitar os tubos num agitador de rotor à temperatura ambiente durante 5 minutos e incubá-los num bloco de aquecimento a 75 °C durante 10 minutos. Centrifugar a amostra de carga a 11.000 x g durante 2 min e utilizar o sobrenadante para o carregamento do gel.

4. Realizando o western blot

1. Montar o aparelho de fundição e deitar o gel de separação a 8% preparado na hora (ver Tabela 1 para a receita/preparação) para fundir o gel que permita cerca de 2 cm de espaço a partir da parte superior do vidro de fundição. Adicione 200 μL de isopropanol absoluto à configuração e deixe-a repousar à temperatura ambiente durante 60 minutos.
   NOTA: A receita em gel de poliacrilamida para eletroforese em gel de dodecilamida sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) depende do tamanho da proteína de interesse (Tabela 2). Portanto, anote o tamanho da proteína antes de determinar a porcentagem de gel desejada.
2. Use uma pipeta para remover o isopropanol e lave cuidadosamente o gel com cerca de 200 μL de água destilada. Adicionar gel de empilhamento a 6% preparado na hora (ver Tabela 1 para receita/preparação) para preencher o espaço de aproximadamente 2 cm na configuração de fundição. Encaixe suavemente no pente do poço e deixe repousar à temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Fixe o gel fundido no tanque de eletroforese.
4. Dissolva 30,3 g de base Tris, 144,1 g de glicina e 10 g de SDS em 1000 mL de água destilada para preparar 10x tampão de transferência. Prepare 1x tampão de corrida adicionando 10 mL de SDS de 10% e 100 mL de tampão de transferência de 10x a 890 mL de água destilada.
5. Despeje 1x buffer de corrida no tanque. Carregar 5 μL de marcador de peso molecular no primeiro poço e uma quantidade igual de proteína em cada poço do gel SDS-PAGE (entre 18-30 μL, dependendo do tamanho do pente utilizado). Encha os poços vazios com 1x LDS e execute o gel por cerca de 90-120 min a 120 V.
6. Dissolver 58,2 g de base Tris e 29,3 g de glicina em 1000 mL de água destilada para preparar 10x tampão de transferência. Ative a membrana de nitrocelulose com 1x tampão de transferência contendo 20% de metanol. Lave o gel e a membrana com o tampão de transferência e espalhe-os suavemente na pilha de preparação.
   NOTA: Não há necessidade de ajustar o pH dos tampões de corrida e transferência, pois eles devem estar no pH ideal necessário. Além disso, é aconselhável preparar esses buffers e armazená-los à temperatura ambiente antes do experimento para economizar tempo.
7. Organize o sanduíche a ser transferido nesta ordem: eletrodo negativo (moldura preta / extremidade) - espuma de sanduíche - papel de filtro - gel SDS-PAGE enxaguado - membrana de nitrocelulose enxaguada - papel de filtro - espuma de sanduíche - eletrodo positivo (quadro vermelho). Empilhe o sanduíche montado no tanque de transferência e corra a 90 V por 90 min ou 30 V por 360 min.

5. Coloração de anticorpos e desenvolvimento de imagem

1. Retire a membrana e deixe secar. Bloqueie a membrana por 1 h à temperatura ambiente usando um tampão de bloqueio feito de 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. Incubar as membranas com diluições adequadas do anticorpo primário 8,15,19 e da beta-actina (controlo de carga) em tampão de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Lave a membrana em três lavagens de 1x TBS-T por 5 min cada.
   NOTA: A incubação da membrana separada com controles de carga, como beta-actina, alfa-tubulina ou anticorpos gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase é para normalizar os outros resultados de western blotting durante a quantificação subsequente. A diluição recomendada para cada anticorpo primário está disponível no manual do fabricante.
3. Incubar a membrana lavada com anticorpo secundário diluído 5000 vezes em tampão de bloqueio durante 60 min à temperatura ambiente. Novamente, lave a membrana 3x em 1x TBS-T por 5 min cada.
   NOTA: É altamente recomendável que o anticorpo secundário seja levantado contra a espécie em que o anticorpo primário é levantado. Por exemplo, se o anticorpo primário do KCC2 total for anti-KCC2 do rato, então o anticorpo secundário para o anti-rato deve ser utilizado.
4. Coloque a membrana lavada na placa de imagem. Misture volumes iguais de cada reagente de quimioluminescência (ECL) aprimorado e espalhe suavemente a solução mista na membrana para desenvolver sinais.

6. Aquisição de imagens utilizando um sistema de imagem e quantificação de dados

1. Transfira a placa de imagem para o compartimento apropriado no sistema de imagem para geração de imagens. Abra o software de imagem no computador para processamento de imagem.
2. Na barra de ferramentas, clique em Novo Protocolo e escolha Canal Único. Clique em Selecionar na caixa de diálogo de imagem/aplicativo em gel, role até Blot e selecione Chemi Hi Sensitivity ou Chemi Hi Resolution. Em seguida, clique em Configuração de acumulação de sinal para definir a duração e o número de imagens a serem adquiridas.
3. Clique em Position Gel na configuração do protocolo e ajuste o gel no sistema de imagem, se necessário. Clique em Executar protocolo para adquirir as imagens.
4. Clique com o botão direito do mouse em uma das imagens adquiridas sob a caixa do catálogo de imagens para salvar as imagens no computador. Navegue até a imagem desejada e clique em Selecionar imagem e continuar na caixa de diálogo Executar.
5. Clique no ícone Transformação de imagem para ajustar o contraste e a saturação de pixels da imagem. Clique no ícone Captura de tela na barra de ferramentas geral para salvar a imagem no computador, dependendo do formato de imagem desejado.
6. Meça as densidades de banda usando o software ImageJ e analise usando ferramentas estatísticas apropriadas.

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Resultados

Aqui, o resultado representativo apresentado na Figura 1 investigou o impacto da estaurosporina e do NEM na fosforilação mediada por WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 e NKCC1 em linhagens celulares de HEK293 expressando de forma estável KCC2b (HEK^rnKCC2b)¹⁸ utilizando a técnica de western blotting. Detalhes abrangentes sobre os resultados representativos são discutidos em Zhang et ^al.15. Semelhante ao NEM, a estaurosporina é um in...

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Discussão

Muitos métodos têm sido utilizados para medir as atividades do SLC12 de CCCs que são expressos nos neurônios, incluindo o KCC2. Muitas dessas técnicas provaram aprimorar o conhecimento científico sobre a análise da relevância funcional desses transportadores e seus padrões de estrutura-função em diferentes mutações relacionadas à doença. Criticamente, há vantagens e ressalvas para os vários métodos²¹. No entanto, o protocolo explicado acima, delineou como avaliar a fosforilação...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions