JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O presente protocolo descreve a bioengenharia de vesículas de membrana externa como uma plataforma de vacina "Plug-and-Display", incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Resumo

Nanopartículas biomiméticas obtidas de bactérias ou vírus têm atraído um interesse substancial na pesquisa e desenvolvimento de vacinas. As vesículas da membrana externa (OMVs) são secretadas principalmente por bactérias gram-negativas durante o crescimento médio, com um diâmetro nanométrico e atividade auto-adjuvante, o que pode ser ideal para a administração da vacina. Os OMVs têm funcionado como um sistema de entrega multifacetado para proteínas, ácidos nucleicos e pequenas moléculas. Para aproveitar ao máximo as características biológicas das OMVs, as OMVs derivadas de Escherichia coli de bioengenharia foram utilizadas como transportadoras e o domínio de ligação ao receptor (RBD) do SARS-CoV-2 como antígeno para construir uma plataforma de vacina "Plug-and-Display". Os domínios SpyCatcher (SC) e SpyTag (ST) em Streptococcus pyogenes foram aplicados para conjugar OMVs e RBD. O gene da citolisina A (ClyA) foi traduzido com o gene SC como uma proteína de fusão após a transfecção do plasmídeo, deixando um sítio reativo na superfície das OMVs. Após a mistura do RBD-ST em um sistema tampão convencional durante a noite, formou-se ligação covalente entre as OMVs e o RBD. Assim, uma vacina OMV multivalente exibindo foi alcançada. Ao substituir por diversos antígenos, a plataforma de vacina OMVs pode exibir eficientemente uma variedade de antígenos heterogêneos, prevenindo assim potencialmente rapidamente epidemias de doenças infecciosas. Este protocolo descreve um método preciso para a construção da plataforma de vacina OMV, incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Introdução

Como potencial plataforma vacinal, as vesículas de membrana externa (OMVs) têm atraído cada vez mais atenção nos últimos anos 1,2. As OMVs, principalmente secretadas naturalmente por bactérias gram-negativas3, são partículas esféricas em nanoescala compostas por uma bicamada lipídica, geralmente no tamanho de 20-300 nm4. As OMVs contêm vários componentes bacterianos parentais, incluindo antígenos bacterianos e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), que servem como potencializadores imunológicos sólidos5. Beneficiando-se de seus componentes únicos, estrutura natural da vesícula e ótimos locais de modificação de engenharia genética, os OMVs foram desenvolvidos para uso em muitos campos biomédicos, incluindo vacinas bacterianas6, adjuvantes7, medicamentos de imunoterapia contra o câncer8, vetores de entrega de medicamentos9 e adesivos antibacterianos10.

A pandemia de SARS-CoV-2, que se espalhou por todo o mundo desde 2020, teve um pesado impacto na sociedade global. O domínio de ligação ao receptor (RBD) na proteína spike (proteína S) pode se ligar à enzima conversora de angiotensina humana 2 (ACE2), que então medeia a entrada do vírus na célula11,12,13. Assim, o RBD parece ser um alvo principal para a descoberta da vacina14,15,16. No entanto, o RBD monomérico é pouco imunogênico, e seu pequeno peso molecular dificulta o reconhecimento do sistema imunológico, de modo que os adjuvantes são frequentemente necessários17.

A fim de aumentar a imunogenicidade dos RBD, foram construídas OMVs exibindo RBDs polivalentes. Estudos existentes que utilizam a VMO para exibir a RBD geralmente fundem a RBD com a OMV para serem expressas em bactérias18. No entanto, o RBD é uma proteína derivada do vírus, e a expressão procariótica provavelmente afetará sua atividade. Para resolver esse problema, o sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivado de Streptococcus pyogenes, foi utilizado para formar um isopeptídeo covalente com OMV e RBD em um sistema tampão convencional19. O domínio SC foi expresso com Citolisina A (ClyA) como proteína de fusão por bioengenharia de Escherichia coli, e ST foi expresso com RBD através do sistema de expressão celular HEK293F. OMV-SC e RBD-ST foram misturadas e incubadas durante a noite. Após purificação por ultracentrifugação ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), OBTEVE-SE OMV-RBD.

Protocolo

1. Construção do plasmídeo

  1. Inserir a sequência SpyCatcher codificadora de DNA (Arquivo Suplementar 1) em um plasmídeo pThioHisA-ClyA resistente à ampicilina (ver Tabela de Materiais) entre os sítios BamH I e Sal I para construir o plasmídeo pThioHisA ClyA-SC seguindo um relatóriopublicado anteriormente 20.
  2. Ligue o gene de fusão sintetizado SpyTag-RBD-Histag (Arquivo Suplementar 1) em um plasmídeo pcDNA3.1 (ver Tabela de Materiais) entre os sítios BamH I e EcoR I para construir o plasmídeo pcDNA3.1 RBD-ST seguindo um relatório publicado anteriormente19.

2. Preparação OMV-SC

  1. Execute a transformação ClyA-SC seguindo as etapas abaixo.
    1. Adicionar 5 μL de solução plasmídica pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) a 50 μL de cepa competente BL21, soprar suavemente e deixar esfriar no gelo por 30 min.
    2. Colocar a solução durante 90 s em banho-maria a 42 °C e, em seguida, colocar imediatamente a solução misturada no gelo durante 3 minutos.
    3. Adicionar 500 μL de meio LB à suspensão bacteriana e, após mistura, cultura a 220 rpm a 37 °C durante 1 h.
    4. Placa toda a transformação numa placa de ágar LB contendo ampicilina (100 μg/ml, ver Tabela de Materiais) e cultura durante a noite a 37 °C.
      NOTA: Em experimentos subsequentes, a ampicilina foi mantida na mesma concentração no meio. Se não, isso pode causar perda de plasmídeos nas bactérias.
  2. Para a produção do OMV-SC, execute as etapas abaixo.
    1. Isolar uma única colónia da placa (passo 2.1.4.) a 20 ml de meio LB (resistente à ampicilina) e cultivar durante a noite a 220 rpm a 37 °C.
    2. Inocular a solução bacteriana (a partir do passo 2.2.1.) em meio de 2 L, cultura a 220 rpm, 37 °C durante 5 h até à fase de crescimento logarítmico (a DOde 600 nm situa-se entre 0,6 e 0,8).
    3. Quando a DO a 600 nm da solução bacteriana atingir 0,6-0,8, adicionar isopropilbeta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, ver Tabela de Materiais) para que a concentração final da solução bacteriana seja de 0,5 mM e, em seguida, cultura durante a noite a 220 rpm a 25 °C.
  3. Realizar a purificação do OMV-SC.
    1. Centrifugar a solução bacteriana a 7 000 x g a 4 °C durante 30 minutos.
    2. Filtre o sobrenadante com um filtro de membrana de 0,22 μm e, em seguida, concentre-o usando uma membrana de ultrafiltração de 100 kD ou uma coluna de fibra oca (ver Tabela de Materiais).
    3. Filtrar o concentrado através de um filtro de membrana de 0,22 μm, centrifugar-o a 150.000 x g a 4 °C durante 2 h utilizando uma ultracentrífuga (ver Tabela de Materiais) e eliminar o sobrenadante com uma pipeta.
    4. Ressuspenda a precipitação com PBS e guarde-a a -80 °C. A solução pode manter a estabilidade a longo prazo a -80 °C.

3. Preparação do RBD-ST

  1. Realize a transfecção RBD-ST seguindo os passos abaixo.
    1. Selecione um sistema de expressão eucariótica apropriado (por exemplo, HEK293F) e cultive as células durante a noite a 130 rpm a 37 °C após a recuperação.
    2. Adicionar 20 μL de solução de células HEK293F ao contador de células automatizado (ver Tabela de Materiais), registar o número de células, ajustar a concentração para 1 x 106 células/ml e, em seguida, cultivar as células a 130 rpm a 37 °C durante 4 h.
    3. Filtrar o plasmídeo RBD-ST através de um filtro de membrana de 0,22 μm e adicionar 300 μg de plasmídeos no meio de cultura celular (ver Tabela de Materiais) até que o volume final seja de 10 ml; agitar por 10 s.
    4. Aqueça o PEI (1 mg/mL, ver Tabela de Materiais) a 65 °C no banho-maria, misture 0,7 mL de PEI com 9,3 mL de meio de cultura celular e agite intermitentemente por 10 s.
      NOTA: Não agite a solução vigorosamente. Caso contrário, as bolhas resultantes podem afetar a eficiência da transfecção.
    5. Adicionar a solução plasmídica à solução de PEI, agitar a mistura intermitentemente durante 10 s e incubá-la a 37 °C durante 15 minutos.
    6. Adicionar a mistura a 280 mL de meio de cultura celular e a cultura a 130 rpm a 37 °C por 5 dias.
  2. Realizar a purificação do RBD-ST.
    1. Centrifugar as células a 6.000 x g a 25 °C durante 20 minutos e utilizar uma pipeta para recolher o sobrenadante.
    2. Encha a coluna com 2 mL de agarose Ni-NTA (ver Tabela de Materiais) e lave-a 3x com 3x PBS.
    3. Adicione imidazol (ver Tabela de Materiais) ao sobrenadante celular para fazer a concentração final de 20 mM e carregue o sobrenadante celular 2x.
    4. Adicionar 3 volumes de coluna (CV) de PBS contendo 20 mM de imidazol para lavagem e recolher a fracção de lavagem.
    5. Eluição gradiente com 3 CV de PBS contendo concentrações baixas a altas (por exemplo, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) de imidazol; eluir 2x para cada concentração.
    6. Use SDS-PAGE21 para identificar o RBD-ST em diferentes gradientes de concentração.

4. Bioconjugação e purificação OMV-RBD

  1. Determinar a concentração de proteínas pelo método BCA (ver Tabela de Materiais).
    1. Diluir serialmente a solução proteica padrão de BSA de 2 mg/mL a 0,0625 mg/mL, diluir o OMV-SC purificado e o RBD-ST 10x e, em seguida, misturar as soluções de trabalho de BCA A e B (fornecidas no kit de ensaio) na proporção de 50:1 (v/v).
    2. Adicionar solução proteica diluída (25 μL/poço) e misturar com solução de trabalho de BCA (200 μL/poço); incubar a 37 °C durante 30 min.
    3. Medir a absorbância (OD) a 562 nm de cada poço e calcular a concentração de proteína a partir da curva padrão22.
  2. Realizar a bioconjugação de OMV-SC e RBD-ST seguindo os passos abaixo.
    1. Misture OMV-SC e RBD-ST em PBS na proporção 40:1 (p/p).
    2. Girar verticalmente para misturar a mistura durante a noite a 15 rpm a 4 °C.
      NOTA: Antígenos diferentes podem reagir em proporções diferentes. Pode-se tentar diferentes proporções de reação com base nas características do antígeno.
  3. Verifique a eficiência da reação.
    1. Preparar 10 μL de OMV-SC, RBD-ST e o produto da reacção (passo 4.2.). Adicionar 2,5 μL de tampão de carga de 5x (ver Tabela de Materiais) e aquecer as amostras a 100 °C durante 5 min. Carregar as amostras no gel (10 μL/poço). Realize eletroforese a 60 V por 20 min e mude a condição para 120 V por 1 h.
    2. Transfira a proteína do gel para as membranas de Western Blotting PVDF (ver Tabela de Materiais) a 100 V durante 70 min.
    3. Coloque a membrana em 5% de leite em pó desnatado / TBST e agite por 1 h. Em seguida, lave 3x com TBST por 5 min por lavagem com agitação.
    4. Coloque a membrana em 0,1% de anticorpo/TBST His-Tag (ver Tabela de Materiais) e agite por 1 h, depois lave 3x com TBST por 5 min por lavagem com agitação.
    5. Coloque a membrana em 0,02% anticorpo IgG1 (HRP)/TBST anti-rato (ver Tabela de Materiais) e agite durante 40 min, depois lave 3x com TBST durante 5 min por lavagem com agitação.
    6. Adicionar solução de quimioluminescência melhorada (ver Tabela de Materiais) e expor a membrana.
  4. Realizar purificação de OMV-RBD.
    1. Diluir 1 mL de solução de OMV-RBD reagida a 10 mL e centrifugar a diluição a 150.000 x g a 4 °C por 2 h.
    2. Use uma pipeta para descartar o sobrenadante e suspender o resíduo com 10 mL de PBS. Centrifugar a suspensão a 150.000 x g a 4 °C durante 2 h.
    3. Descarte o sobrenadante e suspenda o resíduo com 1 mL de PBS.
      NOTA: Se a solubilidade do antígeno for muito menor, o mesmo efeito de separação pode ser obtido por cromatografia de exclusão de tamanho19.

5. Caracterização

  1. Execute o espalhamento dinâmico de luz (DLS).
    1. Diluir as amostras até uma concentração de 100 μg/ml e adicionar 1 ml de amostra à célula da amostra.
    2. Escolha "Tamanho" para "Tipo de medição", "Proteína" para "Material da amostra", "Água" para "Dispersante", "25 °C" para "Temperatura" e, em seguida, carregue as amostras e meça automaticamente23.
  2. Capture imagens usando microscopia eletrônica de transmissão (MET).
    1. Diluir as amostras a 100 μg/ml. Pegue uma grade de cobre de 200 malhas, adicione 20 μL de amostra a ela e deixe que ela seja absorvida por 10 min.
    2. Use papel de filtro para retirar a solução, adicione 20 μL de acetato de uranilo a 3% ao filme de suporte e core por 30 s.
    3. Retirar o acetato de uranilo e secar a película naturalmente à temperatura ambiente durante 1 h.
    4. Carregue as amostras no sistema TEM (consulte Tabela de Materiais) e capture imagens a 80 kV.

Resultados

O fluxograma desse protocolo é mostrado na Figura 1. Este protocolo poderia ser uma abordagem geral para a utilização de OMVs como uma plataforma de vacinas; basta escolher os sistemas de expressão apropriados com base no tipo de antígenos.

A Figura 2 fornece um esquema de projeto de plasmídeos viável. O gene SC está conectado com o gene ClyA através de um ligador flexível, enquanto ST se conecta ao terminal 5' do gene RBD c...

Discussão

Para criar uma plataforma de vacina de nanopartículas "Plug-and-Display", a ClyA fundida por SC foi expressa em cepas BL21(DE3), que é um dos modelos mais utilizados para a produção de proteínas recombinantes devido às suas vantagens na expressão proteica24, de modo que haveria fragmento de SC suficiente exibido na superfície das OMVs durante o processo de proliferação de bactérias. Ao mesmo tempo, um antígeno-alvo fundido ST foi preparado para o acoplamento químico entre os antígeno...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) e o Projeto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 31670936, 82041045).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin sodiumSangon BiotechA610028
Automated cell counterCountstarBioTech
BCA protein quantification Kitcwbiocw0014s
ChemiDoc Touching Imaging SystemBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatusCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Goat pAb to mouse IgG1Abcamab97240
High speed freezing centrifugeBioridgeH2500R
His-Tag mouse mAbCell signaling technology2366s
ImidazoleSangon BiotechA600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosideSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Non-fat powdered milkSangon BiotechA600669
OPM-293 cell culture mediumOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmidWuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer salineZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimine LinearPolysciences23966-1
Prestained protein ladderThermo26616
pThioHisA ClyA-SC plasmidWuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting MembranesRoche03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x)BeyotimeP0015
Sodium chlorideSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)Thermo34577
Suspension instrumentLife TechnologyHula Mixer
Transmission Electron MicroscopeHitachiHT7800
TryptoneOxoidLP0042B
UltracentrifugeBeckman coulterXPN-100
Ultraviolet spectrophotometerHitachiU-3900
Yeast extractSangon BiotechA610961

Referências

  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
  3. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  4. Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
  5. Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
  6. Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
  7. Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
  8. Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
  9. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
  10. Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
  11. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  12. Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
  13. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
  14. Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
  15. Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
  16. Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
  17. Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
  18. Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
  19. Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
  20. Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
  21. Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
  22. Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
  23. Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
  24. Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
  25. Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
  26. Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
  27. Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  28. Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
  29. van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
  30. Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
  31. Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
  32. Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
  33. Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
  34. Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
  35. Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

BioengenhariaEdi o 185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados