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Resumo

Aqui, um método fácil de seguir para a cultura de células epiteliais primárias do pigmento da retina suína in vitro é apresentado.

Resumo

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada de células epiteliais pigmentadas polarizadas, localizadas entre a coroide e a neurorretina na retina. Múltiplas funções, incluindo fagocitose, transporte de nutrientes / metabólitos, metabolismo da vitamina A, etc., são conduzidas pelo PSE diariamente. As células PSE são células epiteliais terminalmente diferenciadas com pouca ou nenhuma capacidade regenerativa. A perda de células PSE resulta em múltiplas doenças oculares que levam à deficiência visual, como a degeneração macular relacionada à idade. Portanto, o estabelecimento de um modelo de cultura in vitro de células primárias de EPR, que mais se assemelha ao PSE in vivo do que linhagens celulares, é fundamental para os estudos característicos e mecanicistas de células de EPR. Considerando o fato de que a fonte de globos oculares humanos é limitada, criamos um protocolo para cultivar células primárias de PSE suína. Usando este protocolo, as células RPE podem ser facilmente dissociadas dos globos oculares suínos adultos. Posteriormente, essas células dissociadas se ligam a placas / inserções de cultura, proliferam para formar uma monocamada confluente e restabelecem rapidamente as principais características do tecido epitelial in vivo dentro de 2 semanas. Por qRT-PCR, demonstra-se que as células primárias de PSE suína expressam múltiplos genes de assinatura em níveis comparáveis com o tecido RPE nativo, enquanto as expressões da maioria desses genes são perdidas/altamente reduzidas em células humanas semelhantes a RPE, ARPE-19. Além disso, a coloração por imunofluorescência mostra a distribuição de proteínas de junção apertada, polaridade tecidual e citoesqueleto, bem como a presença de RPE65, uma isomerase crítica para o metabolismo da vitamina A, em células primárias cultivadas. No total, desenvolvemos uma abordagem fácil de seguir para cultivar células primárias de PSE suíno com alta pureza e características nativas de RPE, o que poderia servir como um bom modelo para entender a fisiologia da EPR, estudar toxicidades celulares e facilitar exames de drogas.

Introdução

O epitélio pigmentar da retina (EPR) está localizado entre fotorreceptores e coriocapilares na camada externa da retina1 com múltiplas funções, incluindo a formação da barreira sangue-retina, transporte e troca de nutrientes e metabólitos da retina, reciclagem de vitamina A para manter um ciclo visual normal e fagocitose e depuração dos segmentos externos fotorreceptores (POSs)2,3 . Como os POSs requerem auto-renovação constante para gerar visão, as células RPE precisam engolir continuamente os POSs destacados para manter a homeostase da retina4. Portanto, a disfunção do PSE resulta em muitas doenças oculares cegantes, como degeneração macular relacionada à idade (DMRI)4, retinite pigmentosa (RP)5, amaurose congênita de Leber6, retinopatia diabética7, etc. Até agora, a patogênese exata da maioria dessas doenças permanece indescritível. Como resultado, a cultura de células RPE é estabelecida para estudar a biologia celular RPE, alterações patológicas e mecanismos subjacentes.

Como o modelo mais simples para estudar a biologia celular, a cultura de células RPE foi iniciada já na década de 19208. Embora o ARPE-19 seja amplamente utilizado como células RPE, a perda de pigmentação, a morfologia do paralelepípedo e, especialmente, as funções de barreira nessa linhagem celular levantam muitas preocupações9. Em comparação, a cultura de células primárias de EPR humanas oferece um cenário mais realista para estudos fisiológicos e patológicos9. No entanto, a disponibilidade relativamente limitada restringe seu uso e sempre existem questões éticas. Além disso, vários grupos usaram modelos de camundongos para cultivar células RPE. No entanto, o tamanho do olho do rato é pequeno, e uma única cultura geralmente requer muitos ratos, o que não é conveniente9. Recentemente, os cientistas desenvolveram novos métodos para usar células-tronco embrionárias humanas ou células-tronco pluripotentes induzidas para derivar células RPE. Embora essa técnica tenha um potencial particular para o tratamento de distúrbios hereditários do PSE, é demorada e geralmente requer vários meses para gerar células maduras do PSE10. Para superar esses problemas, aqui apresentamos um protocolo fácil de seguir para isolar e cultivar células RPE de alta pureza em laboratório rotineiramente. Sob condições de cultura adequadas, essas células podem exibir funções RPE típicas e exibir morfologias RPE típicas. Portanto, esse método de cultura pode fornecer um bom modelo para entender a fisiologia do EPR, estudar a citotoxicidade, investigar mecanismos patológicos de doenças oculares relacionadas e realizar exames de drogas.

Protocolo

O uso de animais experimentais cumpriu os regulamentos da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) e foi aprovado pelo Comitê de Ética de Manejo de Animais Experimentais da Universidade de Xiamen.

1. Preparação de dispositivos cirúrgicos experimentais, enzima de digestão tecidual e tampão de cultura celular

  1. Preparar os dispositivos cirúrgicos experimentais, limpando e autoclavando dois pares de tesouras cirúrgicas oftálmicas e fórceps no dia anterior à dissecção do globo ocular e, posteriormente, secando a caixa com dispositivos cirúrgicos em forno de protocolo geral a 65 °C durante a noite.
  2. Preparação de meios de cultura.
    1. Preparar DMEM/Meios básicos suplementados com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina e 1% (v/v) de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL).
    2. Preparar meios DMEM/F12 suplementados com FBS a 1% (v/v) e penicilina a 1% (v/v) (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL).
    3. Preparar MEM-Nic 11, suplementando MEM alfa com 2 mM L-glutamina, 1% FBS, 1% (v/v) de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL), 0,1 mM de NEAA, 1% (v/v) de suplemento de N1, taurina (0,25 mg/mL), hidrocortisona (20 ng/mL), triiodo-tironina (0,013 ng/mL) e nicotinamida10 mM.
      NOTA: Para melhorar a viabilidade e proliferação celular, a porcentagem de FBS pode ser aumentada para 20% para neutralizar as enzimas de digestão e semear as células dissociadas. Para a cultura celular de longo prazo, a porcentagem de FBS pode ser reduzida para até 1%12.
  3. Descongelar a alíquota da enzima de digestão tecidual (0,25% (p/v) solução de tripsina/EDTA suplementada com EDTA 0,91 mM, a seguir designada por solução de tripsina/EDTA) durante a experiência.
    NOTA: A solução fresca de tripsina/EDTA deve ser usada sempre para obter os melhores resultados. Aliquot 10 ml de solução fresca de tripsina/EDTA em cada tubo centrífugo estéril de 15 ml e congelar as alíquotas a -20 °C do frigorífico até à utilização.
  4. Solução de dissecação.
    1. Esterilizar 1x Fosfato Tamponado Salino (PBS) (pH 7,2) suplementado com 2% (v/v) de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL) filtrando a solução através de uma unidade de filtro de seringa de 0,22 μm.
  5. Revestir as placas de cultura e as inserções transwell.
    1. Lave os poços e as inserções transwell com 1x PBS. Remova o PBS dos poços e transpoços com uma pipeta e, em seguida, adicione 1 mL de PBS fresco 1x à câmara inferior e 600 μL de 10 μg/mL de solução de laminina à câmara superior.
    2. Incubar as placas/inserções transwell na incubadora de cultura celular durante a noite a 37 °C e 5% de CO2. Retire a solução de laminina da câmara superior e lave com 1 mL de PBS 1x frio duas vezes antes de semear as células.

2. Dissecção das células RPE do globo ocular suíno

  1. Preparação dos instrumentos.
    1. Limpe o exaustor de fluxo laminar com etanol a 75% e luz UV. Prepare três tubos de centrífuga estéreis de 50 mL contendo ~25 mL de etanol a 75%, três tubos de centrífuga estéril de 50 mL contendo ~25 mL de 1x PBS e três placas de cultura de células estéreis de 10 cm contendo ~15 mL de 1x PBS.
      NOTA: Essas configurações geralmente são usadas para dissecar quatro globos oculares suínos. Por favor, aumente a escala quando mais globos oculares forem usados. Para melhorar a viabilidade celular, pré-resfrie 1x tampão PBS no gelo por pelo menos 30 min. Tanto o etanol a 75% quanto a luz UV são necessários para garantir que os instrumentos e células experimentais não sejam contaminados. Ligue a lâmpada UV com antecedência para esterilizar toda a mesa de operação por pelo menos 15 minutos.
  2. Limpe os globos oculares suínos.
    1. Obtenha globos oculares frescos de um matadouro e mantenha-os no gelo até a dissecação. Mergulhe quatro globos oculares suínos em ~ 15 mL de etanol a 75% em uma placa de Petri de 10 cm e use um par de tesouras e pinças para cortar todos os tecidos conjuntivos e músculos residuais.
      NOTA: Remova o máximo de tecido possível de fora da esclera para reduzir as contaminações. Não corte o nervo óptico neste momento para facilitar a transferência dos globos oculares durante a etapa de descontaminação e lavagem. Após essa etapa, todos os procedimentos devem ser realizados em um exaustor de fluxo laminar.
  3. Descontaminar os globos oculares suínos por imersão e lavagem de quatro globos oculares suínos em três tubos centrífugos estéreis de 50 mL preenchidos com etanol a 75% de forma sequencial; cada globo ocular é mergulhado por pelo menos 5 minutos em cada tubo. Em seguida, lave os globos oculares suínos em três tubos centrífugos estéreis de 50 mL preenchidos com 1x PBS de forma sequencial; lavar cada globo ocular por pelo menos 5 min em cada tubo (Figura 1A). Inverta os tubos a cada minuto para lavar bem os globos oculares.
  4. Dissecção de globos oculares suínos.
    1. Mova os quatro globos oculares suínos para um prato de cultura de células estéreis de 10 cm contendo 1x PBS. Aparar a superfície externa de cada globo ocular novamente para remover o nervo óptico e pequenos detritos (Figura 1B). Use uma tesoura para fazer um pequeno corte na interseção do limbo e da esclera e, em seguida, remova a córnea, a íris, o cristalino, o corpo vítreo e a retina neural (para obter estruturas detalhadas desses tecidos, consulte a Figura 1).
    2. Transfira o complexo RPE-coróide-esclera para um novo prato de cultura celular de 10 cm e faça quatro cortes para achatar o copo do olho na forma de um trevo de quatro folhas (Figura 1C).
  5. Execute a digestão da solução de tripsina/EDTA colocando os quatro complexos RPE-coróide-esclera em um novo prato de 10 cm. Deite 20 ml de solução fresca de tripsina/EDTA para fundir os complexos RPE-coróide-esclera e colocar o prato na incubadora de cultura celular a 37 °C durante ~30 min.
    NOTA: Use a solução fresca de tripsina/EDTA para dissociar as células RPE. Controle cuidadosamente o tempo de digestão da solução de tripsina/EDTA, pois um tempo de incubação mais longo (mais de 30 min) pode aumentar a contaminação de outros tipos de células.

3. Isolamento e cultura de células PSE do globo ocular suíno

  1. Dissociação do PSE.
    1. Retirar o prato da incubadora após 30 min de incubação com solução de tripsina/EDTA e adicionar 20 mL de meio de cultura pré-aquecido (com FBS a 10%) ao prato para neutralizar a solução de tripsina/EDTA.
      Observação : nesta etapa, somente mídia DMEM/Basic é usada. Quando as células atingem a confluência, três meios de cultura podem ser usados, dependendo das condições experimentais: DMEM/Meios básicos, meios DMEM/F12 e meios MEM-Nic.
    2. Use uma pipeta de transferência de 5 mL para dissociar as células RPE pipetando suavemente várias vezes. Coletar suspensões celulares em tubos de centrífuga de 15 mL. Use outros 10 mL de meios de cultura frescos (10% FBS) para lavar os complexos RPE-coróide-esclera no prato por pipetagem suave para obter o maior número possível de células RPE.
      NOTA: Não triture as células com demasiada vigor. Certifique-se de encher e esvaziar a pipeta a uma taxa de cerca de 3 mL/s. Evite borbulhar a suspensão celular.
  2. Recolha de células RPE centrifugando os tubos a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante usando uma pipeta e adicionar mais 5 mL de meio de cultura (10% FBS) para ressuspender as células e centrifugar a 200 x g por mais 5 min. Decante o sobrenadante e ressuspenda as células com 12 mL de meio de cultura.
    NOTA: Ao aspirar o sobrenadante, deixe cerca de 1 mL de meio para evitar a quebra de aglomerados celulares.
  3. Semeadura de células RPE.
    1. Semear ~1-2 x 105 células/poço em placas de cultura de 12 poços ou inserções transwell. Normalmente, cerca de 1,5 x 106 células RPE são obtidas a partir de quatro globos oculares suínos. Altere o meio de cultura a cada 2 dias e reduza a concentração sérica para 1% quando as células cobrirem totalmente a superfície dos poços/pastilhas.
      NOTA: Não mova a placa de cultura de células com demasiada frequência antes de as células se ligarem à placa de cultura/pastilhas.
  4. Troque o meio de cultura a cada 2 dias até que as células sejam colhidas.
    NOTA: A concentração de FBS pode ser reduzida depois que as células atingem a confluência, e as células podem ser cultivadas por até vários meses para permitir a diferenciação e maturação completas.

4. Caracterização de células primárias de PSE suíno

  1. Corte as células na confluência por 1 ou 2 semanas e, em seguida, colha as células para uma análise mais aprofundada.
  2. Células de colheita para análise quantitativa de PCR em tempo real (qRT-PCR).
    1. Remova o meio de cultura, lave as células com 1 mL de PBS frio 1x e, em seguida, adicione 500 μL de solução de extração de RNA em cada poço para coletar lisado celular de cerca de 1 x 106 células.
    2. Extrair mRNA13; aproximadamente 4 μg de RNA são extraídos de cada amostra. Utilizar 100 ng de mRNA para realizar a transcrição reversa14; diluir o cDNA 40 vezes para análise quantitativa de PCR em tempo real. Os primers estão listados na Tabela 1.
  3. Colha células para coloração por imunofluorescência.
    1. Remova o meio de cultura, lave as células com 1 mL de PBS frio 1x e, em seguida, adicione 500 μL de paraformaldeído a 4% (p/v) em 1x PBS para fixar as células (cerca de 1 x 106 células/poço) por 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, lavar as células com 1x PBS duas vezes e realizar coloração por imunofluorescência com anticorpos primários (1:100 em 1x PBS suplementado com albumina sérica bovina a 1% (p/v)) a 4 °C durante a noite e anticorpos secundários (1:200 em 1x PBS suplementado com 1% (p/v) de albumina sérica bovina) à temperatura ambiente por 2 h de acordo com protocolos on-line15.
    2. As imagens de imunofluorescência são adquiridas por microscópio confocal seguindo o manual on-line16.
  4. Células de colheita para análise de Western blot.
    1. Remova o meio de cultura, lave as células com PBS frio 1x duas vezes e, em seguida, adicione 80 μL de tampão RIPA (com 1x inibidor de protease) em cada poço e use raspadores de células para arranhar cerca de 1 x 106 células dos pratos/inserções.
    2. Recolher o lisado celular de cada poço/inserção num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Ferva os lisados celulares por 10 minutos e, em seguida, meça as concentrações de proteína usando kits de BCA; a concentração de proteína de cada amostra é de cerca de 2 mg/mL. Utilizar 25 μg de proteínas de cada amostra para análise de Western blot de acordo com protocolos on-line17.
    3. Para Western blot, incubar as membranas em 5 mL de solução primária de anticorpos (diluição 1:1.000 de anticorpos primários em solução 1x TBST suplementada com albumina sérica bovina a 5% (p/v)) a 4 °C durante a noite em um agitador multiuso rotativo.
    4. Em seguida, incubar a membrana com cerca de 15 mL de solução de anticorpo secundário anticoelho ou antirato (diluição de 1:5.000 de anticorpos secundários em solução de TBST 1x suplementada com leite desnatado a 5% (p/v)) à temperatura ambiente por 2 h em um agitador orbital, de acordo com a fonte de anticorpo primário utilizada.
  5. Medição da resistência transepitelial (TER).
    1. Lave os eletrodos de pauzinho com etanol a 70% e PBS 1x estéril de forma sequencial. Em seguida, coloque a extremidade mais curta do eletrodo na câmara superior e a extremidade mais longa na câmara inferior das inserções do transpoço e clique no botão no voltímetro epitelial para as medições. Registre as medições de TER de cada poço em triplicados.

Resultados

As células primárias de PSE suíno (pRPE) foram cultivadas em meio DMEM/Basic com 10% de FBS, e a morfologia celular em microscópio de luz foi fotografada aos 2 dias (Figura 2A), 6 dias (Figura 2B) e 10 dias (Figura 2C) após a semeadura. Após 1 semana, observou-se uma monocamada confluente de células de pRPE pigmentadas com morfologias de paralelepípedos.

Para melhor caracterizar as células primá...

Discussão

Aqui, um protocolo detalhado e otimizado para o isolamento, cultura e caracterização de células RPE de globos oculares suínos, o que gera um bom modelo para caracterização in vitro de células RPE e estudos de distúrbios relacionados ao RPE foi descrito. Métodos para o isolamento do PSE de olhos humanos, camundongos e ratos foram descritos anteriormente23,24,25. No entanto, é difícil obter globos oculares huma...

Divulgações

Todos os autores revelaram que não há conflitos de interesse.

Todos os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de mostrar sua gratidão e respeito a todos os animais que contribuem com suas células neste estudo. Este estudo foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de P & D da China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao e Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Os autores agradecem a Jingru Huang e Xiang You do Laboratório Central, Escola de Medicina, Universidade de Xiamen, pelo apoio técnico em imagens confocais.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
ARPE-19 cellsCCTCCGDC0323
Bovine serum albuminYeasen36101ES60
Confocal microscopyZeissLSM 880 with Airyscan
ChemiDoc TouchBio-Rad1708370
Cell scraperSangonF619301
10 cm culture dishNEST121621EH01
12-well culture plateNEST29821075P
DMEM F12 MediumGibcoC11330500BT
DMEM basic MediumGibcoC11995500BT
EVOM2World Precision InstrumentsEVOM2For TER measurement
Fetal bovine serumExCell BioFSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRPBio-Rad0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRPBio-Rad5196-2504
hydrocortisoneMCEHY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)ThermoFisher Scientific62249
LightCycler 96 InstrumentRoche5815916001
LiothyronineMCEHY-A0070A/CS-4141
lamininSigma-AldrichL2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX MediumGibco10566-016
MEM NEAA(100X)Gibco11140-050
Millex-GP syringe filter unitMilliporeSLGPR33RB
N1Sigma-AldrichSLCF4683
NcmECL UltraNew Cell&Molecular BiotechP10300
Non-fat Powdered MilkSolarbioD8340
NicotinamideSparkJadeSJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibodyAbcamab76020Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)EpizymePG112
primary Human RPE cells --Generous gift from Shoubi Wang lab 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific23225
PrismGraphPad by Dotmaticsversion 8.0
Protease Inhibitor CocktailsAPExBIOK1024
PRE65 antibodyProteintech17939-1-APRecognize both human and porcine proteins
PEDF antibodySanta Cruz Biotechnologysc-390172Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin Biological Industries03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)RARBIORA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master MixToyoboFSQ-201
RIPA bufferThermoFisher Scientific 89900
15 mL sterile centrifuge tubesNEST601052
50 mL sterile centrifuge tubesNEST602052
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
TaurineDamas-beta107-35-7
TrizolThermo-Fisher 15596026RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR430A
12-well transwell insertsLabselect14212
VEGF antibodyProteintech19003-1-APRecognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kitNovusbioVAL106
ZO-1 antibodyABclonalA0659Recognize both human and porcine proteins

Referências

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