Avaliação da consolidação de fraturas ósseas por microtomografia computadorizada

Resumo

A microtomografia computadorizada (μCT) é uma ferramenta de imagem não destrutiva que é fundamental na avaliação da estrutura óssea em estudos pré-clínicos, porém não há consenso sobre os procedimentos de μCT para análise do calo de consolidação óssea. Este estudo fornece um protocolo passo a passo de μCT que permite o monitoramento da consolidação da fratura.

Resumo

A microtomografia computadorizada (μCT) é a modalidade de imagem mais comum para caracterizar a morfologia tridimensional (3D) do osso e do osso neoformado durante a consolidação de fraturas em investigações científicas translacionais. Os estudos da consolidação de fraturas de ossos longos em roedores tipicamente envolvem a cicatrização secundária e a formação de um calo mineralizado. A forma do calo formado e a densidade do osso neoformado podem variar substancialmente entre os momentos e tratamentos. Considerando que metodologias padrão para quantificação de parâmetros de osso cortical e trabecular intacto são amplamente utilizadas e incorporadas em softwares disponíveis comercialmente, há uma falta de consenso sobre os procedimentos de análise do calo cicatricial. O objetivo deste trabalho é descrever um protocolo padronizado que quantifica a fração de volume ósseo e a densidade mineral do calo no calo cicatricial. O protocolo descreve diferentes parâmetros que devem ser considerados durante a imagem e análise, incluindo o alinhamento da amostra durante a imagem, o tamanho do volume de interesse e o número de cortes que são contornados para definir o calo.

Introdução

A microtomografia computadorizada (μCT) tem sido amplamente utilizada na pesquisa óssea pré-clínica, fornecendo imagens não invasivas de alta resolução para avaliar a microestrutura dos ossos 1,2,3,4,5. A μTC envolve um grande número de imagens de raios-X, obtidas a partir de uma amostra rotatória ou usando uma fonte de raios X rotativa e um detector. Os algoritmos são usados para reconstruir dados volumétricos 3D na forma de uma pilha de fatias de imagem. A TC clínica é o padrão-ouro para imagens 3D de ossos humanos, e a μCT é uma técnica comumente utilizada para avaliar a eficiência da consolidação óssea em animais de experimentação1,2,3,4,6,7. O osso mineralizado tem excelente contraste com a radiografia, enquanto os tecidos moles têm contraste relativamente pobre, a menos que um agente de contraste seja usado. Na avaliação da consolidação da fratura, o μCT gera imagens que fornecem informações detalhadas sobre a estrutura 3D e densidade do calo mineralizado. A μCT in vivo também pode ser usada para avaliação longitudinal e ao longo do tempo da consolidação da fratura.

A quantificação da cortical e do trabecular íntegros utilizando a μCT é geralmente bem estabelecida e^padronizada8. Embora os estudos pré-clínicos utilizem uma variedade de metodologias de quantificação para analisar a consolidação da fratura 9,10,11^, um protocolo detalhado de análise de imagens de μCT para quantificação de calos ainda não foi publicado. Portanto, o objetivo deste estudo é fornecer um protocolo passo a passo detalhado para imagens de μCT e análise do calo de consolidação óssea.

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Protocolo

O seguinte protocolo foi desenvolvido para caracterizar calos de cicatrização de ossos longos colhidos de camundongos eutanasiados. No entanto, a maioria das etapas pode ser aplicada em ratos e também usada para varredura in vivo de ossos fraturados. O protocolo descreve um sistema μCT particular e um software específico de processamento, análise e visualização de imagens (ver Tabela de Materiais), mas a metodologia é geralmente aplicável a outros scanners e softwares. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual da Pensilvânia. Os camundongos utilizados neste estudo foram camundongos C57BL/6J machos com 16 semanas de idade (peso médio de 31,45 ± 3,2 g).

1. Colheita e preservação de tecidos

NOTA: Use um modelo de fratura murina adequado. Para este estudo, foi utilizado o modelo de fratura tibial exposta médio-diafisária de acordo com o protocolo padrão descrito em^12,13.

1. Ao final do experimento do modelo de fratura, eutanasiar o camundongo administrando uma injeção intraperitoneal de quetamina ou xilazina (500 mg/kg ou 50 mg/kg, respectivamente).
2. Com tesoura, retire o osso fraturado do fêmur médio para a articulação tíbio-talar sem perturbar o local da fratura. Remova os músculos ao redor do osso deixando apenas o tecido mole que está em contato direto com o osso para apoiar o local da fratura durante as etapas subsequentes de processamento. Remova o pino intramedular usando pinça hemostática reta de micro-mosquito.
3. Conservar as amostras em formalina a 4 °C ou em solução salina a -20 °C. A escolha do veículo de preservação depende das aplicações pretendidas a jusante do μCT. Neste estudo, as amostras foram preservadas em solução salina a -20 °C.

2. μTC

1. Preparo da amostra
   1. Para digitalização simultânea de várias amostras, coloque até seis amostras em um dispositivo de digitalização personalizado desenvolvido em 3D (Figura 1 A,B) ou similar. A varredura simultânea reduz o tempo e o custo da varredura. O dispositivo personalizado utilizado neste estudo contém seis ranhuras para conter as amostras de ossos longos e um orifício central para um simulador de hidroxiapatita (HA) (Figura 1A,B; Tabela de Materiais).
      NOTA: O simulador HA servirá como um padrão na etapa 4.2 (veja abaixo) para converter unidades μCT (normalmente Hounsfield) em densidade HA (mgHA/ccm).
   2. Coloque o acessório preparado em uma seringa ou em um tubo cônico semelhante ao diâmetro do campo de visão (FOV; Figura 1C). Neste estudo, uma seringa de 20 mm foi utilizada para combinar o campo de visão de 21,5 mm.
   3. Para evitar que as amostras secassem durante o processo de escaneamento, preencher a seringa ou o tubo canônico com o conservante utilizado na etapa 1.3 (soro fisiológico foi usado neste estudo).
2. Escaneamento
   1. Antes da varredura, confirme se o aparelho de μCT está calibrado da seguinte forma: coloque um simulador de AH na linha central do μCT FOV, escaneie o simulador e meça a densidade do AH. Certifique-se de que a densidade medida é consistente com a densidade fornecida pelo fabricante.
   2. Alinhe a linha central do dispositivo de fixação da amostra com a linha central aproximada do μCT FOV. Isso garante que as amostras estejam dentro do FOV, e seus longos eixos tenham orientação aproximadamente coincidente com a direção axial das imagens resultantes.
      NOTA: Essa orientação padronizada pode ajudar posteriormente a tornar o procedimento de análise menos propenso a variabilidades, como na quantidade de tecido considerada dentro do volume de interesse.
   3. Definir os parâmetros de varredura do sistema μCT (Tabela de Materiais). Os parâmetros utilizados neste estudo são 10,5 μm (tamanho isotrópico do voxel), 55 kVp (energia/intensidade), 145 μA (corrente) e 300 ms (tempo de integração). Determinar o tamanho do voxel com base na espessura aproximada das trabéculas de camundongos (20-60 μm)⁸. Inspecione visualmente a varredura em diferentes visualizações para garantir que ela cubra todo o volume de todas as amostras de calos.

Figura 1: Estrutura do dispositivo de varredura personalizado. (A) Imagens do dispositivo de varredura (parte superior), mostrando os seis slots de amostragem, e do simulador de AH (inferior). (B) Imagens mostrando a amostra de ossos longos (superior) e o simulador de AH (inferior) colocados nos slots dedicados. (C) Imagens que mostram o dispositivo de varredura colocado em uma seringa de 20 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Segmentação de imagens

Observação : imagens brutas são reconstruídas automaticamente para dados de sequência de imagem.

1. Conversão de imagens: converta os dados da sequência de imagens reconstruídas em sequências de imagens DICOM usando um software de processamento de imagens (consulte Tabela de Materiais). Importe sequências de imagens DICOM para o software (consulte Tabela de Materiais) para processamento, análise e visualização de imagens (Figura 2A).
2. Recorte de imagens: uma amostra de cada vez, recorte cada pilha de imagens e certifique-se de que toda a amostra seja incluída no volume cortado (Figura 2B). Salve a imagem cortada da seguinte maneira: clique na guia Arquivo no canto superior esquerdo da tela, selecione Salvar projeto e, em seguida, selecione Minimizar tamanho do projeto nas opções que aparecem na tela. O arquivo será salvo no formato de software comercial.
3. Denoising de imagens: use um método de filtragem para reduzir o nível de ruído e evitar borrões como segue.
   1. Clique na guia Arquivo e escolha a imagem a ser processada usando Dados Abertos. A imagem aberta aparecerá na janela de visualização do projeto no canto superior esquerdo da tela.
   2. Clique com o botão direito do mouse para selecionar Processamento de imagem e, em seguida, Filtrar Sandbox. Clique em Criar.
   3. Execute o seguinte na janela Propriedades (no canto inferior esquerdo da tela): escolha Dados como o tipo de visualização; selecione o tipo de filtro no menu suspenso ao lado de Filtro; escolher 3D para interpretação; selecione Separável no menu suspenso ao lado do tipo de kernel; preencher os valores a serem utilizados para desvio padrão e fator de tamanho do kernel na caixa vazia disponível ao lado de cada um; selecione O mesmo que entrada no menu suspenso ao lado de saída; clique em Aplicar.
      NOTA: A escolha do tipo de filtro (as opções disponíveis são bilateral, caixa, gaussiano, mediana, exponencial recursivo, delineado, difusão anisotrópica, meios não locais, mascaramento não nítido e filtro FFT) e os parâmetros dependem do nível de ruído e do tamanho do voxel das imagens digitalizadas. Para o filtro gaussiano, 3 x 3 x 3 e 5 x 5 x 5 são valores comumente usados para o fator de tamanho do kernel, e 0,5-2,0 é comumente usado para desvio padrão⁸. Neste estudo, um filtro gaussiano foi aplicado, e 5 x 5 x 5 e 0,8 foram usados para o fator de tamanho do kernel e desvio padrão, respectivamente.
4. Realinhamento de imagem
   Observação : esta é uma etapa opcional. Quando ocorre desalinhamento de amostras de ossos longos em relação aos eixos coordenados do sistema de imagem durante o processo de varredura, um método de alinhamento digital pode ser aplicado para corrigir o desalinhamento (Figura 2C).
   1. Crie uma imagem renderizada em 3D do exemplo da seguinte maneira. Na janela de exibição do projeto, selecione a imagem filtrada e cortada (criada na etapa 3.3). Clique com o botão direito do mouse para selecionar Exibir e, em seguida, Renderização de Volume no menu suspenso e clique em Criar. Verifique visualmente a imagem renderizada em 3D nos planos sagital e frontal.
   2. Gire manualmente o volume renderizado para obter um bom alinhamento no eixo longitudinal. Aplique a transformação às imagens giradas da seguinte maneira: na janela de propriedades, clique no Editor de Transformação, vá para Transformar editor-manipulador e selecione Transformador no menu suspenso. Agora a amostra pode ser girada e realinhada. Quando o processo de realinhamento estiver concluído, clique no Editor de Transformação novamente para bloquear a imagem.
   3. Redefina a amostra da imagem filtrada (criada na etapa 3.3) para criar novas fatias de imagem de plano transversal (axial) da seguinte maneira: Na janela Visualização do projeto, selecione a imagem na etapa 3.4.2. Clique com o botão direito do mouse para selecionar Transformação de geometria e, em seguida, Reamostrar imagem transformada no menu suspenso e clique em Criar. Na janela de propriedades, vá para Dados e execute o seguinte: para interpolação, selecione Padrão no menu suspenso; para modo, escolha Estendido; para preservar, escolha Tamanho do Voxel; Para Valor de preenchimento, digite zero na caixa em branco disponível. Em seguida, clique em Aplicar.
5. Definição do volume de juros (VOI)
   1. Percorrer os cortes transversais de imagem e identificar o plano central do calo da fratura. Definir o VOI com base nas extremidades proximal e distal do calo. Nos casos em que as extremidades do calo são difíceis de definir, defina o VOI com base em uma distância padronizada do plano central do calo (Figura 2D).
      NOTA: Durante as fases de cicatrização que antecedem a remodelação óssea, a definição das bordas do calo mineralizado é fácil, pois a estrutura trabecular do osso tecido recém-formado é distinta da estrutura cortical do osso original. No entanto, quando ocorre a fase de remodelação, o osso neoformado adquire a estrutura cortical gradualmente; Assim, definir as bordas do calo torna-se cada vez mais desafiador.

Figura 2: Segmentação da imagem. (A) Uma imagem mostrando seis amostras dentro de uma varredura (B) Recorte de imagens para isolar amostras individuais. (C) Alinhamento digital para corrigir um eixo longitudinal desalinhado (linha pontilhada amarela). (D) Definição do VOI e plano central do calo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Análise das imagens

1. Segmentação do calo e osso cortical
   1. Contorne o limite externo do calo semiautomaticamente usando a ferramenta de laço de segmentação com opções de rastreamento automático e de bordas de rastreamento (Figura 3A) da seguinte maneira:
      1. Após a remontagem das imagens transformadas (etapa 3.4.3), clique na guia Segmentação na segunda linha da guia na parte superior da tela. Na janela do editor de segmentação, selecione uma imagem transformada (criada na etapa 3.4.3) no menu suspenso ao lado da imagem.
      2. Na janela MATERIAIS, clique duas vezes em Adicionar; Ao fazer isso, duas guias chamadas Material3 e Material4 aparecerão. Clique com o botão direito do mouse para renomear material3 para calo e material4 para osso cortical.
      3. Na janela SELEÇÃO, clique no ícone de laço; nas opções exibidas, selecione Mão livre para o modo 2D, Interior para o modo 3D e Rastreamento automático e Bordas de rastreamento para opções. Use o laço para marcar as regiões de interesse.
   2. Repita essa etapa de contorno com fatias amostradas em todo o VOI (Figura 3B). As fatias contornadas podem ser espaçadas (por exemplo, separadas por 20 fatias).
      NOTA: Em regiões com estruturas de calos complexas, o usuário pode considerar diminuir o espaçamento entre fatias contornadas para capturar mais fragmentos (Figura 3A,B).
   3. Interpole os contornos dos calos contornados para criar um rótulo de calo completo (Figura 3C,D) da seguinte maneira: na janela MATERIAIS, escolha o arquivo Calo (criado na etapa 4.1.1.2.), clique na guia Seleção na parte superior da tela e selecione Interpolar no menu suspenso. Na janela SELEÇÃO, clique no sinal de mais.
   4. Abra o arquivo Cortical Bone criado na etapa 4.1.1.2. Segmentar a cortical óssea, incluindo a cavidade medular, conforme delineado para o calo nos passos 4.1.1 e 4.1.2. (Figura 4A,B). Interpolar o córtex periosteal contornado para criar um rótulo de osso cortical conforme descrito para o calo no passo 4.1.3 (Figura 4C,D).
   5. Calcule o volume contornado e o valor cinza médio do calo da seguinte maneira: clique na guia Segmentação na linha superior da tela e selecione Estatísticas do material no menu suspenso. Isso gerará uma tabela que contém todos os valores calculados. Os valores do osso cortical e do calo (após subtração do osso cortical) são fornecidos separadamente. Depois que a tabela for gerada, clique em Exportar para o Espaço de Trabalho para salvar os dados.
2. Conversão de unidades de escala de cinza em densidade mineral óssea
   1. Recorte a imagem 3D do simulador HA de 4,5 mm (Figura 2B) de toda a imagem e clique em Segmentação. A resina do simulador de AH contém cinco pequenos cilindros de AH (Figura 1A). Para o cilindro de AH que possui a maior densidade, defina o primeiro e o último fatias por inspeção visual.
   2. Desenhe dois círculos na primeira e na última fatias (evitando bordas) usando a ferramenta pincel (Figura 5A) da seguinte maneira: na janela MATERIAIS, clique em Adicionar quatro vezes. Clique com o botão direito do mouse para renomear material3, material4, material5 e material6 para phantom1, phantom2, phantom3 e phantom4, respectivamente. Selecione Phantom1, clique no ícone de pincel na janela SELECTION e use o controle deslizante para ajustar o tamanho do pincel (traçado circular) com base no tamanho do fantasma (o tamanho do círculo deve ser menor que o do fantasma).
   3. Aplique a interpolação entre os dois círculos para criar um volume para cada cilindro HA (Figura 5B) da seguinte maneira: na janela MATERIAIS, selecione Phantom1, clique na guia Seleção na linha superior da tela e selecione Interpolar no menu suspenso. Na janela SELEÇÃO, clique no sinal de mais.
   4. Repetir o processo de segmentação com três dos cilindros restantes do AH, iniciando com a segunda maior densidade de AH e terminando com a segunda menor densidade de AH (Figura 5B). O cilindro com menor densidade de AH pode ser excluído por ser frequentemente de difícil segmentação.
   5. Use as etiquetas 3D geradas para calcular os valores médios de cinza dos quatro cilindros de AH analisados. Usando uma planilha (consulte Tabela de Materiais) ou similar, plote os valores médios de cinza e os valores correspondentes de densidade mineral óssea (DMO) fornecidos pelo fabricante do simulador. Gere uma equação de correlação entre a DMO e os valores de cinza usando regressão linear.
3. Segmentação do calo mineralizado e cálculo da DMO
   1. Com base na equação de correlação gerada no passo 4.2.5 e no limiar escolhido que diferencia calos mineralizados e não mineralizados, determine o limiar de valor de cinza correspondente. Assim, rotule a área do calo com valores de cinza maiores que o limiar como calo mineralizado e rotule o restante como não mineralizado (Figura 6A,B). Neste estudo, utilizou-se 250 mgHA/ccm como limiar para calo^{mineralizado14,15}.
   2. Calcular o volume total de calos e calos mineralizados. Com base nesses valores, calcule-se a fração de volume ósseo (volume do calo mineralizado normalizado para o volume total do calo = VB/VT). Use o valor médio de cinza medido para o calo total para calcular a DMO do calo usando a equação de correlação gerada em 4.2.5.
      OBS: Com base no objetivo do estudo e no software utilizado para análise, outros parâmetros como SMI (structure model index), espessura trabecular e grau de anisotropia podem ser calculados.

Figura 3: Segmentação do limite externo do calo. (A) Contorno do limite externo do calo (linha vermelha). (B) Contornos em fatias amostradas ao longo do VOI (fatias vermelhas). (C) Uma etiqueta de calo 3D criada por interpolação (volume vermelho). (D) Uma secção transversal do rótulo do calo mostrado em C (incluindo osso cortical). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Segmentação da cortical óssea. (A) Contorno da superfície periosteal do córtex (linha verde). (B) Contornos em fatias amostradas ao longo do VOI (fatias verdes). (C) Uma etiqueta 3D do osso cortical (contendo a cavidade medular; verde) e do calo (vermelho) criada a partir de etiquetas interpoladas do córtex periosteal e do calo. (D) Secção transversal do calo (vermelho) e da cortical (contendo a cavidade intramedular; verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Conversão de unidades de escala de cinza para DMO. (A) Contornos do cilindro do AH no primeiro e no último corte (círculos vermelhos). (B) Cilindros de AH interpolados 3D (esquerda) e seções transversais (direita). Marrom: maior densidade de AH; azul: segunda maior densidade de AH; violeta: terceira maior densidade de AH; verde: quarta maior densidade de AH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Segmentação do calo mineralizado. (A) O calo mineralizado (≥250 mgHA/ccm) é mostrado em azul, o restante do calo (<250 mgHA/ccm) é mostrado em vermelho e o espaço correspondente ao osso original é mostrado em verde. (B) Uma visão 3D de cada rótulo isolado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Para monitorar a formação óssea durante a consolidação da fratura, uma fratura tibial exposta da diáfise média foi induzida em camundongos adultos machos C75BL/6J. A fratura foi estabilizada com haste intramedular, modelo estabelecido de cicatrização^{secundária13}. Os calos teciduais foram colhidos aos 14, 21 e 28 dias pós-fratura¹². Esses momentos representam diferentes fases da cicatrização. A formação óssea endocondral durante a consolidação óssea secund...

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Discussão

O objetivo deste estudo é descrever um protocolo detalhado para análise de μCT com o objetivo de quantificar com precisão a estrutura do calo mineralizado 3D, que muitas vezes é fundamental em estudos de consolidação óssea e de fraturas. O protocolo utiliza uma plataforma de software de análise de imagens 3D de uso geral que facilita a visualização, segmentação/etiquetagem e medições que variam de simples a complexas.

A tarefa mais demorada do protocolo é a segmentação semi-a...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Fisher chemical	SF100-20	Used for bone tissue fixation
Avizo	Thermo Scientific		Image processing and analysis software
Hydroxyapatite phantom	Micro-CT HA D4.5, QRM	QRM-70128
Image Processing Language	Scanco		Used to convert raw images to DICOM images
Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps	Medline		Used to remove the intramedullary pin
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
Scanco mCT system (vivaCT 40)	Scanco		Used for µCT imaging