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Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para visualização de células-tronco proliferantes na água-viva Cladonema. A hibridização in situ fluorescente de montagem completa com um marcador de células-tronco permite a detecção de células-tronco, e a marcação de 5-etil-2'-desoxiuridina permite a identificação de células em proliferação. Juntas, células-tronco em proliferação ativa podem ser detectadas.

Resumo

Os cnidários, incluindo anêmonas do mar, corais e águas-vivas, exibem morfologia e estilos de vida diversos que se manifestam em pólipos sésseis e medusas de natação livre. Como exemplificado em modelos estabelecidos, como Hydra e Nematostella, as células-tronco e/ou células proliferativas contribuem para o desenvolvimento e regeneração de pólipos cnidários. No entanto, os mecanismos celulares subjacentes na maioria das águas-vivas, particularmente no estágio de medusa, são em grande parte obscuros e, portanto, o desenvolvimento de um método robusto para identificar tipos específicos de células é crítico. Este trabalho descreve um protocolo para a visualização de células-tronco proliferantes na água-viva hidrozoária Cladonema pacificum. Cladonema medusae possuem tentáculos ramificados que crescem continuamente e mantêm a capacidade regenerativa durante toda a sua fase adulta, fornecendo uma plataforma única com a qual estudar os mecanismos celulares orquestrados por células proliferantes e / ou semelhantes a troncos. A hibridização in situ fluorescente de montagem completa (FISH) usando um marcador de células-tronco permite a detecção de células-tronco, enquanto a marcação de pulso com 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU), um marcador de fase S, permite a identificação de células em proliferação. Combinando a rotulagem FISH e EdU, podemos detectar células-tronco em proliferação ativa em animais fixos, e essa técnica pode ser amplamente aplicada a outros animais, incluindo espécies de águas-vivas não modelo.

Introdução

Cnidaria é considerado um filo de metazoários basalmente ramificado contendo animais com nervos e músculos, colocando-os em uma posição única para a compreensão da evolução do desenvolvimento e fisiologia animal 1,2. Os cnidários são categorizados em dois grupos principais: Anthozoa (por exemplo, anêmonas do mar e corais) possuem apenas larvas de plânula e estágios sésseis, enquanto Medusozoa (membros de Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa e Cubozoa) normalmente assumem a forma de medusas de natação livre, ou águas-vivas, bem como larvas de plânula e pólipos. Os cnidários comumente exibem alta capacidade regenerativa, e seus mecanismos celulares subjacentes, particularmente sua posse de células-tronco adultas e células proliferativas, têm atraído muita atenção 3,4. Inicialmente identificadas na Hydra, as células-tronco hidrozoárias estão localizadas nos espaços intersticiais entre as células epiteliais ectodérmicas e são comumente referidas como células intersticiais ou i-células3.

As células i hidrozoárias compartilham características comuns que incluem multipotência, expressão de marcadores de células-tronco amplamente conservadas (por exemplo, Nanos, Piwi, Vasa) e potencial de migração 3,5,6,7,8. Como células-tronco funcionais, as células i estão amplamente envolvidas no desenvolvimento, fisiologia e respostas ambientais de animais hidrozoários, o que atesta sua alta capacidade regenerativa e plasticidade3. Embora as células-tronco, semelhantes às células i, não tenham sido identificadas fora dos hidrozoários, mesmo na espécie modelo estabelecida Nematostella, as células proliferativas ainda estão envolvidas na manutenção e regeneração do tecido somático, bem como da linha germinativa9. Como os estudos sobre desenvolvimento e regeneração cnidária têm sido predominantemente conduzidos em animais do tipo pólipo, como Hydra, Hydractinia e Nematostella, a dinâmica celular e as funções das células-tronco em espécies de águas-vivas permanecem em grande parte sem solução.

A água-viva hidrozoária Clytia hemisphaerica , uma espécie cosmopolita de águas-vivas com diferentes habitats ao redor do mundo, incluindo o Mar Mediterrâneo e a América do Norte, tem sido utilizada como animal modelo experimental em diversos estudos evolutivos e de desenvolvimento10. Com seu tamanho pequeno, fácil manuseio e ovos grandes, o Clytia é adequado para manutenção em laboratório, bem como para a introdução de ferramentas genéticas, como os métodos de transgênese e knockout recentemente estabelecidos11, abrindo a oportunidade para uma análise detalhada dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à biologia das águas-vivas. No tentáculo de Clytia medusa, as células i estão localizadas na região proximal, chamada bulbo, e progenitores como os nematoblastos migram para a ponta distal, diferenciando-se em tipos celulares distintos, incluindo os nematócitos12.

Durante a regeneração da Clytia manubrium, órgão oral das águas-vivas, as células i Nanos1+ presentes nas gônadas migram para a região onde o manúbrio é perdido em resposta a danos e participam da regeneração do manúbrio7. Essas descobertas apoiam a ideia de que as células i em Clytia também se comportam como células-tronco funcionais que estão envolvidas na morfogênese e regeneração. No entanto, dado que as propriedades das células i diferem entre os animais representativos do tipo pólipo, como Hydra e Hydractinia3, é possível que as características e funções das células-tronco sejam diversificadas entre as espécies de águas-vivas. Além disso, com exceção de Clytia, as técnicas experimentais têm sido limitadas para outras águas-vivas, e a dinâmica detalhada das células proliferativas e células-tronco é desconhecida13.

A água-viva hidrozoária Cladonema pacificum é um organismo modelo emergente que pode ser mantido em um ambiente de laboratório sem uma bomba de água ou sistema de filtração. A Cladonema medusa possui tentáculos ramificados, característica comum na família Cladonematidae, e um órgão fotorreceptor chamado ocellus na camada ectodérmica próxima ao bulbo14. O processo de ramificação do tentáculo ocorre em um novo local de ramificação que aparece ao longo do lado adaxial do tentáculo. Com o tempo, os tentáculos continuam a se alongar e se ramificar, com os galhos mais antigos sendo empurrados para fora em direção à ponta15. Além disso, os tentáculos de Cladonema podem se regenerar dentro de alguns dias após a amputação. Estudos recentes têm sugerido o papel das células proliferantes e células-tronco na ramificação e regeneração de tentáculos em Cladonema16,17. No entanto, embora a hibridização in situ convencional (ISH) tenha sido utilizada para visualizar a expressão gênica no Cladonema, devido à sua baixa resolução, atualmente é difícil observar a dinâmica das células-tronco no nível celular em detalhes.

Este trabalho descreve um método de visualização de células-tronco em Cladonema por FISH e cocoloração com EdU, um marcador de proliferação celular18. Visualizamos o padrão de expressão de Nanos1, um marcador de células-tronco 5,17, pelo FISH, que permite a identificação da distribuição de células-tronco no nível de célula única. Além disso, a co-coloração da expressão de Nanos1 com a marcação EdU permite distinguir células-tronco em proliferação ativa. Este método para monitorar células-tronco e células proliferativas pode ser aplicado a uma ampla gama de áreas de investigação, incluindo ramificação de tentáculos, homeostase tecidual e regeneração de órgãos em Cladonema, e uma abordagem semelhante pode ser aplicada a outras espécies de águas-vivas.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.

1. Síntese da sonda

  1. Extração de RNA
    1. Coloque três medusas de Cladonema vivas que são cultivadas em água do mar artificial (ASW) em um tubo de 1,5 mL usando uma pipeta de transferência de 3,1 mL com a ponta cortada e remova o máximo de ASW possível.
      NOTA: ASW é preparado pela dissolução de uma mistura de sais minerais em água da torneira com neutralizador de cloro; a gravidade específica final (S.G.) é 1.018 ou as partes por mil (ppt) são ~27.
    2. Congele os tubos de 1,5 mL em nitrogênio líquido para inibir a atividade da RNase. Adicionar 30 μL de tampão de lise do kit de isolamento de RNA total no qual foi adicionado 2-mercaptoetanol (1 μL/100 μL de tampão de lise) e homogeneizar as amostras no tampão de lise usando um homogeneizador.
      NOTA: Para evitar o estouro do tampão e da amostra dos tubos, recomenda-se a homogeneização com uma pequena quantidade de tampão de lise.
    3. Adicionar 570 μL de tampão de lise e extrair o RNA total seguindo o protocolo do kit de isolamento de RNA total (Figura 1).
    4. Medir a concentração do ARN extraído utilizando um espectrofotómetro e conservar a -80 °C até à sua utilização.
  2. cSíntese de cDNA
    1. Usando um kit, sintetizar cDNA usando o RNA total extraído das medusas como molde (Figura 1 e Tabela 1).
    2. Incubar a 65 °C durante 5 min.
    3. Esfrie rapidamente no gelo.
    4. Efectuar a síntese de cDNA com a mistura a partir do passo 1.2.1 (Tabela 1). Misturar bem por pipetagem e incubar a 42 °C durante 60 min.
    5. Incubar a 95 °C durante 5 min.
    6. Esfrie rapidamente no gelo.
    7. Medir a concentração do cDNA sintetizado usando um espectrofotômetro e armazenar a -20 °C ou abaixo dele até o uso.
  3. Síntese do produto de PCR
    1. Para criar um modelo de PCR, projete o primer específico usando Primer-BLAST. Fonte da sequência de referência a partir de dados NCBI ou dados de RNA-seq.
      NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para os primers utilizados neste protocolo.
    2. Para amplificar a sequência alvo, execute a clonagem de TA, que não requer o uso de enzimas de restrição. Para obter um produto de PCR em que é adicionada uma adenina na extremidade 3', utilize as seguintes definições: 98 °C durante 2 min; 35 ciclos de 98 °C por 10 s, 55-60 °C por 30 s, 72 °C por 1 min. Use Taq DNA polimerase para as reações (Tabela 1).
      NOTA: Para determinar as condições de PCR, siga o protocolo que acompanha a DNA polimerase a ser usada, que geralmente fornece uma temperatura de recozimento recomendada e tempo de extensão.
    3. Execute o produto PCR através de um gel de agarose a 1% e corte a faixa de interesse. Extraia os produtos de PCR dos géis cortados usando um kit de extração de gel.
  4. Ligadura
    1. Ligue o produto da PCR ao vetor com saliências de timina 3' misturando os reagentes (Tabela 1) e incubando a 37 °C por 30 min (Figura 1).
      NOTA: A razão molecular do vetor:PCR deve ser 1:>3. O tamanho do vetor pTA2 é de aproximadamente 3 kb. Se o produto de PCR (inserção) for A (kb) e B (ng/μL), o volume da inserção (X no quadro 1) a tomar pode ser calculado por ([50 ng de vector × A kb de inserção])/(3 kb vector × [ 1/3]) = 50· Um ng de inserção. Se a concentração da inserção for B ng/μL, então o volume tomado é de 50· A/B μL de inserção.
  5. Transformação e chapeamento
    1. Para a transformação, descongele as células competentes no gelo e distribua-as em alíquotas de 20 μL cada. Adicionar 1 μL dos plasmídeos que contêm o produto de PCR (menos de 5% do volume celular competente) e vórtice por 1 s. Incubar no gelo durante 5 min, e depois incubar a 42 °C durante 45 s e vórtice durante 1 s.
    2. Adicionar 180 μL de caldo Super Optimal com meio de compressão de cataabolita (SOC) (um meio de cultura bacteriana nutricionalmente rico) às células competentes e incubar a 37 °C durante 30 minutos. Após 30 min, espalhar as células competentes sobre uma placa de ágar contendo ampicilina, 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-beta-D-galacto-piranóssido (X-gal) e isopropil-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), e incubar a 37 °C durante 12-16 h (Figura 1).
      NOTA: X-gal e IPTG são usados para selecionar colônias azuis e brancas.
  6. Cultura líquida
    1. Escolha uma colônia branca entre as colônias brancas e azuis no prato. Adicionar a 3-5 mL de meio LB com ampicilina e incubar em agitador por 12-16 h a 37 °C (Figura 1).
  7. Miniprep
    1. Extrair o plasmídeo do meio LB utilizando um miniprep plasmídico (Figura 1).
    2. Quantifique a concentração plasmídica usando um espectrofotômetro.
  8. Leia a sequência.
    1. Para ler a sequência de DNA do plasmídeo, envie o plasmídeo para o sequenciamento de Sanger e, em seguida, use um software para alinhá-lo com a sequência genoma/transcriptoma para confirmar se a sequência alvo é sintetizada adequadamente e avaliar em que direção a sequência alvo é inserida no plasmídeo (5' a 3' ou 3' a 5').
      NOTA: Se a sequência alvo for inserida no plasmídeo na direção de 5' a 3' do local de ligação da RNA polimerase perto da extremidade 3', uma sonda antisense pode ser gerada por transcrição in vitro . Se a sequência de destino for inserida na direção inversa de 3' a 5', uma sonda de detecção (controle negativo) pode ser gerada. Se estiver usando vetores como pTA2, dois sites de ligação de transcrição podem ser usados, dependendo da finalidade.
  9. Transcrição in vitro
    1. Prepare o molde de DNA a partir do plasmídeo criado realizando a reação em cadeia da polimerase usando primers fora do local de ligação da RNA polimerase (por exemplo, locais de ligação T7/T3) no plasmídeo (Figura 1).
      NOTA: Iniciadores universais como o primer avançado M13-20 e o primer reverso M13 podem ser usados para preparar um molde de DNA que inclua locais de ligação à RNA polimerase.
    2. Purifice o modelo após a amplificação por PCR usando um kit de extração de gel/PCR.
    3. Misture os reagentes mostrados abaixo e execute a reação de transcrição a 37 °C por 3 h (Figura 1 e Tabela 1).
    4. Adicionar 1,5 μL de DNase e incubar a 37 °C durante 30 min.
    5. Adicionar 10 μL de água isenta de RNase e purificar a sonda da solução de reação de transcrição usando uma coluna de limpeza.
    6. Verifique o tamanho do RNA sintetizado carregando 1 μL em um gel de agarose a 1% e determine a concentração usando um espectrofotômetro.
      NOTA: As sondas de RNA sintetizadas devem ter uma concentração de pelo menos 100 ng/μL.
    7. Adicionar 30 μL de formamida para armazenamento a uma temperatura igual ou inferior a −20 °C.

2. Incorporação e fixação de EdU

  1. Colocar Cladonema medusae (5-10 animais por tubo) em tubos de 1,5 mL usando uma pipeta de transferência de 3,5 mL e adicionar ASW até um volume total de 500 μL. Adicionar 7,5 μL de solução estoque de EdU de 10 mM e incubar as amostras por 1 h a 22 °C (Figura 2). A concentração final de EdU é de 150 μM.
    NOTA: Use medusas de 5 a 7 dias de idade para monitorar a formação do terceiro ramo (Figura 3A). O dia em que as medusas se desprendem do pólipo é contado como dia 1 e, no dia 5, as medusas normalmente começam a exibir um terceiro ramo em seus tentáculos principais.
  2. Após 1 h, remova o máximo possível de ASW contendo EdU.
  3. Para anestesiar as medusas, adicionar 7% de MgCl 2 em H2 O e incubar por5 min.
  4. Retirar o MgCl 2 a 7% em H 2 O efixar as medusas durante a noite (O.N.) a 4 °C com paraformaldeído (PFA) a 4% em ASW (Figura 2).
    NOTA: Ao executar o FISH sem incorporação de EdU, as amostras podem ser fixadas de forma semelhante àquelas tratadas com EdU após a anestesiação (etapas 2.3-2.4).

3. Hibridização in situ fluorescente

  1. Tratamento da proteinase e pós-fixação
    1. Remova o PFA e lave as amostras com PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBST) por 3 x 10 min. Use 300-500 μL de PBST por lavagem.
      NOTA: A partir desta etapa até o final da hibridização, o experimento deve ser realizado em ambiente livre de RNase, usando luvas e máscara. O PBS 1x nesta etapa deve ser feito com água tratada com DEPC. Após a hibridização, 1x PBS feitos com água sem tratamento DEPC podem ser usados. Alguns protocolos ISH e FISH desidratam as amostras usando etapas de metanol, o que torna possível salvar as amostras fixas a -20 °C até o uso. Para evitar trabalhos supérfluos, o processo de desidratação é omitido deste protocolo, particularmente porque as amostras podem ser mantidas em PBST por até alguns dias.
    2. Após a fixação, colocar a amostra em tubos de 1,5 ml sobre um agitador, com exceção da etapa de incubação do anticorpo anti-DIG-POD O.N. (etapa 3.4.2). Após a lavagem, adicionar 10 mg/ml de solução de reserva de proteinase K em PBST e incubar as medusas com proteinase K (concentração final: 10 μg/ml) a 37 °C durante 10 min.
    3. Retire a solução de proteinase K e lave as amostras durante 2 x 1 min com PBST.
    4. Para pós-fixação das medusas, adicionar 4% de PFA em 1x PBS e incubar a 37 °C por 15 min.
    5. Retire a solução de PFA e lave as amostras por 2 x 10 min com PBST.
      NOTA: Se o gene alvo for altamente expresso com baixo sinal de fundo, as etapas 3.1.2-3.1.5 podem ser ignoradas.
  2. Hibridização
    1. Remova o PBST e adicione o buffer de hibridização (buffer HB, Tabela 1). Incubar as amostras em tampão HB por 15 min à temperatura ambiente (RT). Use 300-400 μL de buffer HB, que fornece volume suficiente para uma hibridização bem-sucedida.
      NOTA: O HB Buffer, o Wash Buffer 1 e o Wash Buffer 2 são preparados com 20x estoque SSC. O HB Buffer é armazenado a uma temperatura igual ou inferior a −20 °C e deve ser levado a RT antes da utilização.
    2. Remova o buffer HB e adicione um novo buffer HB. Pré-hibridizar a 55 °C durante, pelo menos, 2 h numa incubadora de hibridização.
    3. Remova o tampão HB e incube com o tampão HB contendo as sondas que foram armazenadas na etapa 1.9.7 (concentração final da sonda: 0,5-1 ng/μL no buffer HB). Hibridizar a 55 °C por 18-24 h (Figura 2) em incubadora de hibridização.
      NOTA: A intensidade e a especificidade do sinal FISH podem variar devido à expressão gênica alvo, bem como ao comprimento e especificidade da sonda. Para aumentar a intensidade, parâmetros como duração da hibridização (18-72 h) e temperatura (50-65 °C) podem ser ajustados e diferentes sondas podem ser testadas. Para evitar sinais inespecíficos, o tratamento com proteinase K (concentração e duração) pode ser modificado19.
  3. Remoção da sonda
    1. Remova o buffer HB que contém as sondas e, em seguida, adicione o buffer de lavagem 1 (Tabela 1). Lavar as amostras com tampão de lavagem 1 durante 2 x 15 min a 55 °C. Use 300-400 μL de tampão de lavagem.
      NOTA: HB Buffer contendo sondas pode ser usado repetidamente, até cerca de dez vezes. Em vez de descartar, armazene o HB Buffer usado contendo sondas a -20 °C ou abaixo. Pré-aqueça o buffer de lavagem 1, o buffer de lavagem 2, 2x SSC e PBST a 55 °C antes do uso.
    2. Remova o Buffer de Lavagem 1 e, em seguida, adicione o Buffer de Lavagem 2 (Tabela 1). Lavar as amostras com tampão de lavagem 2 durante 2 x 15 min a 55 °C.
    3. Remova o Wash Buffer 2 e adicione 2x SSC. Lavar as amostras com 2x SSC durante 2 x 15 min a 55 °C.
    4. Remova 2x SSC e adicione PBST pré-aquecido. Lave as amostras por 1 x 15 min com PBST no RT.
  4. Incubação de anticorpos anti-DIG
    1. Remova o PBST e adicione 1% de buffer de bloqueio. Incubar as amostras durante, pelo menos, 1 h a RT enquanto agita lentamente sobre um balancim.
      NOTA: Preparar o tampão de bloqueio de 1% na hora, diluindo 5% do depósito regulador de bloqueio (Tabela 1). Verifique as amostras antes da próxima reação de anticorpos, porque a amostra tende a grudar na parte de trás da tampa ou na parede como resultado da agitação.
    2. Após o bloqueio, remova o tampão de bloqueio a 1%, adicione a solução anti-DIG-POD (1:500, em tampão de bloqueio a 1%) e incube as amostras O.N. a 4 °C (Figura 2).
      NOTA: Tenha cuidado para manter o tempo de incubação dentro de 12-16 h para evitar a detecção de sinais não específicos.
  5. Detecção de sonda marcada com DIG
    1. Remova a solução anti-DIG-POD e adicione Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, Tabela 1). Lave as amostras com TNT por 3 x 10 min no RT.
      NOTA: O uso da técnica de amplificação de sinal de tiramida (TSA) fornece uma imagem de melhor resolução contra reagentes marcados com peroxidase de rábano (por exemplo, anti-DIG-POD).
    2. Diluir a solução-mãe de tiramida conjugada com corante fluorescente (Cy5-tiramida) (1:50) no tampão diluente de amplificação para formar a solução activa de Cy5-tiramida (Figura 2).
    3. Remova o máximo de TNT possível e, em seguida, adicione a solução ativa de Cy5-tiramida. Incubar as amostras por 10 min no escuro.
    4. Lave as amostras com PBST por 3 x 10 min no escuro.
  6. Detecção de EdU
    NOTA: O kit EdU detecta EdU incorporados como sinais fluorescentes (Figura 2).
    1. Para preparar o coquetel de detecção de EdU, misture os componentes conforme mostrado na Tabela 1. Use 100 μL de coquetel de detecção de EdU para cada amostra.
      NOTA: Prepare o aditivo 1x Reaction Buffer diluindo o aditivo 10x Reaction Buffer com água ultrapura.
    2. Remova o PBST e adicione o coquetel de detecção de EdU. Incubar no escuro por 30 min.
    3. Lave com PBST por 3 x 10 min no escuro.
  7. Coloração de DNA
    1. Diluir a Hoechst 33342 (1:500) em PBST para preparar a solução Hoechst. Remova o PBST e, em seguida, adicione a solução Hoechst. Incubar as amostras por 30 min no escuro (Figura 2).
    2. Lave as amostras com PBST por 3-4 x 10 min no escuro.
  8. Montagem
    1. Faça um banco na lâmina de vidro para evitar que a amostra seja esmagada. Aplique fita de vinil na lâmina de vidro e esvazie o centro.
    2. Transfira as medusas para o banco no vidro deslizante usando uma pipeta de transferência de 3,1 mL com a ponta cortada.
      NOTA: Tenha cuidado para não deixar os tentáculos se sobreporem.
    3. Remova qualquer PBST com uma pipeta P200 e, em seguida, adicione lentamente 70% de glicerol como meio de montagem (Figura 2).
      NOTA: Em vez de glicerol a 70%, o meio de montagem antidesbotamento pode ser usado para evitar que a fluorescência desbote.
    4. Coloque suavemente uma tampa na medusa com pinça e sele o lado da tampa com esmalte claro.
    5. Manter as lâminas a 4 °C no escuro se não efectuar imediatamente a observação microscópica.
  9. Imagiologia
    1. Use um microscópio confocal de varredura a laser para adquirir imagens. Para uma resolução de célula única, use uma lente de óleo 40x ou uma lente para maior ampliação.
    2. Após a aquisição da imagem, abra as imagens usando o software ImageJ/FIJI e conte as células positivas para EdU+ e/ou Nanos1+ pela ferramenta multiponto20.

Resultados

Os tentáculos de Cladonema têm sido utilizados como modelo para estudar os processos celulares de morfogênese e regeneração15,16,17. A estrutura do tentáculo é composta por um tubo epitelial onde as células-tronco, ou células i, estão localizadas na região proximal, denominada bulbo tentáculo, e novos ramos são adicionados sequencialmente à parte posterior da região distal do bulbo ao longo do lado adaxia...

Discussão

Células proliferantes e células-tronco são importantes fontes celulares em diversos processos, como morfogênese, crescimento e regeneração21,22. Este trabalho descreve um método de cocoloração do marcador de células-tronco Nanos1 por marcação FISH e EdU em Cladonema medusae. Trabalhos anteriores utilizando a marcação EdU ou BrdU sugeriram que as células proliferativas se localizam nos bulbos dos tentáculos16,17<...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela AMED sob o número de concessão JP22gm6110025 (para Y.N.) e pelo JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (para Y.N.).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol Wako137-06862
3.1 mL transfer pipetteThermo Scientific233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Wako029-15043
anti-DIG-PODRoche11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dyeInvitrogen C10337EdU kit
Coroline offGEX Co. ltdN/Achlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking ReagentRoche11175041910blocking buffer 
DIG RNA labeling mix Roche11277073910
DTT PromegaP117B
ECOS competent cell DH5αNIPPON GENE316-06233competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kitFast geneFG-91302gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kitFast geneFG-90502plasmid miniprep
FormamideWako 068-00426
Heparin sodium salt from porcineSIGMA-ALDRICH H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)Wako096-05143
LB AgarInvitrogen22700-025agar plate
LB Broth BaseInvitrogen12780-052LB medium
Maleic acidWako134-00495
mini Quick spin RNA columnsRoche11814427001clean-up column
NaClWako 191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-FiThermo ScientificND-ONEC-Wspectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)Wako 166-21115
PowerMasher 2nippi 891300homogenizer
Proteinase KNacarai Tesque 29442-14
RNase InhibitorTaKaRa2313A
RNeasy Mini kitQiagen 74004total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free DnasePromegaM6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)TaKaRaT9172
SEA LIFEMarin TechN/Amixture of mineral salts
T3 RNA polymerase Roche11031163001
T7 RNA polymerase Roche10881767001
TAITEC HB-100TAITEC0040534-000Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq TaKaRaRR001ATaq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis KitTaKaRa6210AcDNA synthesis kit
Target CloneTOYOBO TAK101pTA2 Vector
tRNARoche10109541001
TSA Plus Cyanine 5AKOYA BiosciencesNEL745001KTtyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880ZEISSN/Alaser scanning confocal microscope

Referências

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L., Boutet, A., Shierwater, B. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

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