Condições experimentais modificadas para perda auditiva induzida por ruído em camundongos e avaliação da função auditiva e lesão das células ciliadas externas

Resumo

Apresentamos um protocolo para um modelo de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) em camundongos. Para induzir a PAIR, desenvolvemos um dispositivo novo e simples usando plástico corrugado, uma gaiola armadilha para ratos e um alto-falante. O potencial evocado auditivo de tronco encefálico e a imagem de imunofluorescência foram empregados para avaliar a função auditiva e o dano às células ciliadas externas, respectivamente.

Resumo

Um modelo animal de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) é útil para patologistas, terapeutas, farmacologistas e pesquisadores da audição entenderem completamente o mecanismo da PAIR e, posteriormente, otimizarem as estratégias de tratamento correspondentes. Este estudo tem como objetivo criar um protocolo aprimorado para o desenvolvimento de um modelo de PAIR em camundongos. Camundongos C57BL/6J machos foram utilizados neste estudo. Camundongos não anestesiados foram expostos a ruídos intensos (1 e 6 kHz, apresentados simultaneamente a 115-125 dB NPS-A) continuamente por 6 h por dia durante 5 dias consecutivos. A função auditiva foi avaliada 1 dia e 1 semana após a exposição ao ruído, por meio do potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE). Após a medida do PEATE, os camundongos foram sacrificados e seus órgãos de Corti foram coletados para coloração por imunofluorescência. A partir das medidas do potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE), observou-se perda auditiva significativa 1 dia após a exposição ao ruído. Após 1 semana, os limiares auditivos dos camundongos experimentais diminuíram para ~80 dB NPS, que ainda era um nível significativamente maior do que os camundongos controles (~40 dB NPS). A partir dos resultados da imagem de imunofluorescência, as células ciliadas externas (CCE) mostraram-se danificadas. Em resumo, criamos um modelo de PAIR usando camundongos machos C57BL/6J. Um novo e simples dispositivo para gerar e fornecer ruído de tom puro foi desenvolvido e então empregado. As medidas quantitativas dos limiares auditivos e a confirmação morfológica do dano das CCE demonstraram que o ruído aplicado induziu com sucesso uma perda auditiva esperada.

Introdução

Cerca de 1,3 bilhão de pessoas no mundo sofrem de perda auditiva devido à exposição ao ruído¹. O objetivo deste estudo foi estabelecer um passo a passo claro para a indução e confirmação da perda auditiva induzida por ruído (PAIR). A PAIR resulta de degeneração/destruição das células ciliadas (HCs) e neurônios do gânglio espiral (SGNs), dano nos estereocílios do HC e/ou perda de sinapses entre os HCs internos da cóclea e os SGNs. Tais anormalidades também podem causar zumbido e prejuízo na percepção da fala (principalmente em ambientes acústicos complexos), além da PAIR. As funções sociais, psicológicas e cognitivas podem ser afetadas sequencialmente por essas deficiências fisiológicas 2,3,4,5,6.

Em estudos pré-clínicos relacionados à PAIR baseados em camundongos, as linhagens de camundongos mais populares são CBA/CaJ 2,3,6,7 e C57BL/^{6 4,5,8}. Além disso, os camundongos^machos 3,4,7 são mais comumente utilizados do que as fêmeas^, pois o estrógeno tem um efeito protetor sobre a audição. Portanto, neste estudo foram utilizados apenas camundongos machos⁹. Após consulta à literatura, optou-se por 1 kHz e 6 kHz como as frequências do ruído aplicado. A intensidade do ruído aplicado foi de 115 dB NPS-A (ao redor da gaiola) a 125 dB NPS-A (no centro da gaiola). Após a exposição contínua dos camundongos experimentais ao ruído por 6 h por dia, durante 5 dias consecutivos, um ótimo aumento no limiar auditivo indicou que uma ótima extensão de PAIR foi gerada nos camundongos experimentais. As operações para o manuseio dos animais, construção do arranjo experimental e indução de ruído estão claramente descritas passo a passo no protocolo fornecido.

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Protocolo

Os experimentos em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Mackay Medical College. Camundongos C57BL/6J machos com oito semanas de idade foram comprados do National Laboratory Animal Center (Nova Taipei, Taiwan). Todos os camundongos foram criados e alojados de acordo com o protocolo animal padrão.

1. Indução de PAIR em camundongos

1. Preparar a gaiola para os ratos experimentais
   1. Para isso, use uma gaiola armadilha para ratos com dimensões de 14 cm × 17 cm × 24 cm. Corte quatro pedaços de papelão ondulado em tamanhos adequados, fazendo-os caber na gaiola (13 cm × 23 cm e 13 cm × 16 cm).
   2. Para evitar que os ratos sejam cortados pela grade de malha, coloque duas das peças na parte inferior e na parte de trás, respectivamente. Coloque as outras duas peças perpendicularmente interligadas uma com a outra, para dividir o espaço dentro da gaiola em quartos.
2. Realizar este estudo em uma caixa à prova de som. Coloque um alto-falante de 8,5 cm na frente da gaiola e coloque o alto-falante e a gaiola em uma caixa à prova de som.
3. Abra o software de aplicativo CLIO
4. Mova o cursor para o ícone do alto-falante e clique em TwoSin. Digite e altere o valor de Freq 1 para 1000 Hz, Freq 2 para 6000 Hz, e clique em OK para começar a reproduzir o som.
5. Na guia Leq, altere dBV para dBSPL. Depois de definir a hora na interface do software, clique no botão triângulo verde para reproduzir o som.
6. Coloque um microfone na frente do alto-falante a uma distância de 8,5 cm para calibrar o nível de ruído (consulte Arquivo Suplementar 1). Ajuste o nível de ruído para 125 dB SPL-A e monitore continuamente por pelo menos 3 minutos para garantir que o nível de ruído seja suficientemente estável. Use um gerador, um analisador e um amplificador para criar e controlar o ruído. (Gráfico 1)
   NOTA: Faça esta etapa em uma caixa à prova de som para evitar danos à audição do operador.
7. Coloque quatro camundongos C57BL/6J machos na gaiola (um para cada quarto) para exposição ao ruído. Atribua aleatoriamente os ratos em cada trimestre durante a exposição ao ruído. Coloque um microfone na parte superior da gaiola para monitorar o nível de ruído durante a exposição ao ruído (Figura 2).
   NOTA: Faça esta etapa em uma caixa à prova de som para evitar danos à audição do operador.
8. Expor os ratos ao ruído nas frequências de 1 kHz e 6 kHz continuamente durante 6 h por dia, durante 5 dias consecutivos.
9. Medir os limiares auditivos dos camundongos 1 dia após a exposição ao ruído (ou seja, no^6º dia) medindo o PEATE. Após a aferição do PEATE, sacrificar todos os camundongos envolvidos e colher suas cócleas (Figura 3).

2. Avaliação dos limiares auditivos de tronco encefálico (PEATE)

1. Utilizar um sistema comercial de teste ABR projetado especificamente para pequenos animais¹⁰.
2. Injetar intraperitonealmente uma mistura de tiletamina e zolazepam (40 mg/kg) e xilazina (9,3 mg/kg) nos camundongos para anestesia geral.
   NOTA: A avaliação do PEATE leva ~2 h. Certifique-se de fornecer suporte térmico através de uma almofada de aquecimento e aplique pomada ocular para evitar o ressecamento enquanto o mouse estiver sob anestesia.
3. Medir o PEATE no camundongo sob anestesia geral. Coloque eletrodos de agulha subdérmica (12 mm) no vértice, atrás do pavilhão auricular da orelha esquerda e de volta perto da cauda para medir o limiar auditivo.
4. Apresentar estímulos acústicos utilizando uma caixa acústica posicionada a 1 cm da orelha esquerda do animal.
5. Use um osciloscópio para controlar os estímulos acústicos. Escolha Onda Sine para os estímulos e 10k para a escala de janela. Gire o botão Frequência para obter a frequência desejada dos estímulos acústicos.
6. Ajuste a intensidade do estímulo girando o botão AMLP no gerador de funções. Obter a intensidade de estímulo desejada girando o botão AMLP para uma tensão adequada, calculada a partir da calibração.
7. Coletar as medidas do PEATE sob uma série de intensidades de estímulo, de 10 dB NPS a 100 dB NPS, com tamanho de passo de 10 dB.
   NOTA: Meça o limiar auditivo em uma caixa à prova de som. O nível mínimo de intensidade do estímulo que poderia dar origem a uma onda V discernível no sinal coletado foi assumido como sendo o limiar do PEATE^10,11 (Figura 4). Após a avaliação do PEATE, monitorar o animal até que ele se recupere da anestesia (~1 h).

3. Exame microscópico

1. Fixação do tecido colhido
   1. Após as medidas do PEATE, sacrificar o camundongo injetando intraperitonealmente uma mistura de tiletamina e zolazepam (100 mg/kg) e xilazina (23,25 mg/kg) para o exame microscópico.
   2. Colher as cócleas do camundongo e mergulhá-las imediatamente em formaldeído (AF) a 10% para fixação (duas cócleas/mL) por pelo menos 8 h a 4 °C.
   3. Após a fixação, substituir a solução de AG por uma solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 10% para descalcificação durante 3-4 dias a 4 °C. Em seguida, verifique cada cóclea com uma pinça para confirmar se as cócleas estão suficientemente amolecidas.
   4. Coloque as cócleas em uma placa de Petri preenchida com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e corte o órgão espiral de Corti (OC) (cada cóclea descalcificada) em três seções - giro basal, giro médio e giro apical - para coloração tecidual.
   5. Sob microscópio dissecante (aumento: 8x-35x), remova as estruturas ósseas (escala vestibular, escala timpânica e modíolo) das cócleas descalcificadas e obtenha os tecidos moles, incluindo o CO (espessura: cerca de 40 μm).
2. Coloração por imunofluorescência da cóclea
   1. Preparação do tampão de bloqueio: Preparar soluções de albumina de soro bovino (BSA) a 2% e Triton X-100 a 0,2% em PBS.
   2. Transfira o tecido a ser corado da placa de Petri para um tubo de microcentrífuga e mergulhe o tecido em 0,1 mL do tampão de bloqueio por 2 h à temperatura ambiente (TR).
   3. Preparação do tampão de anticorpos primários Myo7A: Diluir o anticorpo primário Myo7A no tampão de bloqueio a uma proporção de volume de 1:200.
   4. Tratar o tecido no tubo de microcentrífuga com 100 μL de tampão primário de anticorpos Myo7A durante 2 h na RT.
   5. Enxaguar o tecido três vezes em PBS por 5 min cada.
   6. Preparação do anticorpo secundário Myo7A (Myo7A-Rb-488) e do anticorpo faloidina (faloidina-594): Anticorpo secundário Myo7A diluído (1:400) e anticorpo faloidina (1:200) no tampão de bloqueio.
   7. Tratar o tecido com 100 μL de anticorpo secundário Myo7A e tampão de anticorpos faloidínicos por 2 h na RT.
   8. Após o tratamento com anticorpos + anticorpos contra faloidina, enxaguar o tecido em PBS três vezes, por 5 min cada.
   9. Transfira o tecido enxaguado do tubo de microcentrífuga para uma placa de Petri preenchida com PBS usando uma pipeta de transferência plástica de 1 mL com uma ponta de corte.
   10. Para se preparar para o exame microscópico, desdobre o tecido, coloque-o em uma lâmina de vidro e adicione 15 μL de meio fluoromount 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) no tecido para cobri-lo completamente. Coloque uma tampa de vidro suavemente sobre o tecido. Deixe a lâmina durante a noite no RT antes de selá-la com esmalte.
3. Aquisição de imagens
   1. Adquira imagens 2D usando um microscópio de fluorescência vertical e um software de aquisição de imagens.
   2. Antes de realizar o exame microscópico, centralize o tecido no campo de visão e ajuste a sensibilidade para ISO 100. Ajuste o tempo de exposição inicialmente clicando no botão Modo Automático do software e, em seguida, ajuste manualmente clicando no botão Ajustar para otimizar a relação sinal-ruído.
   3. Ajuste o comprimento de onda da luz incidente para excitar os fluoróforos girando o cubo de fluorescência. Pseudocores foram utilizadas para marcar a emissão de diferentes rótulos fluorescentes (luz azul: DAPI; luz verde: Myo7A; luz vermelha: faloidina).
   4. Ao escanear a amostra de tecido, gere e colete os dados de imagem como .tif e .jpg arquivos de imagem.

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Resultados

Alteração do limiar auditivo do PEATE
O limiar auditivo dos camundongos foi medido por meio do PEATE ton-burst 1 dia ou 1 semana após a exposição ao ruído. Observou-se aumento significativo do limiar auditivo nas três frequências testadas (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB NPS; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB NPS; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB NPS) 1 dia após a exposição ao ruído (ou seja, o 6º^dia). A recuperação parcial da audição ocorreu 1 semana após a exposição ao ruído (ou seja, o

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Discussão

A PAIR pode ser dividida em dois tipos: a PAIR temporária, que mostra um desvio temporal do limiar auditivo, e a PAIR permanente, que é caracterizada por uma mudança permanente do limiar auditivo. Acredita-se que a perda auditiva observada no^6º dia (1 dia após a exposição ao ruído) seja uma combinação destes dois tipos. Neste caso, o limiar auditivo apresentaria uma recuperação gradual ao longo do tempo devido ao componente temporal da perda auditiva. Em nossos estudos experimentais preliminares, o...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set	GRAS	428158	For noise exposure
Amplifier Input Module, AMI100D	BIOPAC		For auditory brainstem response
Bio-amplifier, BIO100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A9647	Immunofluorescence staining
Cellsens software	Olympus life science		Image acquisition
Corrugated plastic
DAPI fluoromount	SouthernBiotech	0100-20	Immunofluorescence staining
Ethylenediaminetetraacetic acid	SIGMA	E5134	Decalcification
Evoked Response Amplifier, ERS100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Formaldehyde	APLHA	F030410	Fixation of cochlear
High Performance Data Acquisition System, MP160	BIOPAC		For auditory brainstem response
Modular Extension Cable, MEC110C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Myo7A primary antibody	Proteus	25-6790	Immunofluorescence staining
Myo7A secondary antibody	Jackson immunoresearch	711-545-152	Immunofluorescence staining
Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452	BIOPAC		For auditory brainstem response
phalloidin antibody	Alexa Fluor	A12381	Immunofluorescence staining
phosphate-buffered saline	SIGMA	P4417
Rat trap cage			14 cm x 17 cm x 24cm
ROMPUN- xylazine injection, solution	Bayer HealthCare, LLC
Sound amplifier, MT-1000	unika		For noise exposure
Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02	CLIO	620300719	For noise exposure
Soundproof chamber	IEA Electro-Acoustic Technology		For noise exposure and ABR
Speaker	IEA Electro-Acoustic Technology		For noise exposure
Stimulator Module, STM100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Triton X-100	SIGMA	T8787	Immunofluorescence staining
Tubephone Set, OUT101	BIOPAC		For auditory brainstem response
Upright Microscope, BX53	Olympus		Image acquisition
Zoletil	Virbac