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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo apresenta a síntese de peptídeos cíclicos via bisalquilação entre cisteína e metionina e a reação fácil tiol-yne desencadeada pelo centro de propargil sulfônio.

Resumo

Nos últimos anos, os peptídeos cíclicos têm atraído cada vez mais atenção no campo da descoberta de medicamentos devido às suas excelentes atividades biológicas e, como consequência, agora são usados clinicamente. É, portanto, fundamental buscar estratégias eficazes para sintetizar peptídeos cíclicos para promover sua aplicação no campo da descoberta de medicamentos. Este artigo relata um protocolo detalhado para a síntese eficiente de peptídeos cíclicos usando on-resina ou bisalquilação intramolecular (intermolecular). Usando este protocolo, os peptídeos lineares foram sintetizados aproveitando a síntese de peptídeos de fase sólida com cisteína (Cys) e metionina (Met) acoplados simultaneamente na resina. Além disso, peptídeos cíclicos foram sintetizados via bisalquilação entre Met e Cys usando uma corda ajustável e um centro de sulfônio on-tether. Toda a rota sintética pode ser dividida em três processos principais: a desproteção de Cys na resina, o acoplamento do ligador e a ciclização entre Cys e Met em uma solução de clivagem de ácido trifluoroacético (TFA). Além disso, inspirado pela reatividade do centro de sulfônio, um grupo propargilo foi anexado ao Met para desencadear a adição de tiol-yne e formar um peptídeo cíclico. Em seguida, os peptídeos brutos foram secos e dissolvidos em acetonitrila, separados e, em seguida, purificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O peso molecular do peptídeo cíclico foi confirmado por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), e a estabilidade da combinação do peptídeo cíclico com o redutor foi confirmada ainda mais usando HPLC. Além disso, o deslocamento químico no peptídeo cíclico foi analisado porespectros de ressonância magnética nuclear (RMN1 H) 1 H. No geral, este protocolo teve como objetivo estabelecer uma estratégia eficaz para sintetizar peptídeos cíclicos.

Introdução

As interações proteína-proteína (IBPs)1 desempenham um papel fundamental na pesquisa e desenvolvimento de medicamentos. A construção de peptídeos estabilizados com conformação fixa por meios químicos é um dos métodos mais importantes para o desenvolvimento de motivos miméticos de IBPs2. Até o momento, vários peptídeos cíclicos que têm como alvo os IBPs foram desenvolvidos para uso clínico3. A maioria dos peptídeos é restrita a uma conformação α-hélice para diminuir a entropia conformacional e melhorar a estabilidade metabólica, a afinidade de ligação ao alvo e a permeabilidade celular 4,5. Nas últimas 2 décadas, as cadeias laterais de Cys 6,7, lisina8,9, triptofano 10, arginina 11 e Met12,13 foram inseridas em aminoácidos não naturais para fixar o peptídeo em uma conformação cíclica. Tais peptídeos cíclicos podem atingir um espaço químico único ou locais especiais, desencadeando assim uma reação covalente para formar ligação covalente proteína-peptídeo14,15,16,17. Em recente relato de Yu et al., uma cloroacetamida foi ancorada no domínio dos ligantes peptídicos, garantindo uma reação de conjugação covalente com excelente especificidade proteica18. Além disso, ogivas eletrofílicas, como acrilamida e fluoreto de arila sulfonila (ArSO2F), foram incorporadas em peptídeos por Walensky et al.19 para formar inibidores covalentes peptídicos estabilizados e melhorar o efeito antitumoral dos inibidores peptídicos. Portanto, é muito importante introduzir um grupo funcional adicional para modificar covalentemente os ligantes proteína-peptídeo20. Esses grupos não apenas reagem com proteínas na cadeia lateral, mas também estabilizam a estrutura secundária do peptídeo21. No entanto, a aplicação de proteínas modificadas covalentemente induzidas por ligantes peptídicos é limitada devido à complicada rota sintética e à ligação inespecífica dos grupos químicos22,23. Estratégias eficazes para a síntese de peptídeos cíclicos são, portanto, urgentemente necessárias.

Inspirado nas múltiplas estratégias de peptídeos cíclicos 2,24,25,26, este protocolo tenta desenvolver um método simples e eficiente para estabilizar peptídeos. Além disso, observamos que o grupo de cadeia lateral de um peptídeo estável poderia reagir covalentemente com uma proteína-alvo quando estivesse espacialmente perto dos ligantes peptídicos. A falta de Met quimicamente modificado foi preenchida pelo grupo de Deming em 2013, desenvolvendo um novo método para a produção de metionina peptídica seletivamente modificada27. Com base nesse pano de fundo, os Shi et al. se concentraram no desenvolvimento do fechamento do anel de cadeias laterais para formar um centro de sal de sulfônio. Quando o ligante peptídico se combina com a proteína alvo, o grupo sal sulfônio reage covalentemente com a proteína Cys espacialmente próxima. Nos últimos anos, os Shi et al. projetaram um novo método para estabilizar o peptídeo cíclico28. O sal de sulfônio no peptídeo cíclico foi reduzido por um agente redutor com um grupo sulfidrila que foi reversivelmente reduzido a Met. No entanto, a reação teve baixa eficiência, o que foi prejudicial para estudos subsequentes de aplicação biológica. No presente estudo, uma reação de fechamento em anel de brometo de propargila-Cys foi projetada, com um único sal de sulfônio permanecendo na cadeia lateral do peptídeo cíclico. O sal de sulfônio atuou como uma nova ogiva que reagiu covalentemente com a proteína Cys sob proximidade espacial. Resumidamente, um peptídeo mutado Cys e Met foi ciclizado por alquilação intramolecular, resultando na geração de um centro de sulfônio on-tether. Nesse processo, a formação de uma ponte de cadeia lateral foi fundamental para os peptídeos cíclicos. No geral, este protocolo descreve uma ciclização peptídica detalhada à base de sulfônio que é alcançada usando condições e operações de reação simples. O objectivo é desenvolver um método potencial para novas aplicações biológicas mais amplas.

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Protocolo

1. Preparação do equipamento

CUIDADO: Morfolina, N,N-dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), TFA, morfolina, piperidina, éter dietílico e metanol são tóxicos, voláteis e corrosivos. Estes reagentes podem prejudicar o corpo humano através da inalação, ingestão ou contato com a pele. Para todos os experimentos químicos, use equipamentos de proteção, incluindo luvas descartáveis, casacos experimentais e óculos de proteção.

  1. Construa todos os substratos peptídicos em resina Rink-amida 4-metilbenzidrilamina (MBHA) por meio da síntese manual padrão de peptídeos de fase sólida (SPPS)29, como mostra a Figura 1.
  2. Use qualquer uma das duas opções para a construção de peptídeos lineares: um, sintetizar o peptídeo utilizando o agente condensador 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N, N',N'-hexafluorofosfato de tetrametilurônio (HATU) e um reagente de DIPEA; ou dois, sintetizar utilizando 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) e N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) como reagente de condensação de amida. Selecione um protocolo apropriado para a síntese de peptídeos de acordo com a sequência do peptídeo.
  3. Para estabelecer um dispositivo manual de síntese de peptídeos, configure o equipamento de extração de fase sólida a vácuo modificado em um exaustor e conecte-o a uma torneira de três vias. Em seguida, coloque um cartucho de filtro de polipropileno ou reator de vidro no equipamento enquanto conectado ao gás nitrogênio (N2).
    NOTA: Para modificar o equipamento de extração em fase sólida a vácuo, remova o tubo de extração e mantenha o sistema selado a vácuo.
  4. Carregue a resina MBHA nas colunas cheias de resina e dissolvê-la em DMF. Ajuste o interruptor das torneiras de três vias para borbulhar N2 e, em seguida, remova o solvente na coluna usando uma bomba de trabalho conectada a um sistema de vácuo. Calcule a quantidade de aminoácidos ou agente condensador necessária utilizando a seguinte fórmula:
    Aminoácido (g) e agente condensador (g) = balança de resina (g) × capacidade de carga de resin×a (mM/g) equivalente (5 eq) × massa molecular (g/M)
    NOTA: Escolha a quantidade de resina carregada de acordo com o comprimento do peptídeo de acoplamento. Múltiplos equivalentes (eq) de aminoácidos são usados para reagir mais plenamente. Os solventes líquidos precisam ser convertidos em volume por densidade. O 5 eq mostra que a quantidade de entrada do composto calculado é amplificada por um fator de cinco.

2. Preparação da resina

NOTA: Escolha a quantidade de resina carregada de acordo com o comprimento do peptídeo de acoplamento.

  1. Pesar 302 mg de resina MBHA de rim-amida (0,331 mM/g carregada) numa coluna (reservatório de 20 ml). Adicione 5-10 mL de DCM ou DMF na coluna para inchar a resina sob N2 borbulhando por 30 min.
  2. Em seguida, feche o interruptor N2 e, em seguida, ligue o interruptor de sucção da bomba de vácuo para remover o solvente. Em seguida, lave as resinas sequencialmente com DCM (5-10 mL) e DMF (5-10 mL) 5x.

3. Desproteção do Fmoc N-terminal

NOTA: A desproteção por morfolina requer 30 min, e a desproteção por piperidina leva 5 min.

  1. Preparar a solução de desproteção N-terminal 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc): preparar um volume suficiente (500 mL) de 20% (v/v) de piperidina ou 50% (v/v) de morfolina em DMF em um recipiente de vidro para desproteção do grupo Fmoc.
  2. Adicione 10 mL da solução de desproteção à coluna, borbulhe N2 na solução por 30 min ou 5 min 2x e repita os procedimentos de desproteção 2x.
  3. Drene a solução por uma bomba de vácuo e lave a resina sequencialmente com DCM (5-10 mL) e DMF (5-10 mL) 5x.
  4. Detectar a resina como uma solução de cor amarela escura por ninidrina a 5% (teste Kaiser) após cada desproteção para confirmar a ausência do grupo Fmoc antes da etapa de acoplamento. Em detalhe, adicione 1 mL de DMF a uma pequena quantidade de resina e adicione 200 μL de nidrina a 5% a um tubo de vidro aquecido a 130 °C por 3 min para avaliar as mudanças na cor da resina.
  5. Drene a solução por uma bomba de vácuo e lave a resina sequencialmente com DCM (5-10 mL) e DMF (5-10 mL) 5x.

4. Acoplamento do peptídeo linear (Figura 2)

NOTA: Quando as sequências peptídicas sintéticas contêm duas ou mais unidades de repetição, o procedimento de acoplamento pode ser realizado diretamente selecionando o tipo de aminoácido, como Fmoc-AA-OH ou Fmoc-AAA-OH, e assim por diante. Alguns aminoácidos especiais com obstáculo estérico e peptídeos com sequências de aminoácidos mais longas são necessários para estender adequadamente o tempo de reação para acoplamento.

  1. Para uma única etapa de acoplamento, tome o acoplamento do resíduo de Cys como exemplo (sintetize escamas de resina de 300 mg). Preparar uma solução de mistura incluindo Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) e HATU (5 eq, 206 mg) ou Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) e HOBT (5 eq, 106 mg) num tubo de polipropileno e dissolvê-la em 3 ml de DMF.
  2. Adicionar 173 μL de DIPEA (10 eq) ou 154 μL de DIC (10 eq) à solução de Cys para ativar o aminoácido. Deixe a mistura pré-activar durante 1 min. Adicione a mistura à coluna com resina e borbulhe com N 2 por2 h.
    NOTA: O tempo de reação específico necessário deve ser padronizado para detectar ninidrina a 5%.
  3. Após o acoplamento, adicionar 1 mL de DMF a uma pequena quantidade de resina e adicionar 200 μL de nidrina a 5% a um tubo de vidro aquecido a 130 °C por 3 min. Observe a mudança da resina para incolor para confirmar a ausência de um grupo amino livre antes da etapa de desproteção.
  4. Escorra a solução usando uma bomba de vácuo e lave a resina sequencialmente com DCM (5-10 mL) e DMF (5-10 mL) 5x.
  5. Adicione 10 mL da solução de desproteção à coluna, borbulhe com N2 por 30 min ou 5 min 2x, adicione a solução fresca e repita os procedimentos de desproteção 2x.
  6. Repita os seguintes passos: desproteção do grupo Fmoc; detecção de desproteção de resina; lavar a resina; acoplamento do aminoácido; detectando a reação de acoplamento. Repita a etapa de acoplamento até que todos os peptídeos sejam sintetizados.
    NOTA: Use o teste Kaiser para monitorar se cada etapa da desproteção está completa ou se cada etapa do acoplamento de aminoácidos é completa. Alternativamente, uma pequena quantidade de peptídeo pode ser clivada da resina e verificada pelo LC-MS para acoplamento bem-sucedido.

5. Bisalquilação entre Met e Cys (Figura 3)

  1. Construa um peptídeo linear com Met e Cys repetindo os passos 4.1-4.6. Adicionar 10 mL de metanol anidro à coluna com resina para desidratação e secar com N2 para o próximo uso (repetir 2x) após acoplamento peptídico linear.
  2. Pesar 100 mg da resina obtida na etapa anterior em uma coluna (reservatório de 20 mL) e lavar a resina com DCM (5-10 mL) e DMF (5-10 mL) antes da etapa de acoplamento.
  3. Preparar uma solução para remover o grupo de proteção Cys trt (tritil). Preparar um volume suficiente (100 ml) de mistura TFA/TIS/DCM (3:5:92) num recipiente de vidro para remover o grupo protectiove.
  4. Adicionar 5-10 ml da solução de TFA/TIS/DCM (3:5:92) à coluna para remover o grupo de protecção durante 10 minutos. Repita seis vezes com N2 borbulhando até que a cor amarela desapareça completamente.
  5. Drene a solução por uma bomba de vácuo e lave a resina sequencialmente com DCM (5-10 mL) e DMF (5-10 mL) 5x.
  6. Prepare uma solução para reagir com Cys desprotegido. Preparar um volume suficiente (50 ml) de solução de mistura (DMF), incluindo ligador di-halogenado (2 eq) e DIPEA (4 eq) para reagir com Cys desprotegido.
  7. Adicionar 5-10 ml da solução de reacção à coluna para reagir com Cys desprotegido durante, pelo menos, 3 h com borbulhamento de N2 . Desidratar com metanol anidro e secar com N2 para o próximo uso.
  8. Drene a solução por uma bomba de vácuo e lave a resina sequencialmente com DCM (5-10 mL) e DMF (5-10 mL) 5x.
  9. Preparar uma solução para ciclização peptídica: preparar um volume suficiente (20 mL) de mistura de TFGA (TFA:TIS:H 2O = 95:2.5:2.5) em um recipiente de vidro no exaustor para ciclização peptídica.
  10. Adicionar 5-10 mL da solução de mistura de TFA ao tubo de polipropileno e clivar a resina sob o coquetel de TFA por 3 h.
    CUIDADO: TFA é altamente corrosivo e irritante; o processo de clivagem peptídica deve ser realizado em um exaustor.
  11. Execute as etapas 7.1-7.5 para obter uma solução peptídica linear por purificação de fase líquida de fase reversa (HPLC). Liofilizar a solução para a próxima utilização.

6. Ciclização do sal de propargil sulfônio (Figura 4)

  1. Construa um peptídeo linear com Met e Cys repetindo os passos 4.1-4.6. Adicionar 10 mL de metanol anidro à coluna com a resina para desidratação e secar com N2 para o próximo uso (repetir duas vezes) após acoplamento peptídico linear.
  2. Pesar 100 mg da resina obtida na etapa anterior em uma coluna (reservatório de 20 mL) e lavar a resina com DCM (5-10 mL) e DMF (5-10 mL) antes da etapa de acoplamento.
  3. Execute as etapas 7.1-7.5 para obter uma solução peptídica linear por HPLC e liofilizar a amostra, como mencionado, para o próximo uso.
  4. Preparar uma solução aquosa de HCOOH a 1% (em volume) e um brometo de propargila a 1,0 mM (5 eq) e adicionar à solução peptídica Met (0,2 mM, 1 eq; 0,2 ml de MeCN/H2O [1:1, v/v]).
  5. Em seguida, agite a reação de acoplamento de Met e brometo de propargila à temperatura ambiente por 12 h.
  6. Após a reação, dissolver o produto em um tubo de polipropileno em acetonitrila e filtrá-lo através de uma membrana de filtro de 0,22 μm. Em seguida, purificar a solução por HPLC de fase reversa imediatamente e liofilizá-la em pó para a próxima utilização.
  7. Na última etapa, adicionar o peptídeo com brometo de propargila a um tubo de polipropileno, manter o pH da solução de reação em 8,0 adicionando solução de (NH4)2CO3 e agitar a mistura de reação a 37 °C por 12 h. Esta etapa obtém o peptídeo cíclico do sal de propargil sulfônio.
  8. Recolher a última mistura de reacção: dissolvê-la num tubo de polipropileno em acetonitrila e filtrá-la através de uma membrana filtrante de 0,22 μm. Em seguida, purificar a solução por HPLC de fase reversa imediatamente e liofilizá-la em pó para a próxima utilização.

7. Purificação de péptidos cíclicos

  1. Construa substratos peptídicos lineares em resina MBHA de rim-amida repetindo as etapas 4.1-4.6. Adicionar 10 mL de metanol anidro à coluna com resina para desidratação e secar com N2 para o próximo uso (repetir duas vezes) após acoplamento peptídico linear.
  2. Prepare um volume suficiente de coquetel de clivagem (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) no exaustor. Adicionar 1-5 mL de solução de mistura de TFA ao tubo de polipropileno e clivar a resina sob o coquetel de TFA por 3 h.
  3. Em seguida, seque sequencialmente a resina sob um vapor de N2 na coluna. Alternativamente, use um dispositivo de filtro para filtrar a resina e coletar a solução peptídica. Em seguida, adicione 20 mL de éter à solução peptídica para precipitar o peptídeo, centrifugar a 3.500 x g por 5 min e repetir duas vezes. Colete o precipitado peptídico bruto e seque-o sob um fluxo de N2 para a próxima etapa.
  4. Dissolver 200 mg de peptídeo bruto em um tubo de polipropileno em 4 mL de solução acetonitrila-água e filtrá-lo através de um filtro de 0,22 μm. Transfira o péptido para uma inserção de frasco para injetáveis de HPLC. Coloque a pastilha no amostrador automático de um sistema de HPLC semi-preparativo de fase reversa equipado com uma coluna C18 de 5 μm, 4,6 mm x 250 mm e um circuito de injeção de 1 mL.
  5. Purificar e isolar o peptídeo usando um programa de gradiente de acetonitrila de 5%-95% em água com TFA a 0,1% durante 30 minutos enquanto monitora os espectros de HPLC usando UV a 254 nm. Confirme o peso molecular do peptídeo por LC-MS, colete a solução do peptídeo e liofilize-o em pó para o próximo uso.

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Resultados

Todos os peptídeos lineares foram sintetizados em resina MBHA de rim-amida por síntese manual padrão de fase sólida Fmoc. Um hexapeptídeo cíclico modelo (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) foi construído conforme descrito na Figura 5A. Notavelmente, um novo centro quiral on-tether foi gerado por alquilação de Met, com os dois epímeros do peptídeo cíclico (Ia, Ib) confirmados por HPLC de fase reversa. Além disso, a conversão e a razão dos epímeros foram determinadas usando a ...

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Discussão

A abordagem sintética descrita neste trabalho fornece um método para sintetizar peptídeos cíclicos usando Cys e Met na sequência peptídica, na qual os peptídeos lineares básicos são construídos por técnicas comuns de síntese de peptídeos de fase sólida. Para a bisalquilação de peptídeos cíclicos entre Cys e Met, toda a rota sintética pode ser dividida em três processos principais: a desproteção de Cys na resina, o acoplamento do ligador e a ciclização entre Cys e Met em uma solução de clivagem d...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Reconhecemos o apoio financeiro do Programa Nacional de P&D de Chaves da China (2021YFC2103900); as bolsas da Fundação de Ciências Naturais da China (21778009 e 21977010); a Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (2022A1515010996 e 2020A1515010521): o Comitê de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 e JCYJ20200109140406047); e a bolsa Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions (2019SHIBS0004). Os autores reconhecem o apoio da revista Chemical Science, da Royal Society of Chemistry para a referência 30 e do Journal of Organic Chemistry, da American Chemical Society, para a referência 31.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1,3-bis(bromomethyl)-benzenEnergyD0215
1,3-Dimethylbarbituric acidEnergyA46873
1H NMR and HSQCBruker AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrateEnergyE020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)EnergyA1797
2-mercaptopyridineEnergyY31130
6-Aminocaproic acidEnergyA010678
Acetic anhydrideEnergyA01021454
AcetonitrileAldrich9758
Ammonium carbonateEnergy12980
Dichloromethane (DCM)EnergyW330229
Digital Heating Cooling Drybath Thermo Scientific88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA)EnergyW320014
Dimethyl formamide (DMF)EnergyB020051
DithiothreitolEnergyA10027
Electrospray Ionization MassSHIMADZU2020 LC-MS2020
Fmoc-Ala-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30201
Fmoc-Cys(Trt)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30501
Fmoc-Gln(Trt)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30701
Fmoc-His(Boc)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30902
Fmoc-Ile-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31001
Fmoc-Lys(Boc)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31201
Fmoc-Met-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31301
Fmoc-Pro-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31501
Fmoc-Ser(tBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31601
Fmoc-Thr(tBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31701
Fmoc-Trp(Boc)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31901
Fmoc-Val-OHNanjing Peptide Biotech LtdR32001
Formic acidEnergyW810042
High Performance Liquid
Chromatography		SHIMADZULC-2030
MethanolAldrich9758
MorpholineAldrichM109062
N,N'-DiisopropylcarbodiimideEnergyB010023
Ninhydrin ReagentEnergyN7285
Propargyl bromideEnergyW320293
Rink Amide MBHA resinNanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates Thermo Scientific60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladiumEnergyT1350
Three-way stopcocksBio-Rad7328107
TriethylamineEnergyB010737
Trifluoroacetic acid (TFA)J&K101398
Triisopropylsilane (TIS)EnergyT1533

Referências

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