Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos

Resumo

Este protocolo descreve o processo de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em células semelhantes à micróglia para experimentação in vitro . Também incluímos um procedimento detalhado para gerar sinaptossomos humanos a partir de neurônios motores inferiores derivados de iPSC que podem ser usados como substrato para ensaios de fagocitose in vitro usando sistemas de imagem de células vivas.

Resumo

A micróglia são as células imunes residentes de origem mielóide que mantêm a homeostase no microambiente cerebral e tornaram-se um jogador-chave em múltiplas doenças neurológicas. Estudar a micróglia humana na saúde e na doença representa um desafio devido ao suprimento extremamente limitado de células humanas. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de indivíduos humanos podem ser usadas para contornar essa barreira. Aqui, é demonstrado como diferenciar iPSCs humanas em células semelhantes à micróglia (iMGs) para experimentação in vitro . Esses iMGs exibem as propriedades esperadas e fisiológicas da micróglia, incluindo morfologia semelhante à microglia, expressão de marcadores adequados e fagocitose ativa. Além disso, é fornecida documentação para isolar e marcar substratos de sinaptossomos derivados de neurônios motores inferiores derivados de iPSC humanos (i³LMNs). Um ensaio de imagem longitudinal de células vivas é usado para monitorar o engolfamento de sinaptossomos humanos marcados com um corante sensível ao pH, permitindo investigações da capacidade fagocítica do iMG. Os protocolos aqui descritos são amplamente aplicáveis a diferentes campos que estão investigando a biologia da micróglia humana e a contribuição da micróglia para a doença.

Introdução

As microglias são as células imunes residentes no sistema nervoso central (SNC) e desempenham um papel crucial no desenvolvimento do SNC. A micróglia também é importante no cérebro adulto para manter a homeostase e responder ativamente a processos de trauma e doença. Evidências cumulativas mostram que a micróglia é um dos principais contribuintes para a patogênese de múltiplas doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas ^1,2. Embora o conhecimento atual sobre a biologia microglial tenha sido predominantemente derivado de modelos de camundongos, estudos recentes têm elucidado diferenças importantes entre a micróglia murina e humana, ressaltando a necessidade de desenvolvimento de tecnologias para estudar a genética e as funções biológicas da micróglia humana ^3,4. O isolamento da micróglia do tecido primário dissecado pode modificar severamente as propriedades da micróglia⁵, potencialmente confundindo os resultados adquiridos com essas células. O objetivo geral deste método é diferenciar as iPSCs humanas em iMGs, fornecendo assim um sistema de cultura celular para estudar a micróglia humana sob condições basais. Além disso, um ensaio de fagocitose usando um sistema de modelo totalmente humano é incluído aqui como um meio de estudar a funcionalidade dos iMGs, tanto como uma medida de controle de qualidade quanto para avaliar a disfunção de iMG no contexto da doença.

Múltiplos protocolos para diferenciação da micróglia a partir de iPSCs têm surgido recentemente na literatura ^6,7,8,9,10. As desvantagens potenciais de alguns protocolos incluem períodos prolongados ou longos de diferenciação, a adição de múltiplos fatores de crescimento e/ou procedimentos experimentais complexos ^6,9,10. Aqui, demonstra-se um método de diferenciação "user-friendly" que recapitula aspectos da ontogenia da micróglia por meio da diferenciação de iPSCs em células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)^7,11. Os PMPs são gerados conforme descrito anteriormente, com algumas otimizações aqui apresentadas¹². Os PMPs imitam macrófagos derivados de saco vitelino independentes de MYB, que dão origem à micróglia durante o desenvolvimento embrionário, invadindo o cérebro antes do fechamento da barreira hematoencefálica¹³. Para diferenciar terminalmente PMPs em iMGs, utilizamos um método de monocultura rápido e simplificado baseado em protocolos de Haenseler et al. e Brownjohn et al., com algumas modificações para gerar um método eficiente de diferenciação de micróglias no qual os iMGs expressam robustamente marcadores enriquecidos com microglia ^7,8. Este método de diferenciação pode ser reproduzido em laboratórios com experiência na cultura de iPSCs e com objetivos de pesquisa com o objetivo de estudar a biologia da micróglia usando um sistema de modelo humano.

A micróglia derivada da iPSC representa uma fonte biologicamente relevante de micróglia humana para experimentação in vitro e é uma ferramenta importante para investigar as funções canônicas microgliais, incluindo a fagocitose. As micróglias são os fagócitos profissionais do cérebro e do SNC, onde limpam detritos celulares, proteínas agregadas e mielina degradada¹⁴. A micróglia também atua no remodelamento sináptico por engolfamento de sinapses e na defesa contra infecções externas por meio da fagocitose de patógenos^15,16. Neste protocolo, a fagocitose por iMGs é avaliada usando sinaptossomos humanos como material para engolfamento de iMG. Para este fim, uma descrição para isolar sinaptossomos derivados de i³LMNs humanos é descrita. Os sinaptossomos humanos derivados de LMN i³são marcados com um corante sensível ao pH que permite a quantificação de sinaptossomos localizados dentro de compartimentos ácidos durante o processamento e degradação de fagossomos in vitro. Um ensaio de fagocitose usando microscopia de células vivas é mostrado para monitorar o processo dinâmico de engolfamento da micróglia em tempo real. Este ensaio funcional estabelece uma base para investigar possíveis defeitos na fagocitose microglial na saúde e na doença usando um sistema humano completo.

Protocolo

NOTA: Todos os reagentes utilizados neste protocolo devem ser estéreis, e todas as etapas devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança sob condições estéreis. Todas as linhas iPSC, bem como os meios de manutenção e diferenciação, estão descritos na Tabela de Materiais. O método de diferenciação da micróglia ilustrado a seguir baseia-se em protocolos publicados anteriormente^7,8,12 com novas modificações aqui descritas.

1. Diferenciação da micróglia

NOTA: Uma visão geral do protocolo é resumida na Figura 1.

1. Cultura induzida de células-tronco pluripotentes (iPSC)
   NOTA: Mais detalhes descrevendo as técnicas de cultura de iPSC podem ser encontrados em outros lugares¹⁷.
   1. Descongelamento e manutenção
      1. Preparar o meio iPSC, alíquota do meio e armazenar a -20 °C por até 6 meses. Descongele as alíquotas durante a noite a 4 °C e utilize-as até 1 semana. Deixar o meio à temperatura ambiente durante, pelo menos, 1 h antes da utilização.
      2. Revestir os poços de uma placa de 6 poços adicionando 1 mL de 10 μg/mL de laminina 521 diluída em DPBS contendo cálcio e magnésio¹⁸. Manter as placas numa incubadora a 37 °C e a 5% de CO 2 durante, pelo menos,₂ h ou, de preferência, durante a noite. Uma vez diluída, conservar a laminina a 4 °C durante 3 meses.
      3. Preparar a solução-mãe do inibidor da roquinase de 10 mM Y27632 (inibidor de ROCK) diluindo em água estéril. Faça alíquotas de uso único da solução inibidora de ROCK e armazene-as a -20 °C por até 1 ano.
      4. Preparar EDTA 0,5 mM diluindo a solução-mãe de EDTA 0,5 M em DPBS.
      5. Para descongelar um frasco para injetáveis de iPSCs congeladas, coloque o frasco para injetáveis em banho-maria a 37 °C até que esteja praticamente descongelado. Transfira imediatamente o conteúdo do frasco para injetáveis para um tubo cónico de 15 ml contendo 4 ml de meio iPSC. Centrífuga a 500 × g durante 1 min.
      6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células adicionando 1 mL de meio iPSC contendo inibidor de ROCK de 10 μM lentamente contra a parede do tubo para evitar a perturbação das colônias.
      7. Adicionar 1,5 mL de meio iPSC contendo inibidor de ROCK de 10 μM a cada um dos poços revestidos e transferir as colônias ressuspensas gota a gota para os poços que contêm o meio.
         NOTA: Use de 5 a 7 gotas da etapa 1.1.1.6 para manutenção da cultura, mas ajuste a densidade de semeadura ideal para cada linha iPSC.
      8. Distribua uniformemente as células nos poços embaralhando manualmente a placa de um lado para o outro e de trás para frente. Colocar as células numa incubadora a 37 °C e a 5% de CO₂. No dia seguinte, substitua completamente o meio adicionando meio iPSC fresco sem inibidor de ROCK.
      9. Para manutenção, troque o meio todos os dias até que as células atinjam 80% de confluência.
         NOTA: As células podem ser mantidas sem alterar o meio por 2 dias se o meio iPSC usado permitir um horário de alimentação flexível. É aconselhável limitar isso a uma vez por passagem e somente se as células forem menos de 50% confluentes.
   2. Dividir
      1. Aspirar o meio e lavar as células com 1 mL de DPBS (sem cálcio e magnésio).
      2. Para desalojar as células, adicione 1 mL de EDTA 0,5 mM e incube por 2-3 min à temperatura ambiente até que as bordas das colônias celulares se levantem da superfície do poço. Lave as células novamente com DPBS e adicione 1 mL de meio iPSC.
      3. Dissociar as colônias de células, raspando-as suavemente usando um elevador de células. Raspe cada área do poço apenas uma vez para evitar perturbar as colônias.
         NOTA: Métodos alternativos para desalojar as colônias do poço podem ser encontrados em outros lugares¹⁷.
      4. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL, colete as células e transfira-as gota a gota em uma proporção de 1:6 (células para meio) em poços pré-revestidos (como mencionado na etapa 1.1.1.2) contendo 1,5 mL de meio iPSC.
2. Diferenciação de iPSC para células semelhantes à micróglia (iMGs)
   NOTA: As pequenas moléculas e os fatores de crescimento são dissolvidos em albumina sérica bovina a 0,1% filtrada por estéril, em DPBS, até uma concentração de estoque 1.000x maior que a concentração final. Recomenda-se diferenciar iPSCs em iMGs durante as primeiras passagens. Recomenda-se a cariotipagem de rotina das linhas de iPSC.
   1. Preparar a solução de revestimento padrão
      1. Descongelar a solução-mãe de um reagente de revestimento de matriz extracelular no gelo a 4 °C durante a noite.
      2. Pré-arrefecer tubos de microcentrífuga e pontas de pipeta de filtro a 4 °C.
      3. Aliquota 250 μL do reagente de revestimento da matriz extracelular concentrada em cada tubo e coloque imediatamente no gelo. Conservar as alíquotas a -20 °C.
      4. Para preparar a solução de revestimento, descongelar uma das alíquotas do reagente de revestimento da matriz extracelular no gelo a 4 °C durante a noite.
      5. Adicione 50 mL de DMEM-F12 gelado otimizado para o crescimento de células-tronco pluripotentes embrionárias humanas e induzidas (referidas como DMEM-F12) a um tubo cônico pré-resfriado e mantenha-o no gelo.
      6. Resfrie uma ponta de pipeta de 1 mL pipetando DMEM-F12 gelado para cima e para baixo várias vezes e, em seguida, use imediatamente a ponta da pipeta para transferir 250 μL do reagente de revestimento da matriz extracelular para o tubo cônico contendo o meio DMEM-F12.
         NOTA: A solução de revestimento padrão pode ser armazenada por 2 semanas a 4 °C.
   2. Formação do corpo embrionário (EB)
      1. Prepare o meio EB que pode ser mantido a 4 °C por até 4 dias.
      2. Uma vez que as iPSCs tenham atingido 80% de confluência, dissociar as colônias lavando com 1 mL de DPBS e adicionando 1 mL de um reagente de dissociação por 2 min a 37 °C. Desaloje as colônias usando um elevador de células raspando várias vezes para criar uma suspensão de célula única. Colete as células e transfira tudo para um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL de DPBS.
      3. Centrifugar as células a 500 × g por 1 min, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de meio EB. Tomar 10 μL de células e diluir 1:1 com azul de tripano. Conte as células com um hemacitômetro e, com base na contagem de células, dilua o estoque celular até uma diluição final de 10.000 células por 100 μL. Para células de chapeamento, adicione 100 μL das células diluídas por poço em uma placa de baixa aderência, de fundo redondo, de 96 poços.
         NOTA: Geralmente, 48 poços da placa de 96 poços podem ser obtidos de cada poço 80% confluente de iPSCs.
      4. Centrifugar a placa a 125 × g durante 3 min e incubar a 37 °C e 5% de CO₂ durante 4 dias. Realize uma mudança de meio meio meio médio no dia 2 usando uma pipeta multicanal e coletando suavemente 50 μL de meio antigo e, em seguida, adicionando de volta 50 μL de meio EB fresco.
         NOTA: No dia 4, as iPSCs formarão estruturas celulares esféricas denominadas EBs, conforme descrito na seção de resultados. O processo de diferenciação do EB pode ser estendido até 7 dias, se necessário.
   3. Geração de precursores primitivos de macrófagos (PMPs)
      1. Prepare o meio base PMP, filtro estéril, e armazene-o a 4 °C por até 1 mês.
      2. Revestir os poços de uma placa de 6 poços adicionando 1 mL de solução de revestimento Matrigel gelada e incubar a 37 °C e 5% de CO 2 por pelo menos₂ h ou de preferência durante a noite.
      3. No dia 4 de diferenciação do EB, transfira os EBs para os poços revestidos de Matrigel coletando os EBs com pontas de pipeta de 1 mL (usando uma pipeta). Pipeta para cima e para baixo uma ou duas vezes para desalojar os EBs do poço. Segure a placa de 6 poços em um ângulo inclinado para permitir que os EBs se estabeleçam na borda do poço.
         NOTA: Nove ou dez EBs podem ser banhados por poço revestido.
      4. Uma vez que todos os EBs tenham se estabilizado, pipete suavemente e remova o meio antigo usando uma ponta de pipeta de 1 mL, mantendo os EBs na borda do poço. Adicione 3 mL de PMP em meio completo recém-preparado a cada poço. Distribua uniformemente as células nos poços embaralhando manualmente a placa de um lado para o outro e de trás para frente. Colocar a placa na incubadora a 37 °C e a 5% de CO₂.
      5. Não perturbe a placa por 7 dias para permitir que os EBs se fixem ao fundo do poço. Após esse tempo, execute uma mudança de meio médio usando o meio completo PMP.
         NOTA: Neste ponto, a maioria dos EBs deve ser anexada à placa. Quaisquer EBs flutuantes podem ser removidos.
      6. Após 5-7 dias, inspecione os EBs sob um microscópio de campo de luz com ampliação de 4x para garantir que eles estejam presos ao fundo dos poços. Alterar o suporte descrito no ponto 1.2.3.5. No dia 21, realizar uma troca completa do meio com 3 mL de meio completo de PMP.
         NOTA: Progenitores mieloides flutuando no meio podem ser evidentes neste ponto. Essas células devem ser descartadas durante a mudança do meio.
      7. No dia 28, procure células redondas referidas como PMPs no sobrenadante e colete o meio contendo os PMPs usando uma pipeta de 10 mL e pipettor automático. Tome cuidado para não atrapalhar os EBs. Transferir os PMPs e o meio para um tubo cónico de 15 ml e proceder conforme descrito no passo 1.2.4.
         NOTA: Normalmente, PMPs da mesma linha iPSC podem ser coletados de cinco poços de uma placa de 6 poços e agrupados em um único tubo cônico de 15 mL.
      8. Adicione 3 mL de meio completo de PMP fresco para manutenção adicional dos EBs. À medida que os PMPs emergem continuamente dos EBs por mais de 3 meses, colete-os a cada 4-7 dias (não permita que o meio mude de cor para um tom amarelo), conforme descrito nas etapas 1.2.3.7 e 1.2.3.8.
         NOTA: Embora os PMPs possam ser coletados por vários meses, eles podem mudar seu fenótipo ao longo do tempo.
   4. Diferenciação para iMGs
      1. Preparar o meio base iMG (Tabela de Materiais), filtrar estérilmente e armazená-lo a 4 °C durante até 3 semanas.
      2. Uma vez que os PMPs tenham sido coletados em um tubo cônico de 15 mL, centrifuga-os a 200 × g por 4 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as PMPs usando 1-2 mL de meio basal iMG. Conte as células usando um hemocitômetro tomando uma pequena alíquota e diluindo 1:1 com azul de tripano.
         NOTA: 0,5-1,5 × 10⁶ PMPs são normalmente obtidos a cada semana, dependendo da linha iPSC e da idade da cultura EB.
      3. Centrifugar o resto das células novamente a 200 × g durante 4 min. Diluir os PMPs até à concentração desejada de modo a que as células sejam chapeadas a uma densidade de ~10⁵/^cm2 em placas tratadas com cultura celular utilizando meio iMG completo acabado de preparar. Realize uma mudança de meio meio meio usando o meio completo iMG recém-preparado a cada 3-4 dias ao longo de 10-12 dias para permitir a diferenciação terminal.
         NOTA: Neste ponto, as células devem adquirir morfologia semelhante à da micróglia. Para confirmar o comprometimento das PMPs com o destino da micróglia, a análise de imunofluorescência é realizada para corroborar a expressão de marcadores enriquecidos com microglia, como o receptor purinérgico P2RY12 e a proteína transmembrana 119 (TMEM119)⁹.
      4. Para preservar a saúde e viabilidade celular, realizar todos os experimentos entre os dias 10 a 12 de diferenciação de iMG.

2. Ensaio de fagocitose utilizando sinaptossomos humanos derivados de neurônios motores

1. Diferenciação mediada pelo fator de transcrição de neurônios motores inferiores derivados de iPSC (i³LMNs)
   NOTA: Uma linha WTC11 com inserção estável do do fator de transcrição induzível hNIL contendo os fatores de transcrição neurogenina-2 (NGN2), ilhota-1 (ISL1) e LIM homeobox 3 (LHX3) no locus de porto seguro CLYBL foi usada para o processo de diferenciação, conforme descrito anteriormente.¹⁷. A linha iPSC foi mantida conforme descrito na etapa 1.1.1, mas com as condições de revestimento descritas na etapa 1.2.1. Qualquer reagente de revestimento de matriz extracelular pode ser usado para cultivar iPSCs que serão usadas para diferenciação neuronal, uma vez que a laminina 521 não é necessária. Todos os meios são equilibrados à temperatura ambiente por pelo menos 1 h antes do uso.
   1. Revestir as placas de 10 cm com 5 ml de solução-padrão de revestimento, conforme descrito na etapa 1.2.1.
      NOTA: Aqui, foram utilizados pratos de 3-4 10 cm por diferenciação.
   2. Preparar o meio Base de Indução, filtro estéril, e guardá-lo a 4 °C durante um período máximo de 3 semanas.
   3. Prepare o meio neurónio, filtro estéril, e guarde-o a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas.
   4. Prepare o tampão de borato misturando ácido bórico 100 mM, tetraborato de sódio 25 mM e cloreto de sódio 75 mM em água estéril. Ajuste o pH para 8,5 e filtre-o estéril.
   5. Uma vez que as iPSCs tenham atingido 80% de confluência, lave as células com DPBS e desaloje as colônias adicionando 0,5 mM de EDTA.
      NOTA: Dois poços são geralmente suficientes para cada prato de 10 cm.
   6. Incubar as células por 4-5 min à temperatura ambiente. Retire o EDTA e adicione 3 mL de DMEM/F12 com HEPES a cada poço.
   7. Raspe as células usando um elevador de células e use uma pipeta de 10 mL para remover as células do fundo do poço, pipetando suavemente para cima e para baixo 2-3x.
   8. Recolher as células num tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300 × g durante 3 min.
   9. Ressuspender as células em 3 mL de meio iPSC contendo inibidor de ROCK de 10 μM e contá-las usando um hemacitômetro.
   10. Placa 1,5 × 10⁶ iPSCs em um prato pré-revestido de 10 cm com 12 mL de meio iPSC contendo inibidor de ROCK de 10 μM.
   11. No dia seguinte, retire o meio e lave as células com DPBS. Adicionar 12 mL de meio de Indução Completa recém-preparado para induzir a expressão dos fatores de transcrição.
   12. No dia 2, revestir pratos de 10 cm com 5 mL de solução de revestimento de neurônios preparados com volumes iguais de 0,1 mg/mL de poli-D-lisina e 1 mg/mL de poli-L-ornitina diluída em tampão borato. Incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO₂.
   13. No dia 3, lave os pratos revestidos com água estéril 3x, aspirar a água completamente e deixe os pratos secarem inclinando os pratos e deixando-os parcialmente descobertos dentro de um armário de biossegurança por pelo menos 1 h à temperatura ambiente.
   14. Uma vez que os pratos tenham secado completamente, revesti-los com 6 mL de meio de Indução Completa suplementado com 15 μg/mL de laminina e 40 μM de BrdU por pelo menos 1 h a 37 °C e 5% de CO₂.
       NOTA: O tratamento com BrdU é recomendado para eliminar as células mitoticamente ativas e, assim, aumentar a pureza das culturas neuronais. Os efeitos do BrdU na saúde neuronal são mínimos.
   15. Tratar as células diferenciadoras com 3 mL de reagente de dissociação por prato de 10 cm e incubar por 3-4 min à temperatura ambiente.
   16. Adicione 6 mL de DPBS na placa sem remover o reagente de dissociação e pipete as células em solução para cima e para baixo 4-5x com uma pipeta de 10 mL para dissociar as células.
   17. Recolher a suspensão celular e passá-la através de um filtro celular de 40 μm para um tubo cónico de 50 ml. Adicionar 1 mL de meio de base de indução para enxaguar o filtro.
   18. Centrifugar as células a 300 × g durante 5 min. Aspirar o meio e ressuspender as células em 3 mL de meio de Indução Completa contendo 40 μM de BrdU.
   19. Conte as células com um hemocitômetro. Placa de aproximadamente 2,5 × 10 6 células por prato de 10 cm em pratos pré-revestidos, diluindo as células em⁶ mL de meio de indução completa contendo 40 μM de BrdU sem remover a solução de revestimento adicionada na etapa 2.1.14.
   20. No dia 4, aspirar o meio, lavar as células 1x com DPBS e adicionar meio de indução completa fresco contendo 40 μM BrdU.
   21. No dia 6, aspirar o meio, lavar as células 1x com DPBS e adicionar o meio Neuron suplementado com 1 μg/mL de laminina.
   22. No dia 9, troque 1/3^do meio, substituindo-o por um meio Neuron fresco suplementado com 1 μg/mL de laminina.
   23. Mantenha i 3 LMNs por mais 25 dias, realizando meias mudanças de meio com meio Neuron meio suplementado com 1 μg/mL fresco de laminina a cada^3-4dias.
       NOTA: Neste momento, i³LMNs devem apresentar uma morfologia neuronal com processos longos. Os neurônios também tendem a formar aglomerados ou aglomerados de células. Uma descrição mais detalhada de como validar a diferenciação de i³LMNs pode ser encontrada em outro lugar¹⁷.
2. Purificação e rotulagem de sinaptossomas
   NOTA: Mantenha condições estéreis e execute todas as etapas dentro de um gabinete de biossegurança.
   1. Lave i³ LMNs duas vezes com DPBS.
   2. Adicione 2 mL de reagente de lise celular gelada para isolamento de sinaptossomos, incube no gelo por 2 minutos e raspe firmemente os neurônios.
   3. Transfira o lisado para múltiplos microtubos de 2 mL (~1,5 mL de lisado por tubo) e centrifugar a 1.200 × g por 10 min a 4 °C.
      NOTA: Mantenha os tubos no gelo durante todo este procedimento.
   4. Recolher o sobrenadante (eliminar o pellet) e centrifugar a 15.000 × g durante 20 min a 4 °C. Salve e ressuspenda o pellet contendo os sinaptossomos com um volume semelhante (como o lisado original) de 5% de DMSO em DPBS.
      NOTA: Os sinaptossomos podem ser imediatamente marcados com um fluoróforo ou armazenados a -80 °C para utilização futura.
   5. Realizar um ensaio proteico de ácido bicinchonínico (BCA) para todos os tubos para avaliar o rendimento total de proteína na preparação dos sinaptossomas.
      NOTA: Outros ensaios para medir a concentração de proteína podem ser usados. O rendimento proteico total obtido a partir de diferentes preparações foi incluído na Tabela 1 como referência. Recomenda-se a realização de análise de western blot da preparação dos sinaptossomos para confirmar a presença de proteínas pré-sinápticas e pós-sinápticas. Aqui, o marcador pré-sináptico, sinaptofisina (SYP), e o marcador pós-sináptico, proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD95) foram escolhidos para análise de western blotting, conforme descrito anteriormente¹⁹.
   6. Prepare uma solução de bicarbonato de sódio 100 mM em água, ajuste o pH para 8,5 e filtre estéril.
   7. Solubilizar 1 mg de pó liofilizado do corante sensível ao pH utilizado em 150 μL de DMSO. Fazer alíquotas de utilização única e armazená-las a -80 °C.
   8. Centrifugar os sinaptossomos a 15.000 × g durante 5 min a 4 °C.
   9. Diluir até 1 mg de sinaptossomas em 100 μL de solução de bicarbonato de sódio a 100 mM.
   10. Para rotular os sinaptossomos, adicione 1 μL do corante sensível ao pH reconstituído por 1 mg de sinaptossomos e cubra a reação com folha de alumínio para evitar a exposição à luz. Agitar à temperatura ambiente durante 2 h utilizando um agitador de tubos.
   11. Adicionar 1 mL de DPBS ao tubo e centrifugar os sinaptossomos marcados a 15.000 × g por 5 min a 4 °C.
   12. Remova o sobrenadante e execute quatro lavagens adicionais, conforme descrito na etapa 2.2.11.
   13. Após a lavagem final e o spin, retirar o sobrenadante o máximo possível sem perturbar o pellet e ressuspender os sinaptossomos marcados com DMSO a 5% em DPBS em volume para a concentração desejada (0,7 μg/μL aqui utilizado). Preparar alíquotas de utilização única e conservar a -80 °C. Certifique-se de evitar a exposição à luz aos sinaptossomos rotulados.
3. Ensaio de fagocitose de células vivas
   1. A placa 20-30 × 10 4 PMPs em placas de 96 poços em 100 μL de meio completo iMG e seguir o processo de diferenciação por 10 dias, conforme indicado na etapa 1.2.4.
   2. No dia do ensaio, preparar a solução de coloração nuclear adicionando 1 gota de uma coloração nuclear para células vivas em 2 mL de meio basal iMG.
   3. Remover 40 μL de meio por poço da placa de 96 poços e adicionar 10 μL da solução de coloração nuclear usando uma pipeta multicanal. Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO 2 durante₂ h.
   4. Descongele os sinaptossomos rotulados no gelo e sonicate suavemente usando um sonicator de água por 1 min. Transfira imediatamente os sinaptossomos de volta ao gelo. Diluir os sinaptossomos marcados em meio completo iMG na proporção de 1 μL de sinaptossomos por 50 μL de meio.
      NOTA: A concentração de sinaptossomo é dependente do ensaio e pode exigir otimização. Para manter uma porcentagem relativamente baixa (ou seja, 0,1% ou menos) de DMSO no meio, é aconselhável não adicionar mais de 2 μL de sinaptossomos por poço.
   5. Como controle negativo, pré-tratar alguns dos poços com citocalasina D para inibir a polimerização da actina e, portanto, a fagocitose. Preparar uma solução de 60 μM de citocalasina D em meio iMG completo. Adicionar 10 μL desta solução a cada alvéolo para uma concentração final de 10 μM e incubar a 37 °C e 5% de CO₂ durante 30 min.
   6. Retire a placa da incubadora e incube a 10 °C durante 10 min. Manter a placa sobre gelo e adicionar 50 μL de meio contendo sinaptossomas preparados conforme descrito na etapa 2.3.4.
   7. Centrifugar a placa a 270 × g durante 3 min a 10 °C e manter a placa sobre gelo até à aquisição por imagem.
4. Aquisição e análise de imagens
   1. Insira a placa em um leitor de imagens de células vivas e selecione os poços a serem analisados.
   2. Selecione uma lente objetiva de 20x .
   3. Ajuste o foco, a intensidade do diodo emissor de luz (LED), o tempo de integração e o ganho dos canais de campo brilhante e azul (4',6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI]). A fluorescência dos sinaptossomos deve ser insignificante no momento inicial. Para se concentrar no canal vermelho (RFP), use o canal de campo brilhante como referência. O tempo e o ganho de integração podem variar entre os experimentos; use estas configurações iniciais para o canal vermelho: LED: 4, tempo de integração: 250 e ganho: 5.
   4. Selecione o número de telhas individuais a serem adquiridas em uma montagem por poço (adquira 16 telhas no centro do poço, imaginando assim aproximadamente 5% da área total do poço). Ajuste a temperatura para 37 °C e o intervalo de tempo desejado para a geração de imagens.
      NOTA: As imagens foram adquiridas a cada 1 - 2 h por até 16 h neste estudo.
   5. Abra o software de análise.
      1. Abra o experimento que contém as imagens. Clique no ícone Redução de dados.
      2. No menu, escolha Costura de imagem em Processamento de imagens para criar uma imagem completa a partir dos blocos individuais 4 x 4 na montagem com os parâmetros descritos na Tabela 2.
      3. Depois que as imagens costuradas forem criadas, defina um limite de intensidade usando os canais DAPI e RFP para essas imagens. Abra uma imagem e clique em Analisar; em Análise, selecione Análise Celular e, em Canal de Detecção, escolha uma imagem costurada nos canais DAPI ou RFP. Vá para a guia Máscara e Contagem Primária e estabeleça um valor limite e valores de tamanho de objeto que selecionem corretamente os núcleos da célula no canal DAPI ou o sinal de sinaptossomo no canal RFP. Repita o processo com imagens diferentes até que os parâmetros que podem ser aplicados a todo o experimento sejam otimizados.
         NOTA: Os valores sugeridos podem ser encontrados na Tabela 2.
      4. Para contar o número de núcleos, vá para o menu Redução de Dados e, em Análise de Imagem, selecione Análise Celular. Vá para a guia Máscara e Contagem Primária e, em Canal, selecione as imagens costuradas DAPI e use os parâmetros descritos na Tabela 2.
      5. Vá para a guia Métricas Calculadas e selecione Contagem de Células. Para obter a área do sinal do sinaptossomo, vá para o menu Redução de Dados e, em Análise, selecione Análise Celular.
      6. Vá para a guia Máscara e Contagem Primária e, em Canal, selecione Imagens costuradas por RFP e use os parâmetros detalhados na Tabela 2.
      7. Vá para a guia Métricas Calculadas e selecione Área de Soma de Objetos. Na guia Redução de Dados , clique em OK e permita que o software analise todas as imagens adquiridas.
      8. Exporte os valores de Área de Soma de Objetos e Contagem de Células para cada ponto de tempo. Divida a Área de Soma do Objeto pela Contagem de Células para calcular a área normalizada por ponto de tempo. Se comparar vários tratamentos ou genótipos, calcule o índice de fagocitose usando a equação (1):
         (1)
      9. Salve os resultados e integre os dados.

Resultados

Para gerar iMGs utilizando esse protocolo, é importante começar com iPSCs indiferenciadas que apresentem morfologia de colônia compacta com bordas bem definidas (Figura 2A). As iPSCs dissociadas mantidas conforme descrito na seção de formação de EB formarão agregados esféricos, denominados EBs, que crescerão em tamanho até o dia 4 de diferenciação (Figura 2B). Uma vez que os EBs são coletados e banhados nas condições apropriadas para a geração ...

Discussão

O protocolo de diferenciação descrito aqui fornece um método eficiente para obter células semelhantes a micróglias derivadas de iPSC em ~6-8 semanas com alta pureza e em um rendimento suficiente para realizar experimentos de imunofluorescência e outros ensaios que requerem um maior número de células. Este protocolo produziu até 1 × 10⁶ iMGs em 1 semana, o que permite a extração de proteínas e RNA e análises a jusante correspondentes (por exemplo, RNASeq, qRT-PCR, western blot, espectrometria de m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibody	Wako Chemical USA	NC9288364	1:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	1:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	1:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibody	Abcam	ab6046	1:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody	Abclonal	A6344	1:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibody	Millipore	MAB1596	1:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM)	Sigma	B6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (75 mM)	Sigma	S7653
Sodium tetraborate (25 mM)	Sigma	221732
Cell culture materials
6-well plates	Greiner Bio-One	657160
40 μm Cell Strainers	Falcon	352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated	CELLTREAT	229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile	CELLTREAT	229305
low adherence round-bottom 96-well plate	Corning	7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate	Corning	353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate	Corning	353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning	353872
Cell dissociation reagents
Accutase	Corning	25058CI	dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagent	Life Technologies	12-605-010	dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning™	354230	Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521	STEMCELL Technology	77004	Referred as to laminin 521
Poly-D-Lysine	Sigma	P7405	Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655	Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
mTeSR Plus Kit	STEMCELL Technology	100-0276	To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	final concentration 50 ng/mL
iPSC media			final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	final concentration 10 µM
SCF	PeproTech	300-07	final concentration 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	final concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	final concentration 55 µM
IL-3	PeproTech	200-03	final concentration 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	final concentration 100 ng/mL
PMP base media			final concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	final concentration 55 µM
IL-34	PeproTech or Biologend	200-34 or 577904	final concentration 100 ng/mL
iMG base media			final concentration 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	final concentration 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPES	Gibco	11330032	final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x	Gibco	11140050	final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound E	Calbiochem	565790	final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
Doxycycline	Sigma	D9891	final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base media			final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401	final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x	Gibco	11140050	final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03	The Jackson Laboratories
WTC11 hNIL	National Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific Pierce	23227
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	87793	Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester	ThermoFisher Scientific	P36600	Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% Solution	AMRESCO INC	K940-100ML
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	22144-77-0
BrdU	Sigma	B9285	Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin D	Sigma		final concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesium	Corning	21-030-CV
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV	Referred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12	Gibco	12660012	Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017015	Referred as to laminin
Software and Equipment
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader	Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	Biotek	version 3.03
Multi-Therm Heat-Shake	Benchmark		refer as tube shaker
Water sonicator	Elma	Mode Transsonic 310