Extração, marcação e purificação de células específicas de linhagem de folículos antrais humanos

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos para a identificação e purificação de células ovarianas de folículos antrais. Elaboramos métodos de processamento de ovários inteiros para a criopreservação de tiras corticais e também colhemos de folículos antrais intactos que são tratados enzimaticamente para liberar vários tipos de células residentes de folículos, incluindo células granulosas, tecais, endoteliais, hematopoiéticas e estromais.

Resumo

A ativação, crescimento, desenvolvimento e maturação dos ovócitos é um processo complexo que é coordenado não apenas entre vários tipos celulares do ovário, mas também através de múltiplos pontos de controle dentro do circuito hipotálamo/hipófise/ovariano. Dentro do ovário, vários tipos de células especializadas crescem em estreita associação com o ovócito dentro dos folículos ovarianos. A biologia dessas células tem sido bem descrita nos estágios mais avançados, quando são facilmente recuperadas como subprodutos de tratamentos de reprodução assistida. No entanto, a análise aprofundada de pequenos folículos antrais isolados diretamente do ovário não é comumente realizada devido à escassez de tecido ovariano humano e ao acesso limitado ao ovário em pacientes submetidas a tratamentos de reprodução assistida.

Estes métodos de processamento de ovários inteiros para a criopreservação de tiras corticais com a identificação/isolamento concomitante de células residentes nos ovários permitem a análise de alta resolução dos estágios iniciais do desenvolvimento dos folículos antrais. Demonstramos protocolos para isolar tipos celulares discretos através do tratamento enzimaticamente dos folículos antrais e separação das células granulosas, tecais, endoteliais, hematopoéticas e estromais. O isolamento de células dos folículos antrais em vários tamanhos e estágios de desenvolvimento permite a análise abrangente dos mecanismos celulares e moleculares que conduzem o crescimento dos folículos e a fisiologia ovariana e fornece uma fonte de células viáveis que podem ser cultivadas in vitro para recapitular o microambiente folicular.

Introdução

Os principais elementos funcionais do ovário humano são os folículos, que governam o crescimento e desenvolvimento dos ovócitos. Protocolos para o isolamento de células foliculares estão bem estabelecidos no contexto da fertilização in vitro , mas são apropriados apenas para a coleta de células de folículos luteinizados no ponto de recuperação oocitária¹. Desenvolvemos um protocolo que permite o isolamento de populações celulares discretas de folículos antrais em diferentes estágios de desenvolvimento que surgem de ovários nativos ou tecido ovariano xenotransplantado². Embora haja consenso de que as contribuições das células residentes nos folículos para o cultivo do ovócito são de grande importância, poucos estudos identificaram e extraíram prospectivamente os subtipos fenotípicos únicos presentes nos folículos em estágio antral. Uma compreensão mais profunda da hierarquia de diferenciação e transdução de sinal entre células especializadas durante os diferentes estágios de desenvolvimento poderia ampliar nossa compreensão da fisiologia ovariana sob condições homeostáticas e patológicas. Além disso, a discriminação de subtipos celulares discretos e suas contribuições moleculares para o crescimento/maturação dos folículos podem fornecer um meio de gerar substitutos ex vivo que reconstroem a função ovariana para promover a maturação oocitária e/ou tratar a disfunção endócrina.

Cada tipo de célula única dentro do ovário contribui para a função complexa do folículo, que funciona efetivamente como um mini-órgão discreto para promover o crescimento e a maturação do ovócito que contém. O ovócito, peça central do folículo, é diretamente envolvido por uma camada contínua de células da granulosa (GCs), com as células da teca (CTs) formando uma camada secundária de células que se combinam com o ovócito e os GCs para compor a unidade folicular. Embora classificados em dois grupos, os GCs e CTs contêm vários subtipos. Os GCs são classificados de acordo com sua posição dentro do folículo; Os GCs que circundam o ovócito versus aqueles adjacentes à membrana basal são designados como GCs oóforos e murais, respectivamente, e esses subtipos exibem assinaturas transcriptômicas únicas. Os CTs têm vários subtipos que funcionam para fornecer suporte esteroidogênico, metabólico e estrutural. Células endoteliais, perivasculares e imunes desempenham um papel central na manutenção da fisiologia ovariana normal. O estroma ovariano serve não apenas como substrato para o crescimento dos folículos, mas também provavelmente fornece uma fonte de progenitores que dão origem aos CTs. Este complexo multicamadas de subtipos celulares dentro do ovário é o que permite sua função como um órgão endócrino e reprodutivo.

Este trabalho apresenta um protocolo para identificação e purificação de células granulosas, tecais, estromais, endoteliais e hematopoéticas de folículos antrais. Utilizamos este protocolo para isolar essas células ovarianas e analisá-las usando sequenciamento unicelular, seguido de coloração específica em folículos de diferentes estágios de desenvolvimento. O protocolo fornece uma metodologia simples que é replicável e permitirá a análise de alta resolução da fisiologia e patologia do ovário.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Weill Cornell Medicine. Todos os experimentos de xenotransplante utilizando tecido ovariano foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes. Ambos os ovários foram isolados de um doador de órgãos com morte encefálica de 14 anos, sem história de radio/quimioterapia e sem história documentada de condições endócrinas ou reprodutivas. O Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Weill Cornell Medicine aprovou a coleta de tecidos, e a aprovação da família do doador de órgãos foi obtida após consentimento informado quanto ao uso de tecidos.

1. Coleta e manuseio do tecido ovariano

1. Coletar ovários inteiros e o tecido associado e enxaguar em solução salina estéril.
2. Usando pinças estéreis, coloque os ovários em um recipiente estéril. Deite solução estéril, tamponada e fria (por exemplo, meio L-15 de Leibovitz) no recipiente. Certifique-se de que o tecido está completamente coberto com o líquido.
3. Feche o recipiente e faça o saco duplo usando sacos plásticos estéreis. Transporte o recipiente no gelo dentro de uma caixa isolada (por exemplo, isopor). Transfira os espécimes para o laboratório que processará os ovários o mais rápido possível, de preferência em um tempo não superior a 5 h ^3,4.

2. Processamento do tecido ovariano

NOTA: Certifique-se de que todos os reagentes e ferramentas estejam preparados antes que o tecido chegue ao laboratório para reduzir ao máximo o intervalo isquêmico. Os tampões podem ser preparados até 1 semana antes do congelamento e refrigerados até o uso.

1. Preparações para o processamento e congelamento ovariano
   1. Colocar ferramentas cirúrgicas esterilizadas no gabinete de biossegurança em preparação para o processamento de tecidos: um bisturi número 21; um bisturi número 11; tesoura curva fina afiada; uma pinça longa (~150 mm de comprimento); e duas pinças médias (~110 mm de comprimento).
   2. Preparar 100 mL de meio de processamento de tecido (ver Tabela de Materiais): meio L-15 de Leibovitz contendo solução antibiótico-antimicótica e filtrado usando um filtro de 0,2 μm. Mantenha o meio refrigerado.
   3. Rotular os frascos para injetáveis, adicionar 1,5 ml de solução de congelação (ver Tabela de Materiais) a cada frasco para injetáveis e armazená-lo a 4 °C.
   4. Tenha disponível uma placa de 6 poços à mão para uso.
2. Na chegada do tecido
   1. Borrife o recipiente com solução de etanol a 70%, limpe bem e coloque-o dentro do armário de biossegurança.
   2. Usando luvas estéreis, abra o recipiente. Colocar o ovário numa placa de Petri estéril e deitar meio refrigerado (do passo 2.1.2) para hidratar o tecido. Certifique-se de que o ovário está semi-submerso no meio.
   3. Remova quaisquer suturas ou outro material e disseque o tecido residual circundante longe do ovário.

3. Isolamento dos folículos antrais

1. Identificar folículos individuais para isolamento. Ao escolher folículos saudáveis, exclua quaisquer folículos cheios de sangue, escuros ou não simétricos, pois eles provavelmente são atréticos.
2. Isolar os folículos antrais escolhidos de todo o ovário com bisturis, mantendo o antro intacto através da excisão do tecido cortical que engloba o folículo.
3. Coloque cada folículo antral intacto excisado em um poço da placa de 6 poços. Se necessário para fins descritivos, use uma régua colocada abaixo da placa para determinar o diâmetro do folículo.
4. Com bisturi, bissetriz o folículo antral intacto para obter acesso à cavidade antral e adicionar 4 mL de meio de descolamento enzimático de células. Incubar a placa em estufa umidificada a 5% CO₂ e 37 °C por 10 min.
5. Repita a extração de folículos antrais adicionais conforme necessário.

4. Isolamento de células residentes no folículo

1. Após a incubação, adicionar 4 mL de meio disponível contendo 20% de SFB e lavar por pipetagem vigorosa e repetida do meio sobre os folículos bissectados com uma micropipeta P1.000.
2. Recolha o meio e passe-o através de um filtro de 100 μm.
3. Centrifugar o sobrenadante filtrado a 300 × g e 4 °C durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e reservar o pellet de células (enriquecido com GCs) no gelo para marcação e classificação celular ativada por fluorescência (FACS).
4. Coloque o tecido restante em uma mistura de colagenase (100 U/mL) e dispase (1 U/mL) diluída em uma solução salina balanceada (por exemplo, Hanks) e incube por 30 min a 5% de CO₂ e 37 °C, interrompendo mecanicamente o tecido por trituração e pipetagem vigorosa (ou seja, 10-15 passagens através da ponta da pipeta) duas vezes após 10 min e 20 min.
5. Recupere o meio contendo o tecido, lave por pipetagem através de uma ponta de micropipeta P1.000 e coe através de um filtro de 100 μm.
6. Centrifugar a 300 × g e 4 °C durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e colocar de lado o pellet celular (enriquecido com TCs e células do estroma) no gelo para marcação e FACS.

5. Classificação de células ativadas por fluorescência

1. Ressuspender os pellets de células em solução de bloqueio (PBS + FBS a 0,1%) e incubar por 10 min a 4 °C.
2. Centrifugar a 300 × g e 4 °C durante 3 min e aspirar o sobrenadante.
3. Ressuspender os pellets celulares em solução de bloqueio contendo anticorpos diretamente conjugados (ver Tabela 1 para combinações apropriadas de anticorpos para identificar GCs e TCs) e incubar no gelo por 10 min.
4. Lavar e centrifugar as células a 300 × g e 4 °C durante 3 min. Ressuspender as células em tampão FACS contendo 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e executar a suspensão celular através de um instrumento FACS para capturar uma pequena população de células (500-1.000) usando a intensidade de fluorescência de anticorpos conjugados a fluoróforos para gating.
5. Para a identificação de subpopulações únicas, utilize as seguintes estratégias de limitação:
   1. Para a purificação dos GCs, desenhar uma porta ao redor das células CD45+ (Figura 1B) e excluir essa população da população CD99⁺ (Figura 1A e Figura 1C); em seguida, subdivida a fração CD99+ restante em frações PVRL^+/- (Figura 1A e Figura 1C).
   2. Para a purificação dos CTs e estroma, basta a população total de ENG+ (Figura 1A) ou CD55+ (Figura 1D) para excluir a fração endotelial CD34+ (Figura 1E) e distinguir as células esteroidogênicas (ANPEP⁺) e não esteroidogênicas (ANPEP^-). Tenha cuidado para compensar o sangramento entre os fluoróforos que estão próximos nos espectros de emissão.
6. Para validar a pureza da fração de células classificadas, execute 5% do volume total capturado através do instrumento FACS e garanta que as células preencham as portas esperadas e estejam presentes em >95% de pureza.

6. Processamento do tecido cortical ovariano

1. Bissetriz o restante do ovário e excise a medula usando tesouras finas curvas e bisturis, tomando cuidado para evitar danos ao córtex ovariano.
2. Continue processando e afinando o córtex ovariano raspando suavemente até que a medula mínima permaneça. Certifique-se de usar a força mínima necessária.
   NOTA: A espessura do tecido cortical deve estar entre 1 mm e 1,5 mm.
3. Divida o tecido cortical em tiras de 2-3 mm de largura ao longo do comprimento do ovário.

7. Congelamento lento do tecido ovariano

1. Preparação para congelamento
   1. Coloque uma tira cortical em cada frasco para injetáveis criogénicos refrigerado contendo solução de congelação.
   2. Agitar os frascos para injetáveis criogénicos que contêm as tiras corticais numa placa giratória durante 20 minutos a 4 °C.
2. Congelamento lento do tecido ovariano⁵
   1. Coloque os crióscos contendo tecido ovariano num congelador programável regulado para começar a 0 °C.
   2. Arrefecer a uma taxa de 2 °C/min até -7 °C.
   3. Manter os crióvios a esta temperatura durante 10 minutos.
   4. Nuclear a formação de cristais de gelo ao tocar cada criovial com uma ponta de algodão que foi brevemente imersa em nitrogênio líquido (LN₂).
   5. Arrefecer a uma taxa de 0,3 °C/min até que a temperatura da amostra atinja -40°C.
   6. Aumente a taxa de resfriamento para 10 °C/min até que a temperatura da amostra atinja -140 °C.
   7. Transfira os criósculos para armazenamento em LN₂.

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Resultados

Isolamos os folículos da superfície do ovário e os tratamos enzimaticamente para isolar os GCs, bem como as células do teca e do estroma ao redor da cavidade antral. As células foram coletadas, e as frações celulares foram separadas dos folículos antrais (diâmetros variando entre 0,5 mm e 4 mm) por FACS para >95% de pureza (Figura 1).

Para marcar e purificar frações celulares únicas dentro dos folículos antrais humanos, combinamos digestão enzimátic...

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Discussão

A melhor resolução da diversidade celular dentro dos folículos ovarianos é clinicamente importante por várias razões. Na aplicação do protocolo acima para o isolamento dos subtipos fenotípicos únicos que residem nos folículos em estágio antral, vários fatores devem ser considerados. Em primeiro lugar, a saúde e a viabilidade do tecido ovariano do qual o folículo antral é derivado é fundamental para determinar a qualidade das células e o sucesso das aplicações a jusante. Isso pode ser otimizado minimiz...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Antifade Mountant solution	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, powder	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethyl sulfoxide
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzyme Cell Detachment Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Balanced Salt solution	Thermo Fisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no phenol red
Leibovitz’s L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normal Saline	Quality Biological	114-055-101
Sucrose	Millipore Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)
- 69.64 mL of Leibovitz's L-15
- 17.66 mL of fetal bovine serum
- 3.42 g of sucrose
- 10.65 mL of DMSO
- 1 mL of antibiotic-antimycotic
Lab Plasticware and Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µm	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1.8 mL
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL	Fisher scientific	352235	Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm	Corning	431154
Antibodies
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R&D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Surgical tools
long forceps (~150 mm length)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
medium forceps (~110 mm length)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
number 21 scalpel	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
number 11 scalpel	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
sharp fine curved scissors	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Flourescence activated cell sorter	BD
LSM 710 META Confocal microscope	Zeiss