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Neste Artigo

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  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este protocolo descreve metodologias para estabelecer organoides epiteliais endometriais de camundongos para expressão gênica e análises histológicas.

Resumo

O tecido endometrial reveste a cavidade interna do útero e está sob o controle cíclico do estrogênio e da progesterona. É um tecido composto por epitélio luminal e glandular, um compartimento estromal, uma rede vascular e uma população complexa de células imunes. Modelos de camundongos têm sido uma ferramenta poderosa para estudar o endométrio, revelando mecanismos críticos que controlam a implantação, a placentação e o câncer. O recente desenvolvimento de culturas organoides endometriais 3D apresenta um modelo de última geração para dissecar as vias de sinalização subjacentes à biologia endometrial. Estabelecer organoides endometriais a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados, analisar seus transcriptomas e visualizar sua morfologia em uma resolução de célula única são ferramentas cruciais para o estudo de doenças endometriais. Este artigo descreve métodos para estabelecer culturas 3D de epitélio endometrial de camundongos e descreve técnicas para quantificar a expressão gênica e analisar a histologia dos organoides. O objetivo é fornecer um recurso que possa ser usado para estabelecer, cultivar e estudar a expressão gênica e as características morfológicas dos organoides epiteliais endometriais.

Introdução

O endométrio - o tecido mucoso do revestimento interno da cavidade uterina - é um tecido único e altamente dinâmico que desempenha papéis críticos na saúde reprodutiva de uma mulher. Durante a vida reprodutiva, o endométrio tem o potencial de sofrer centenas de ciclos de proliferação, diferenciação e quebra, coordenados pela ação concertada dos hormônios ovarianos - estrogênio e progesterona. Estudos de camundongos geneticamente modificados descobriram mecanismos biológicos básicos que sustentam a resposta endometrial aos hormônios e o controle da implantação embrionária, a decidualização das células estromais e a gravidez1. Estudos in vitro, no entanto, têm sido limitados devido a dificuldades na manutenção de tecidos endometriais primários de camundongos não transformados em culturas tradicionais de células 2D 2,3. Avanços recentes na cultura de tecidos endometriais como sistemas de órgãos 3D, ou organoides, apresentam uma nova oportunidade para investigar vias biológicas que controlam a regeneração e diferenciação de células endometriais. Sistemas organoides endometriais de camundongos e humanos têm sido desenvolvidos a partir de epitélio endometrial puro encapsulado em várias matrizes4,5, enquanto o endométrio humano tem sido cultivado como coculturas epiteliais/estromais livres de andaimes 6,7 e, mais recentemente, como assembloides epiteliais/estromais encapsulados em colágeno8 . O crescimento e o potencial regenerativo das culturas organoides epiteliais são apoiados por um coquetel definido de fatores de crescimento e inibidores de pequenas moléculas que foram determinados empiricamente para maximizar o crescimento e a regeneração dos organoides 4,5,9. Além disso, a capacidade de congelar e descongelar organoides endometriais permite o banco a longo prazo de organoides endometriais de camundongos e humanos para estudos futuros.

Camundongos geneticamente modificados revelaram as complexas vias de sinalização que controlam a gravidez precoce e a decidualização, e têm sido usados como modelos de perda de gravidez, câncer de endométrio e endometriose. Esses estudos genéticos foram amplamente alcançados com a deleção específica de células de alelos ladeados por loxP ("floxed") usando cre recombinases que são especificamente ativas em tecidos reprodutivos femininos. Esses modelos de camundongos incluem o amplamente utilizado receptor de progesterona-cre 10, que tem forte atividade de recombinase nos tecidos epiteliais e estromais endometriais, a lactoferrina i-cre, que induz a recombinação epitelial endometrial em camundongos adultos11, ou Wnt7a-cre, que desencadeia deleção epitelial-específica em tecidos derivados de Müller12 . A cultura de tecidos endometriais a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados como organoides 3D tem proporcionado uma excelente oportunidade para investigar a biologia endometrial e facilitar a identificação de fatores de crescimento e vias de sinalização que controlam a renovação e diferenciação celular endometrial13,14. Métodos para o isolamento e cultura de tecido endometrial de camundongos são descritos na literatura e relatam o uso de várias estratégias enzimáticas para o isolamento do epitélio uterino para posterior cultura de organoides epiteliais endometriais4. Embora a literatura anterior forneça uma estrutura crítica para protocolos de cultura de organoides epiteliais endometriais 4,5,6, este artigo fornece um método claro e abrangente para gerar, manter, processar e analisar esses organoides. A padronização dessas técnicas é importante para acelerar os avanços no campo da biologia reprodutiva das mulheres. Aqui, relatamos uma metodologia detalhada para a purificação enzimática e mecânica do tecido epitelial endometrial de camundongos para a subsequente cultura de organoides endometriais em um andaime de matriz de gel. Também descrevemos as metodologias para análises histológicas e moleculares a jusante dos organoides epiteliais endometriais de camundongos encapsulados em matriz de gel.

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Protocolo

O manejo de camundongos e estudos experimentais foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Baylor College of Medicine e diretrizes estabelecidas pelo NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Isolamento do epitélio uterino de camundongos usando métodos enzimáticos e mecânicos

NOTA: Esta seção descreve as etapas necessárias para estabelecer, passar, congelar e descongelar organoides endometriais epiteliais de camundongos usando um andaime de matriz de gel. Estudos anteriores determinaram que culturas ótimas de organoides endometriais de camundongos são estabelecidas a partir de camundongos durante a fase4 do cio, o que pode ser determinado pelo exame citológico de um swab vaginal15. Camundongos WT fêmeas adultas (6-8 semanas de idade, híbrido C57BL/6J e 129S5/SvEvBrd) foram utilizados para todos os experimentos. Os camundongos foram humanamente eutanasiados de acordo com as diretrizes aprovadas pela IACUC usando sedação de isoflurano seguida de desarticulação cervical. Uma vez que os ratos são sacrificados, os seguintes passos devem ser seguidos. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados aos materiais e soluções utilizados neste protocolo.

  1. Deixe a matriz de gel descongelar no gelo por aproximadamente 1-2 h antes do uso.
  2. Para dissecar o rato, use uma tesoura para fazer uma incisão de linha média no abdômen e descasque suavemente a pele para expor a camada peritoneal subjacente. Use fórceps para segurar a camada peritoneal e fazer incisões laterais com a tesoura para expor o conteúdo abdominal.
    1. Localize os chifres uterinos movendo suavemente as almofadas de gordura abdominal para o lado. Disseque-os primeiro segurando-os na junção cervical e usando uma tesoura para cortar ao longo da gordura mesentérica. Após a dissecção do útero do rato, remova completamente o tecido adiposo do chifre uterino com uma pequena tesoura.
      NOTA: Mantenha a esterilidade durante o isolamento celular, esterilizando todas as ferramentas de cirurgia antes do uso, pulverize o abdômen do rato com etanol a 70% e execute todas as etapas após a dissecção sob um capuz de cultura de tecido estéril.
  3. Corte cada chifre uterino em pequenos fragmentos, cada um medindo aproximadamente 4-5 mm.
  4. Coloque todos os fragmentos uterinos de um útero em um poço de uma placa de 24 poços contendo 0,5 mL de tripsina a 1%. Permita que a solução enzimática entre no lúmen uterino, causando separação enzimática do epitélio endometrial do estroma subjacente.
  5. Incubar a placa de 24 poços em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 °C por aproximadamente 1 h.
  6. Após a incubação de 1 h, transferir os fragmentos uterinos para uma placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 1 mL de solução tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco.
  7. Sob um microscópio de dissecção, use pinça fina e uma pipeta de 1 mL para separar mecanicamente o epitélio uterino do tubo uterino. Enquanto segura uma extremidade de um fragmento uterino com a pinça, passe suavemente a ponta da pipeta longitudinalmente através do fragmento, espremendo o epitélio para fora da outra extremidade do tubo uterino. Observe as folhas epiteliais separadas do fragmento uterino sob o microscópio de dissecção.
  8. Use a pipeta de 1 mL para coletar e transferir suavemente as folhas epiteliais para um tubo de 1,5 mL.
  9. Repita o processo para os fragmentos uterinos restantes, transferindo todas as folhas epiteliais para o mesmo tubo de coleta.
  10. Pellet as folhas epiteliais dissociadas por centrifugação por 5 min a 375 × g.
  11. Remova cuidadosamente o sobrenadante para evitar perturbar a pastilha celular.
  12. Ressuscite o pellet celular em 0,5 mL de 2,5 mg/mL de colagenase + 2 mg/mL de solução de DNase. Pipetar para cima e para baixo aproximadamente 10x, ou até que uma suspensão de célula única seja alcançada.
  13. Adicionar 0,5 mL de DMEM/F12 + 10% de soro fetal bovino (FBS) + antibióticos e centrifugar as células por 5 min a 375 × g.
    NOTA: Para obter informações adicionais sobre o antibiótico de amplo espectro utilizado para a cultura de células, consulte a Tabela de Materiais.
  14. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos. Centrifugar as células durante 5 minutos a 375 × g.

2. Processamento do compartimento estromal

NOTA: Esta seção descreve os protocolos necessários para isolar o compartimento estromal do endométrio de camundongos. Dado o crescente interesse em experimentos de co-cultura epitelial/estromal, é importante ser capaz de processar as populações de células estromais, além das células epiteliais que gerarão organoides.

  1. Uma vez que todo o epitélio tenha sido separado enzimática e mecanicamente dos fragmentos uterinos, as estruturas remanescentes semelhantes a tubos são os compartimentos "estromais/miometriais". Recolher este tecido numa colagenase de 2,5 mg/ml + DNase de 2 mg/ml em solução de HBSS.
  2. Incubar a amostra estromal/miometrial num agitador de 37 °C durante 15 min.
  3. Após a incubação, adicione 500 μL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos por rato e filtre os fragmentos não dissociados através de um filtro de células de 40 μm.
  4. Pellet as células por centrifugação durante 5 min a 375 × g.
  5. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos. Adicione a mistura gota a gota a 10 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos em uma placa de cultura celular de 10 cm. Incubar a placa a 37 °C numa incubadora de cultura de células humidificadas.
  6. Para gerar coculturas de células epiteliais e estromais endometriais de camundongos, seguir os métodos descritos para organoides endometriais humanos utilizando sistemas de matriz de colágeno ou livres de andaimes 6,8.
    NOTA: Embora essas técnicas ainda não tenham sido publicadas para camundongos, elas podem ser adaptadas com base nos protocolos publicados com endométrio humano.

3. Encapsulamento do epitélio uterino em matriz de gel para estabelecer organoides

NOTA: Mantenha a matriz de gel no gelo até que esteja pronta para ser usada.

  1. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um volume de matriz de gel que seja 20x maior que o do pellet celular (ou seja, se o pellet celular for de 20 μL, ressuspenda as células com 400 μL de matriz de gel). Ressuspenda o pellet com cuidado para evitar a introdução de bolhas.
  2. Deixe a matriz de gel/suspensão celular assentar à temperatura ambiente por ~10 min.
  3. Uma vez que a matriz de gel/suspensão celular se torne um gel semissólido, use uma micropipeta P200 com uma ponta larga de 200 μL para aspirar suavemente 25 μL da matriz de gel/suspensão celular. Dispense três cúpulas separadas de 25 μL por poço de uma placa de 12 poços e permita que a matriz de gel cure por 15 minutos em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 °C.
  4. Após a cura da matriz de gel, adicione 750 μL de meio organoide a cada poço contendo cúpulas de matriz de gel. Incubar a 37 °C numa incubadora de cultura de tecidos humidificada.
    NOTA: A formulação do meio organoide é anotada na Tabela de Materiais. Os organoides geralmente se formam dentro de 4 dias após a cultura inicial.

4. Análise da expressão gênica de organoides endometriais após tratamento com estradiol

NOTA: Esta secção descreve os métodos utilizados para traçar o perfil da expressão génica de organoides epiteliais endometriais utilizando qPCR em tempo real após o tratamento com estradiol (E2; ver Tabela 1). Como o endométrio está sob o controle cíclico do hormônio ovariano E2, testar a capacidade de resposta dos organoides ao E2 é uma medida importante da função fisiológica. Obtivemos RNA de alta qualidade e geramos mRNA suficiente para traçar o perfil da expressão gênica usando qPCR e/ou sequenciamento de RNA de nossos organoides epiteliais endometriais. Esta seção descreve como coletar organoides e processá-los para análise a jusante da expressão gênica. O meio de tratamento selecionado reflete o utilizado para tratar células endometriais cultivadas. No entanto, deve-se ressaltar que esse meio de tratamento pode ser otimizado de acordo, como é feito para o tratamento de culturas 3D endometriais humanas com hormônios 8,16,17.

  1. Cultive os organoides endometriais conforme descrito acima.
  2. Remova o meio organoide e substitua-o por 750 μL de meio de fome quatro dias após a semeadura. Incubar durante a noite.
  3. Na manhã seguinte, remova o meio de fome. Adicionar 750 μL de meio de tratamento contendo um veículo ou 10 nM E2. Incubar por 48 h.
  4. Prossiga com o isolamento de RNA seguindo o protocolo do fabricante do kit.

5. Análise histológica dos organoides endometriais

NOTA: A imagem das características morfológicas dos organoides endometriais é fundamental para avaliar o efeito celular de fatores de crescimento, manipulações genéticas ou inibidores de pequenas moléculas. Esta seção descreve as técnicas utilizadas para fixar, processar e visualizar organoides epiteliais endometriais usando corantes histológicas e coloração imunofluorescente de anticorpos.

  1. Preparar tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de paraformaldeído a 4% em 1x PBS. Coloque-os no gelo.
  2. Aspirar o meio dos poços da placa de 12 poços que contém os organoides.
  3. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL com uma ponta de corte, transfira 500 μL de paraformaldeído a 4% para cada poço e desprenda suavemente as cúpulas da matriz de gel do fundo da placa.
  4. Aspirar suavemente todas as cúpulas da matriz de gel para a ponta da pipeta e transferir para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  5. Fixar os organoides colocando-os num rotador a 4 °C durante a noite.
  6. Na manhã seguinte, centrifugar o tubo a 600 × g por 5 min para peletizar os organoides. Remova suavemente a solução de paraformaldeído a 4% com uma pipeta e descarte o produto. Lave os organoides 2x com etanol a 70%.
  7. Após a última lavagem, remova todos, exceto 50-100 μL de etanol do tubo. Deixe o tubo de lado.
  8. Coloque um tubo de gel de processamento de amostra em banho-maria e micro-ondas por ~ 30 s para derreter o gel. Certifique-se de que o gel de processamento da amostra não ferva monitorando a consistência do gel.
    NOTA: Uma vez que o gel de processamento da amostra é derretido, mas não fervendo quente, trabalhe rapidamente para encapsular os organoides.
  9. Transfira gel de processamento de amostra suficiente para cobrir toda a superfície do molde (aproximadamente 250 μL).
  10. Enquanto o gel de processamento da amostra ainda está fundido, transfira rapidamente os 50 μL de solução de etanol a 70% contendo os organoides. Certifique-se de que os organoides sejam afundados ou empurrados para a parte inferior do molde.
  11. Coloque o molde de histologia em um balde de gelo e permita que o gel de processamento da amostra esfrie e solidifique.
  12. Uma vez que o gel de processamento da amostra esteja completamente seco, transfira cuidadosamente o quadrado do gel de processamento da amostra para um saco de amostra, mantendo o controle do plano onde os organoides estão localizados.
  13. Colocar a bolsa em um histológico e processá-la utilizando métodos padronizados utilizados para fixação de formalina e incorporação de tecidos de parafina18.
  14. Após a fixação e incorporação em parafina, seção em seções de 5 μm usando um micrótomo19. Prossiga com os procedimentos padrão de coloração de hematoxilina e eosina (H & E) ou imunocoloração, conforme descrito abaixo.

6. Coloração de hematoxilina e eosina

  1. Desparafinizar as seções da seguinte forma: xileno, 2 x 10 min; 100% etanol, 2 x 3 min; 80% de etanol, 3 min; 60% etanol, 3 min; dH 2 O,2x 3 min; 1 min em hematoxilina; água da torneira (3 x 5 s); 1 min em eosina.
  2. Desidratar os cortes da seguinte forma: 60% de etanol, 3 min; 80% de etanol, 3 min; 95% de etanol, 3 min; 100% etanol, 2 x 3 min; xileno, 2 x 15 min.
  3. Monte usando o meio de montagem.

7. Coloração por imunofluorescência

  1. Desparafinizar as seções conforme descrito na etapa 6.1.
  2. Realizar a recuperação de antígenos
    1. Submerja as lâminas em solução de recuperação de antígeno em um recipiente seguro para micro-ondas.
    2. Micro-ondas em fogo alto por 20 min, usando intervalos de 5 min para garantir que a solução não ferva.
  3. Após a conclusão da etapa de recuperação de antígeno de 20 minutos, permita que as lâminas esfriem no gelo por 40 minutos enquanto ainda estão submersas no tampão de recuperação de antígenos.
  4. Lave as lâminas com 1x TBST por 3 min
  5. Bloquear as lâminas incubando em BSA a 3% em TBST por 1 h à temperatura ambiente.
  6. Incubação de anticorpos primários
    1. Diluir o anticorpo em BSA a 3% em TBST (1:50-1:1.000, dependendo de Ab).
    2. Incubar durante a noite a 4 °C numa câmara humidificada.
    3. Lave 3 x 5 min com TBST.
  7. Incubação secundária de anticorpos
    1. Diluir o anticorpo em 3% de BSA (em TBST) (1:250) ou em soro de burro normal a 5%.
    2. Incubar por 1 h à temperatura ambiente (RT) no escuro, uma vez que o anticorpo é conjugado a um fluoróforo.
  8. Coloração nuclear
    1. Diluir 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:1.000 em TBST.
    2. Incubar por 5 min no RT.
    3. Lave 2 x 5 min com TBST.
  9. Montagem
    1. Use uma gota de meio de montagem para montar a tampa.
    2. Sele a tampa usando esmalte no dia seguinte.

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Resultados

Imagens de contraste de fase de organoides endometriais de camundongos
Estabelecemos organoides do epitélio endometrial de camundongos WT, conforme descrito no protocolo anexado (ver diagrama na Figura 1). Após a dissociação enzimática do epitélio endometrial do rato, as folhas epiteliais foram separadas mecanicamente das células estromais uterinas e posteriormente dissociadas com colagenase para gerar uma suspensão unicelular. Se realizado corretamente, este mét...

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Discussão

Aqui, descrevemos métodos para gerar organoides epiteliais endometriais a partir do endométrio de camundongos e os protocolos rotineiramente utilizados para sua análise a jusante. Os organoides endometriais são uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos que controlam doenças relacionadas ao endométrio, como endometriose, câncer de endométrio e falha de implantação. Estudos de referência publicados em 2017 relataram as condições para a cultura de culturas de longo prazo e renováveis de organoides end...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos à Dra. Stephanie Pangas e ao Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) pela leitura crítica e edição do nosso manuscrito. Os estudos foram apoiados pelas bolsas R00-HD00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) e R01-HD110038 (M.M.M.), e pelo NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. possui um Prêmio de Gravidez de Próxima Geração do Burroughs Wellcome Fund.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Organoid Media Formulation
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-freeCorning354230100%
Trypsin from Bovine PancreasSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 supplementLife Technologies175020481X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165-5G1.25 mM
L-glutamineLife Technologies250300242 mM
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01Tocris2939500 nM
Recombinant human EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
Recombinant human NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
Recombinant human FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
Recombinant human HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR&D systems5036-WN200 ng/mL
Other supplies and reagents
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher14190-2501X
HBSS, no calcium, no magnesiumThermoFisher141701121X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)Fisher Scientific#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µmFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)Genesee Scientific11-331
Trizol reagentInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol redThermoFisher11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal strippedSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM GradeVWR157104%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue CassettesFisher Scientific1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base MoldsFisher Scientific64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount Mounting MediumFisher Scientific50-277-97
Epredia Nylon Biopsy BagsFisher Scientific6774010
HistoGel Specimen Processing GelVWR83009-992
Hematoxylin solution PremiumVWR95057-844
Eosin Y (yellowish) solution PremiumVWR95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7.4GenDEPORTT80561X
Citric acid Sigma AldrichC0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Solution (1 mg/mL)ThermoFisher622481:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LabsH-1000-10
Clear Nail PolishFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific22037246
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I) DSHBTROMA-I 1:50 dilution
Vimentin AntobodyCell Signaling5741S1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo MicroscopeZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital cameraZEISS
Primer SequenceForward (5'-3')Reverse (5'-3')_
Lipocalin 2 (Lcn2)GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)TGAGGCCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCTTCTT

Referências

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