In vitro Método para Estudo de Diferenças Sexuais em Células Caliciformes Conjuntivais

Resumo

O meio livre de vermelho fenol/soro fetal bovino é uma opção melhor do que o RPMI avançado para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das células caliciformes da conjuntiva no estudo de diferenças baseadas no sexo.

Resumo

O olho seco é uma doença multifatorial que afeta a saúde da superfície ocular, com prevalência profundamente maior em mulheres. A ruptura da mucina formadora de gel que é secretada pelas células caliciformes conjuntivais (CGCs) na superfície ocular contribui para múltiplas doenças da superfície ocular. A eliminação de hormônios sexuais exógenos é essencial para a obtenção de resultados consistentes durante o estudo in vitro de diferenças sexuais em CGCs. Este trabalho descreve um método para minimizar a presença de hormônios exógenos no estudo de diferenças baseadas no sexo em CGCs, mantendo sua função fisiológica. CGCs de doadores humanos post-mortem de ambos os sexos foram cultivados a partir de pedaços da conjuntiva em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino (SFB) (referido como meio completo) até a confluência. Cerca de 48 h antes do início dos experimentos, as CGCs foram transferidas para o meio RPMI sem vermelho de fenol ou SFB, mas com BSA a 1% (referido como meio livre de vermelho fenol). A função celular normal foi estudada medindo-se o aumento da [Ca 2+] ([Ca ²⁺]i) intracelular após estimulação com carbacol (Cch, 1 x ^10-4 M) usando microscopia de fura 2/acetoximetil (AM). O resultado mostra que os CGCs mantiveram função normal no meio livre de fenol após 48 h. Nenhuma diferença significativa na resposta [Ca²⁺]_i foi observada entre o meio RPMI livre de fenol vermelho e o meio completo após estimulação com Cch. Portanto, recomendamos o uso do meio RPMI livre de vermelho fenol com BSA a 1% para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das CGCs no estudo de diferenças baseadas no sexo.

Introdução

Diferenças baseadas no sexo afetam múltiplos processos da superfície ocular ^1,2,3. A manifestação clínica dessas diferenças baseadas no sexo é a diferença na prevalência de muitas doenças da superfície ocular entre homens e mulheres, como olho seco e conjuntivite4,5,6. Evidências sugerem que as diferenças baseadas no sexo surgem de múltiplos níveis biológicos, incluindo os diferentes perfis de genes nos cromossomos X e Y⁷ e os efeitos dos hormônios⁸. Estudar a base molecular das diferenças baseadas no sexo pode fornecer uma melhor compreensão da doença e, eventualmente, melhorar a medicina personalizada.

A superfície ocular compreende o filme lacrimal sobrejacente, córnea e conjuntiva. Diferenças baseadas no sexo são observadas em múltiplos componentes da superfície ocular, incluindo o filme lacrimal 9,10, a córnea 11, a glândula lacrimal ^12,13 e as glândulas meibomianas que também secretam lágrimas ¹². Numerosos estudos mecanísticos têm investigado o efeito dos hormônios sexuais sobre a córnea e seus componentes associados^14,15; no entanto, pouco se sabe sobre as diferenças baseadas no sexo na conjuntiva e suas células caliciformes. A conjuntiva é uma membrana mucosa que cobre a esclera e a superfície interna da pálpebra. O epitélio da conjuntiva é composto por células escamosas estratificadas, não queratinizantes, multicamadas¹⁶.

Dentre as células escamosas estratificadas da conjuntiva, encontram-se as células caliciformes (CGCs) intercaladas na superfície apical do epitélio. Essas células caliciformes caracterizam-se pelo grande número de grânulos secretores localizados no polo apical¹⁷. Os CGCs sintetizam e secretam a mucina formadora de gel MUC5AC para hidratar a superfície ocular e lubrificá-la durante o piscar¹⁷. A secreção de mucina é fortemente regulada pela [Ca 2+] intracelular ([Ca²⁺]i) e pela ativação da quinase regulada por sinal extracelular dependente de Ras (ERK1/2)¹⁸. A incapacidade de secretar mucina resulta em ressecamento da superfície ocular e sequelas de anormalidades patológicas. Em uma superfície ocular inflamada, entretanto, a extensa secreção de mucina estimulada por mediadores inflamatórios leva à percepção de aderência e coceira ocular¹⁹. Essas condições com secreção perturbada de mucina acabarão levando à deterioração da superfície ocular.

O papel das células caliciformes como a principal fonte de mucina ocular tem sido reconhecido^{há muito tempo20}, no entanto, as diferenças baseadas no sexo na regulação da mucina em ambos os estados fisiológicos e patológicos permanecem desconhecidas. Um sistema in vitro seria útil para monitorar a função das células caliciformes sem o efeito hormonal ou com um nível precisamente controlado de hormônios sexuais. Embora uma linhagem celular epitelial conjuntival tenha se desenvolvido²¹, não há linhagem de células caliciformes com secreção funcional de mucina disponível. Portanto, modificamos nossa cultura primária de CGC humana desenvolvida para estabelecer um método para analisar a diferença baseada em sexo in vitro¹⁶, e apresentá-la como abaixo.

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Protocolo

Todo tecido humano foi doado ao banco de olhos com consentimento prévio informado e autorização do doador para uso em pesquisas científicas. O uso do tecido conjuntival humano foi revisado pelo Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee e determinado como isento e não atendendo à definição de pesquisa com seres humanos.

1. Cultura primária de células caliciformes humanas

1. Do banco de olhos, obtém-se tecido conjuntival humano¹⁶.
2. Preparar o meio de cultura, meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 2 mM de glutamina, 2 mM de aminoácidos não essenciais (NEAA), 2 mM de piruvato de sódio, 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina e 2 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES).
3. Realizar cultura de células primárias conforme descrito abaixo.
   1. Pique o tecido em pedaços de 1 mm 3 com bisturi estéril e semente em placas de cultura em uma capela^de cultura. Semeando quatro pedaços em cada poço de uma placa de 6 poços, em 1 mL de meio RPMI completo. Embora a orientação da peça de tecido não afete o crescimento celular, certifique-se de que as peças aderem à placa de cultura para garantir o crescimento usando a lâmina de bisturi.
   2. Colocar os pedaços de tecido na incubadora contendo 95% de ar e 5% de CO₂ a 37 °C. Atualizar o mesmo meio de cultura a cada dois dias até que as células caliciformes atinjam 70%-80% de confluência em aproximadamente 14 dias. Remova o tampão de tecido aproximadamente 72 h após a semeadura.
      NOTA: O epitélio conjuntival humano contém principalmente células escamosas estratificadas e células caliciformes. RPMI é um meio seletivo para células caliciformes. Raramente em cultura de CGC humano, os fibroblastos podem crescer por volta do 7º dia. O método de purificação da cultura foi descrito em publicação anterior ²².
   3. Verificar a pureza da cultura de GC usando microscopia de imunofluorescência (IFM) visando citoqueratina (CK)7 e lectina-1 de Helix pomatia (HPA-1)²² seguindo o método padrão de IFM descrito em¹⁹; veja resultados representativos.

2. Passagem das células caliciformes da conjuntiva humana e preparação experimental

1. Enxaguar as células com PBS (pH = 7,4) e desprender as células com tripsinização usando tripsina 0,05% em EDTA 1x. Observe as células a cada minuto sob um microscópio. Uma vez que as células se desprendem do fundo, desative a tripsina usando mídia RPMI completa.
2. Centrifugar as células a 150 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet de células no meio de cultura RPMI completo e resemeie em placas de cultura com fundo de vidro para medição de [Ca²⁺]_i . O volume total do meio é de 300 μL por prato. Mantenha a mídia no centro da parte de vidro do prato.
3. Eliminação de hormônios em meios de cultura: O meio de cultura pode conter hormônios sexuais, especialmente o SFB. Como o vermelho de fenol contido no RPMI-1640 tem atividade estrogênica ^23,24, substitua o meio RPMI pelo meio RPMI livre de vermelho fenol e ajuste o pH para ^7,45 usando tiras de pH após o preparo do meio completo. O HEPES contido no meio completo mantém o pH em uma faixa relativamente pequena.

3. Ensaio de fura-2/acetoximetil (AM) para medição de [Ca²⁺]_i

1. Execute o carregamento do Fura-2/AM conforme descrito abaixo.
   1. Incubar as células em placas com fundo de vidro por 1 h a 37 °C, atmosfera ambiente, e protegidas da luz com tampão de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB; contendo 119 mM de NaCl, 4,8 mM de KCl, 1,0 mM de CaCl 2, 1,2 mM de MgSO₄ e 25 mM de NaHCO₃) com 0,5% de HEPES (Tabela 1), mais 0,5% de BSA, 0,5 μM de fura-2/AM, ácido plurônico F127 de 8 μM e sulfinpirazona de 250 μM.
   2. Ajuste o pH para 7,45 usando um medidor de pH antes de usar. Após o carregamento com fura-2/AM, lavar as células com KRB contendo 250 μM de sulfinpirazona imediatamente antes da medição de [Ca²⁺]_i .
2. Execute a medição de [Ca²⁺]_i conforme descrito abaixo.
   1. Coloque as placas contendo as células carregadas com fura-2 sob o microscópio, localize um campo representativo contendo entre 20 células e 50 células em aumento de 200x e use a função Freehand para desenhar um contorno ao redor de cada célula para indicar ao software o que é e o que não é fluorescência de fundo.
   2. Aguarde até que o software subtraia automaticamente a fluorescência de fundo da medição e clique no botão Iniciar experimento .
   3. Em seguida, aguardar entre 8 s e 15 s para estabelecer os níveis basais de cálcio nas células antes de pipetar cuidadosamente no agonista de interesse. Continue a medir por pelo menos 120 s após a adição do agonista ou até que os níveis de cálcio tenham retornado à linha de base.
3. Execute a análise de dados conforme descrito abaixo.
   1. Use a mudança no pico [Ca²⁺]_i para representar as ações dos estímulos. Calcular o nível médio de cálcio basal em cada célula a partir dos primeiros 8-15 s de medidas. Se esse número for igual ou superior a 500 nM, remova essa célula do conjunto de dados, pois ela está passando por apoptose ou necrose.
   2. Uma vez calculado o nível basal de cada célula, subtraia essa quantidade do máximo medido [Ca²⁺]_i para a mesma célula. Média da variação no pico [Ca²⁺]_I para todas as células de um determinado prato.
   3. Para garantir a consistência, registre as respostas de cada estímulo em duplicata e calcule o valor médio das mudanças no pico [Ca²⁺]_i obtidas das duplicatas como um ponto de dados da amostra humana individual. Comparar os dados de diferentes grupos usando um método apropriado de análise de dados baseado no desenho do estudo.

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Resultados

Os CGCs humanos em cultura primária crescem até 80% de confluência em aproximadamente 14 dias. O tipo celular foi confirmado pela coloração por imunofluorescência com anticorpos contra os marcadores caliciformes CK7 e HPA-1²⁵ (Figura 1). Embora a remoção de FBS do meio possa eliminar os hormônios sexuais, a falta de FBS poderia potencialmente afetar a resposta celular. Para verificar o método de eliminação hormonal, um agonista colinérgico (carbachol, Cch...

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Discussão

A investigação das diferenças sexuais nos tecidos oculares ajuda a compreender os processos das doenças, especialmente o olho seco e a conjuntivite alérgica, que afetam desproporcionalmente um sexo ^4,5,6. Embora modelos animais possam ser utilizados para esses estudos, dados obtidos diretamente do tecido humano são essenciais devido à maior similaridade com as células humanas in vivo. Os tecidos conjuntivais uti...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin with 1x EDTA	Gibco (Grand Island, NY)	25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid	Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)	BP310-500
Advanced RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	12633020
carbachol	Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)	144.86
Fetal Bovin Serum	R&D (Minneapolis, MN)	S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	F1221
Human conjunctival tissue	Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)	N/A
inorganic salt for KRB buffer	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)		Any brand will work
L-glutamine	Lonza Group (Basel, Switzerland)	17-605F
non-essential amino acids	Gibco (Grand Island, NY)	11140-050
penicillin/streptomycin	Gibco (Grand Island, NY)	15140-122
phenol red-free RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	11835055
Pluronic acid F127	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	P2443-250G
RPMI-1640 culture medium	Gibco (Grand Island, NY)	21875034
scalpel	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	12460451	Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvate	Gibco (Grand Island, NY)	11360-070
sulfinpyrazone	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	S9509-5G