Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Resumo

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Resumo

A aneuploidia é a principal anormalidade genética que causa aborto espontâneo precoce e falha na gravidez em humanos. A maioria dos erros na segregação cromossômica que dão origem à aneuploidia ocorre durante a meiose em ovócitos, mas por que a meiose de ovócitos é propensa a erros ainda não é totalmente compreendida. Durante a divisão celular, as células evitam erros na segregação cromossômica ativando o ponto de verificação de montagem do fuso (SAC). Este mecanismo de controle baseia-se na detecção de ligações cinetócoro-microtúbulo (MT) e na detecção da tensão gerada pelas fibras do fuso. Quando os KTs são desconectados, o SAC é ativado e impede a progressão do ciclo celular. O SAC é ativado primeiramente pela MPS1 quinase, que desencadeia o recrutamento e a formação do complexo de pontos de verificação mitóticos (CCM), composto por MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1. Em seguida, o CCM se difunde no citoplasma e sequestra o CDC20, um ativador de complexo/ciclossomo promotor de anáfases (APC/C). Uma vez que os KTs se ligam aos microtúbulos e os cromossomos são alinhados na placa metafásica, o SAC é silenciado, o CDC20 é liberado e o APC/C é ativado, desencadeando a degradação da ciclina B e da securina, permitindo assim o início da anáfase. Em comparação com as células somáticas, o SAC nos oócitos não é tão eficaz porque as células podem sofrer anáfase, apesar de terem KTs desligados. Entender por que o SAC é mais permissivo e se essa permissividade é uma das causas dos erros de segregação cromossômica nos oócitos ainda precisa de mais investigação. O presente protocolo descreve as três técnicas para avaliar de forma abrangente a integridade do SAC em ovócitos de camundongos. Essas técnicas incluem o uso de nocodazol para despolimerizar MTs para avaliar a resposta do SAC, o rastreamento do silenciamento do SAC seguindo a cinética da destruição da Securin e a avaliação do recrutamento de MAD2 para KTs por imunofluorescência. Juntas, essas técnicas investigam os mecanismos necessários para produzir óvulos saudáveis, fornecendo uma avaliação completa da integridade do SAC.

Introdução

A aneuploidia, que surge de erros na segregação cromossômica, é a principal causa de abortos espontâneos precoces e está altamente ligada a erros na meiose¹. A meiose é distinta da mitose porque consiste em duas rodadas de divisão celular sem uma etapa intermediária de replicação do DNA. Na meiose I, os cromossomos homólogos se separam, enquanto as cromátides irmãs permanecem juntas. Nos ovócitos, essa etapa é propensa a erros, levando à produção de óvulos aneuploides².

Para evitar erros de segregação cromossômica, a maioria dos tipos de células ativa um mecanismo de vigilância que pausa o ciclo celular, chamado de ponto de verificação de montagem do fuso (SAC). Esse mecanismo detecta os anexos cinetócoro (KT)-microtúbulo (MT) e a tensão é gerada quando os cromossomos são orientados de maneira bipolar³. Os cinetocoros não anexados desencadeiam uma resposta SAC que começa com o recrutamento do MPS1, o regulador mestre do SAC, para os cinetocoros ^3,4. O MPS1 inicia o recrutamento de outros componentes do SAC, atuando como uma plataforma para formar o complexo de ponto de verificação mitótico (CCM). O CCM, composto por MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1, difunde-se no citoplasma e inibe a ativação da APC/C sequestrando seu ativador CDC20. Uma vez que todos os cinetocoros estão estáveis ligados aos MTs e os cromossomos estão alinhados na placa de metáfase, o SAC é silenciado e o MCC desmonta e libera o CDC20, permitindo assim a ativação do APC/C. A APC/C ativa degrada a Securin e a Ciclina B, dois passos fundamentais no desencadeamento do início da anáfase ^5,6. Nas células somáticas, o SAC é rigoroso porque é ativado por um único cinetócoro desanexado e é suficiente para induzir a parada do ciclo celular⁶. Entretanto, durante a meiose dos ovócitos, o SAC é mais permissivo, e os ovócitos podem entrar na anáfase I com um ou mais cinetocoros não ligados 6,7,8,9,10. Entender por que o SAC é mais permissivo em ovócitos é uma área contínua de foco no campo. Mecanismos que causam defeitos na ativação do SAC ou silenciamento do SAC podem levar a erros na segregação cromossômica ou parada prolongada do ciclo celular e morte celular. Portanto, avaliar os mecanismos que mantêm a integridade do SAC em oócitos é importante para entender o processo de formação de ovos euploides saudáveis.

Este protocolo descreve técnicas para avaliar de forma abrangente a integridade do SAC na meiose de ovócitos de camundongos, examinando diferentes etapas críticas do ponto de verificação. Primeiramente, descreve-se a avaliação da resposta do SAC após a indução da ativação do SAC. Essa ativação é obtida por meio da geração de cinetocoros desanexados utilizando nocodazol, fármaco que despolimeriza MTs¹¹. Em segundo lugar, um método para monitorar o silenciamento de SAC é descrito rastreando a dinâmica da degradação de Securin durante a maturação de ovócitos. Finalmente, um ensaio baseado em imunofluorescência é empregado para medir o recrutamento de MAD2, um dos componentes do CCM, para cinetocoros. Juntos, esses ensaios avaliam de forma abrangente a integridade do SAC durante a maturação meiótica dos ovócitos.

Protocolo

Todos os ratos utilizados nesses protocolos foram alojados e criados de acordo com o Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Rutgers (Protocolo 201702497) e as diretrizes do National Institutes of Health. Esses órgãos reguladores aprovaram todos os procedimentos experimentais envolvendo estudos em animais. Todos os camundongos utilizados no presente estudo foram fêmeas com FC-1 de 6-8 semanas de idade.

1. Preparação experimental

1. Antes de iniciar as avaliações do SAC, coletar oócitos de camundongos seguindo o relatório publicado anteriormente¹². Divida os ovócitos coletados em três grupos de tamanho uniforme e mantenha-os em meios de cultura de Chatot, Ziomek e Bavister (CZB) contendo 2,5 μM de milrinona (ver Tabela de Materiais) para evitar a retomada meiótica¹³.
   NOTA: Composição CZB: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH₂PO₄; 1,2 mM MgSO 4-7H ₂O; Piruvato 0,27 mM; 1,7 mM CaCl₂; 30,8 mM de Ácido DL-Láctico; 7 mM de Taurina; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO₃; Gentamicina; e 0,3% BSA.
2. Preparar o cRNA para microinjeção conforme descrito anteriormente^12,14. Amplificar o gene Securin de camundongo a partir do cDNA clonado de oócitos de vesículas germinais de camundongos, seguido de subclonagem no vetor pMDL2 contendo sequência Gfp^15,16.
   1. Para preparar o cRNA Securin-Gfp, linearize o plasmídeo com digestão Nde I. Realizar transcrição in vitro utilizando a RNA polimerase T3 e purificando o cRNA¹⁶.
      NOTA: Conservar o ARNc em alíquotas de 2-3 μL a -80 °C até à sua utilização.

2. Tratamento com nocodazol e imagens ao vivo

1. Preparar 1 mL de meio de cultura (CZB) contendo 5 μM de nocodazol (NOC), 1 mL de meio de cultura com 5 μM de NOC mais 0,5 μM de reversina (NOC + REV) e 1 mL de meio de cultura com dimetilsulfóxido (DMSO) (1:2000) como controle (ver Tabela de Materiais).
2. Para maturação de ovócitos e imagens vivas, use uma placa de 96 poços pré-aquecida na incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ e 80% de umidade. No primeiro poço, carga de 150 μL do tratamento DMSO controle; no segundo poço, carga de 150 μL de tratamento NOC; e no terceiro poço, carga de 150 μL de NOC + tratamento REV. Mantenha a placa na incubadora nas mesmas condições acima até que seja necessário.
   NOTA: Na placa de 96 poços, evite usar a primeira linha e a primeira coluna porque a sombra da borda interfere na qualidade das imagens.
3. Para iniciar a maturação meiótica, remova a milrinona. Ao visualizar os ovócitos sob um estereomicroscópio usando ampliação entre 30x-64x, lave a milrinona para fora do meio transferindo sequencialmente os oócitos através de seis gotas de 100 μL de meios de cultura livres de milrinona contendo DMSO e coloque-os no poço correspondente da placa de 96 poços usando uma pipeta operada à mão ou à boca.
   1. Conte os ovócitos pegando-os usando uma pipeta operada à mão ou à boca e entregando-os à próxima gota para evitar perder nenhuma. Os ovócitos são únicos, grandes (~ 80 μm de diâmetro) e células redondas. O núcleo aparecerá como um botão no centro da célula, e a membrana e a zona pelúcida cercam o ovócito.
      NOTA: Transfira os ovócitos entre gotas enquanto move a menor quantidade de líquido possível. Isso permite a remoção ideal da milrinona dos meios de cultura. Se os ovócitos não retomarem a meiose, é provável que a milrinona não tenha sido efetivamente removida.
4. Repita o mesmo processo (passo 2.3) para o tratamento NOC e NOC + REV.
5. Fotografe os ovócitos usando um microscópio de campo brilhante equipado com uma câmara incubadora com um ambiente controlado sob estas condições: 37 °C, 5% de CO₂ e 80% de umidade. Capturar imagens no plano médio dos ovócitos em intervalos de 20 min por 24 h.
6. Quantifique o número de ovócitos que extrudem um corpo polar (PB), identificando as células que passam por citocinese assimétrica. O resultado será uma pequena célula (PB) ao lado do ovo e dentro da zona pellúcida compartilhada. Visualize as imagens usando o software de imagem (ImageJ, consulte Tabela de materiais).
7. Importe a sequência de imagens para o software de análise de imagens e avance os quadros até que uma ou mais células passem por citocinese assimétrica. Calcular a porcentagem de ovócitos que extrudem um PB do total de oócitos¹⁷.

3. Monitorização do padrão de degradação do Securin-gfp durante a maturação meiótica

1. Centrífuga 3 μL de cRNA Securin-Gfp (etapa 1.2) a 19,283 x g durante 30 min a 4 °C¹⁸.
   NOTA: Use o sobrenadante para evitar a carga de impurezas que possam causar bloqueio da agulha durante a microinjeção.
2. Siga passo a passo a microinjeção de ovócitos, amplamente descrita na referência¹². Microinjetar ovócitos presos por prófase I com 100 ng/μL de cRNA Securin-gfp preparados na etapa 1.2.
3. Após a microinjeção, permita que os ovócitos recuperem e traduzam o RNA na incubadora de CO₂ por pelo menos 3 h. Verifique a expressão observando os oócitos em um sistema automatizado de imagem de fluorescência multicanal (consulte Tabela de Materiais) para visualizar o sinal de GFP.
4. Conforme descrito na etapa 2.2, carregar 150 μL de meios de cultura com ou sem 5 μM de nocodazol e 150 μL de meio de cultura com 0,5 μM de reversina em três poços diferentes de uma placa de 96 poços.
5. Lave os ovócitos microinjetados através de seis gotas de meios de cultura sem milrinona e transfira 1/3 dos ovócitos para cada tratamento.
6. Manter a placa na incubadora a 37 °C, com 5% de CO₂ e 80% de humidade até que os ovócitos retomem a meiose, cerca de 3 h após a lavagem da milrinona.
   NOTA: Use um estereomicroscópio com ampliação entre 30x-64x para avaliar a quebra do envelope nuclear como uma característica da retomada meiótica.
7. Registar imagens de maturação de ovócitos utilizando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmara de incubadora, conforme descrito no passo 2.6. Use configurações de campo brilhante para encontrar os oócitos no poço. Use um filtro 488 para detectar o sinal Securin-gfp e ajustar a intensidade da fluorescência para evitar a superexposição das células.
   1. Se o sistema de imagem for automatizado, salve as posições dos ovócitos em cada poço. Como o Securin-gfp é distribuído uniformemente no citoplasma, capture imagens no plano médio dos oócitos em intervalos de 20 min por 24 h. Para capturar grupos de oócitos em uma imagem, use uma lente objetiva de ampliação mais baixa, como 10x.
8. Use um software de análise de imagem para quantificar a destruição do Securin-gfp. Abra as imagens do canal GFP. Comece no ponto de tempo 1. No software de análise preferido, use uma ferramenta de seleção ou forma para marcar cada ovócito e gerar uma região de interesse (ROI) para cada célula.
   1. Use o mesmo ROI para selecionar uma área de plano de fundo a ser subtraída posteriormente. Meça a intensidade de pixels de GFP em cada ROI.
9. Usando os ROIs para cada ovócito gerado na etapa 3.8, meça a intensidade da GFP em todos os pontos de tempo.
   NOTA: Em alguns programas de software, uma guia "Analisar" permite a seleção da função Medir.
   1. Em seguida, avance para o próximo período de tempo e repita esse processo para medir a intensidade da GFP em cada período de tempo. Por fim, para cada valor de GFP, subtraia a medição do ROI no plano de fundo selecionado na etapa 3.8. Esta análise dará um valor para a intensidade do Securin-gfp para cada ovócito em cada ponto de tempo.
10. Extrair parâmetros diferentes do padrão de destruição de Securin: (a) a hora em que a degradação de Securin-gfp começou. Isso informa quando o silenciamento do SAC começou; b) A hora do sinal mínimo de Securin-gfp. Isso informa quando o silenciamento do SAC caiu abaixo de um nível limite para permitir alta ativação do APC/C e degradação total do Securin-GFP; c) A taxa de destruição do Securin-gfp¹⁹. Isso informa a rapidez com que a atividade do SAC cai abaixo de um nível limite para ativação do APC/C e degradação do Securin-GFP.

4. Recrutamento de MAD2 em cinetocoros por imunofluorescência durante a maturação meiótica

NOTA: Para coleta e maturação de ovócitos, consulte o relatório¹² publicado anteriormente.

1. Dividir os ovócitos em três grupos. Transfira cada grupo de ovócitos para gotas de 100 μL de meios de cultura livres de milrinona. Cubra as gotas com óleo mineral e coloque-as na incubadora (37 °C, 5% de CO₂ e 80% de umidade) por 3 h, 5 h e 7 h para atingir o estágio inicial da prometáfase I, a prometáfase I tardia e a metáfase I, respectivamente.
   NOTA: Coloque cada ponto de tempo em um prato diferente para evitar tirar o mesmo prato da incubadora várias vezes, o que afeta o tempo regular de maturação meiótica.
2. Nos pontos de tempo designados, fixar os ovócitos transferindo-os para gotas de 500 μL de PFA a 2% em tampão PHEM 1x por 20 min à temperatura ambiente, usando um prato de vidro de 9 poços, conforme descrito anteriormente²⁰. Em seguida, transfira as células para um poço limpo contendo uma gota de 500 μL de solução de bloqueio (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN₃).
   NOTA: Composição PHEM: 60 mM PIPES; HEPES de 25 mM; 10 mM EGTA; e 2 mM MgCl₂.
   NOTA: Pode-se parar neste ponto e armazenar os ovócitos em solução de bloqueio na placa de 9 poços a 4 °C até o momento conveniente para completar a imunofluorescência.
3. Para continuar a detecção de MAD2, transfira os ovócitos para um poço limpo contendo uma gota de 500 μL de solução de permeabilização (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN₃). Incubar por 20 min à temperatura ambiente e, em seguida, transferir as células para um novo poço de solução de bloqueio e incubar por 10 min.
4. Para o restante das etapas de imunofluorescência, utilize uma pálpebra de 96 poços com reentrâncias, conforme descrito anteriormente²⁰. Use uma câmara escura umidificada para evitar a exposição à luz e a evaporação. Transferir os ovócitos para uma gota de 30 μL de solução bloqueadora com anticorpo anti-MAD2 (1:1000, coelho) e anticorpo anticentromérico (ACA) (1:30, humano) (ver Tabela de Materiais) e incubar durante 2 h à temperatura ambiente.
   NOTA: A tampa de prato de 96 poços permite espaço para o processamento de várias proteínas e grupos ao mesmo tempo.
5. Para lavar o excesso de anticorpos primários, transfira as células para uma gota de 30 μL de 1x tampão PHEM suplementado com Triton a 0,5% e incube por 10 min na câmara umidificada. Repita esta etapa mais duas vezes.
6. Realizar a quarta lavagem, transferindo as células para uma gota de 30 μL de 1x tampão PHEM sem 0,5% 1x Triton, e incubar por 10 min.
7. Transfira as células para uma gota de 30 μL de solução bloqueadora contendo anticorpos secundários, tais como anti-humano-633 (1:200) e anti-coelho-568 (1:200) (ver Tabela de Materiais) e incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
   NOTA: Escolha a combinação de fluoróforos com base em seus lasers ou filtros de microscópio.
8. Para lavar o excesso de anticorpos secundários, repita os passos 4.5-4.6.
9. Para montar as células na lâmina do microscópio, transfira as células para uma gota de 10 μL de meio de montagem contendo DAPI (0,1 mg/mL) (ver Tabela de Materiais). Adicione pequenos pontos de vaselina a cada canto da tampa, coloque-os cuidadosamente em cima da gota do meio de montagem e pressione lentamente para distribuir. Use esmalte transparente para selar a tampa para o slide. Para obter uma descrição mais detalhada do processo de montagem, consulte a referência²⁰.
10. Imagem cinetocoros usando um microscópio confocal (ver Tabela de Materiais) equipado com uma objetiva de 40x ou 63x. Usando o sinal ACA, determine a faixa z que permite a imagem de toda a área cromossômica.
    NOTA: Um zoom óptico de 4,0 e um tamanho de passo z de 0,5 μm podem ser usados em alguns sistemas de imagem. Esses parâmetros podem variar de sistema para sistema, e a otimização será necessária.
11. Analise a intensidade de MAD2 em cinetocoros usando um software de análise de imagens. Faça uma projeção máxima de pilha z e, em seguida, divida os canais.
12. Primeiro, crie uma máscara usando o canal ACA selecionando o canal ACA para estabelecer um limite que identifique todos os sinais de cinetócora. Vá para a guia Editar e crie uma seleção. Em seguida, crie um ROI com essa seleção.
13. Selecione o canal MAD2 e traga a seleção criada na etapa 4.12. Selecione um método de limite que melhor se adapte ao sinal MAD2. Meça a intensidade.
    NOTA: Selecione o método limiar no tratamento de controle e mantenha-o constante ao analisar diferentes tratamentos.
14. Para fazer cálculos de intensidade relativa de pixels, divida a intensidade de cada célula pela intensidade média dos ovócitos WT no experimento.

Resultados

Avaliação da responsividade do SAC pelo tratamento com nocodazol
O objetivo deste experimento é avaliar a ativação e a força do SAC. Ao usar nocodazol para despolimerizar os microtúbulos fusiformes, todos os cinetocoros serão desligados, o que causará uma parada do ciclo celular mediada por SAC. No presente sistema de imagem, os oócitos controle tratados com DMSO extruderam um corpo polar por volta de 14 h após a liberação da milrinona (Figura 1, painéis sup...

Discussão

O ponto de verificação de montagem do fuso é um mecanismo de controle crítico durante a divisão celular projetado para evitar erros de segregação cromossômica. Ele permite que a célula tenha tempo suficiente para corrigir anexos KT-MT inadequados. A meiose em oócitos é um processo propenso a erros, onde a maior parte da segregação incorreta cromossômica ocorre durante a meiose I, levando à geração de óvulos aneuploides que são a principal causa de abortos espontâneos precoces e infertilidade em humano...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO)	Sigma	D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator	Life Technologies		Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
Human anti-ACA	Antibodies Incorporated	15-234	Dilution 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective	Leica
MgSO4·7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazole	Sigma	M1404
Paraformaldhyde (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Rabbit anti- MAD2	Biolegend	924601	Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Vector laboratories	H-1000