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Resumo

O presente protocolo descreve a extração de lumicano da membrana amniótica (MA) e suas condições de armazenamento como extrato de micorrizas (EMA) a -20 °C, 4 °C e temperatura ambiente (RT) por 6, 12, 20 e 32 dias para quantificar suas proteínas e concentração de lumicano.

Resumo

O lúmicano é um pequeno proteoglicano rico em leucina na membrana amniótica humana (MA) que promove a epitelização da córnea e a organização das fibras colágenas, mantendo a transparência da córnea. No presente trabalho, propõe-se um método de extração proteica de MA para obtenção de lumicano. Além disso, a estabilidade do lumicano no extrato de MA (AME) armazenado em diferentes temperaturas e períodos de tempo é avaliada. 100 mg de MA foram descongelados e desepitelizados mecanicamente. O AM desepitelizado foi congelado e triturado até a obtenção de um pó fino, que foi solubilizado com 2,5 mL de tampão salino com inibidores de protease e centrifugado para extração proteica. O sobrenadante foi coletado e armazenado a -20 °C, 4 °C e temperatura ambiente (TR) por 6, 12, 20 e 32 dias. Posteriormente, o lumicano foi quantificado em cada EMA. Esta técnica permite um protocolo acessível e acessível para a extração de lumicano a partir de AM. A concentração de lúmico foi afetada pelo tempo de armazenamento e pelas condições de temperatura. Lumican no AME de 12 dias armazenado a -20 °C e 4 °C foi significativamente maior do que outros AME. Esta extração de lumicano pode ser útil para o desenvolvimento de tratamentos e soluções farmacêuticas. Mais estudos são necessários para determinar os usos do AME lumican no processo de reepitelização e cicatrização de feridas.

Introdução

Um dos tratamentos mais utilizados para as afecções corneanas é o transplante de membrana amniótica; no entanto, nos últimos anos, novas propostas têm surgido para a utilização de diversos componentes do tecido amniótico como tratamentos alternativos e adjuvantes. Entre os componentes mais estudados da MA estão os obtidos a partir do extrato de MA (EMA)1,2,3,4,5,6,7. A MA contém múltiplos fatores solúveis, como proteínas antiangiogênicas, interleucinas (IL), inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs), proteínas anti-inflamatórias mediadas pelo TSG-6 que inibem armadilhas extracelulares de neutrófilos, fatores de crescimento: fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento transformador (TGF) (alfa e beta), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e lumicano, que mantém a transparência da córnea regulando a fibrilogênese do colágeno1, 2,3,4,5,6,7,8,9.

O lúmicano é um pequeno proteoglicano rico em leucina (SLRP), um dos principais componentes extracelulares da colagenase intersticial na matriz do estroma corneano, responsável por organizar as fibras colágenas e manter a transparência corneana 4,10,11. Os proteoglicanos são moléculas da matriz extracelular (MEC), que são as principais na realização da sinalização celular e na manutenção da homeostase intracelular12. Acredita-se que as proteínas ECM impulsionam os processos celulares de proliferação, diferenciação e migração durante a cicatrização de feridas11.

Evidências indicam a possível participação do lumicano no processo de reepitelização corneana. Saika et al., em um estudo, mostraram que, após uma lesão corneana, o lumicano poderia ser detectado em queratócitos corneanos entre as primeiras 8 h e até 3 dias após a lesão. Apresentando a maior concentração de lumicano no segundo e terceiro dia, esse proteoglicano é posteriormente indetectável no sétimo dia13. Esses dados sugerem a participação do lumicano na ativação do processo de reepitelização corneana. Por outro lado, em outro estudo, foi relatado que a ausência de lumicano retarda a reepitelização; curiosamente, a adição de lumicano poderia acelerar o processo de reepitelização 4,11,13. Da mesma forma, um estudo recente relatou que o lumicano pode modular as funções inflamatórias dos fibroblastos do limbo corneano14, o que sugere um papel para o lumicano como modulador da resposta inflamatória, antifibrótica e reepitelizante. Da mesma forma, o lumicano pode modular a resposta da córnea interagindo com moléculas de sinalização, como Fas-FasL. Além disso, a ausência de lumicano em um modelo knockout de camundongo Lum-/- demonstrou que a falta de sinalização lumicana impede o reparo adequado da córnea15.

Primeiramente, este método visa demonstrar uma maneira viável e acessível de extrair lumicano da AM. Com esse método vantajoso de extração de lumicanas, é possível obter concentrações semelhantes de proteínas, diminuindo o tempo de processamento e tornando-o mais conveniente para os pesquisadores em comparação com os estudos anteriores16. Além disso, este lumicano AME poderia ser usado como um adjuvante para os processos de reparo e reepitelização da córnea.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa (Projeto nº CEI-2020/06/04). O AM foi obtido do Banco de Amnion do Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana (de seres humanos não identificados), elaborado conforme descrito por Chávez-García et al.17.

1. Preparação do extracto de membrana amniótica

  1. Obter 100 mg de AM do banco de amnion.
    NOTA: De acordo com um relatório anterior, 50 mg de AM secreta um total de 10 ng/mL de lumicano14. Para obter uma maior concentração de lumicano, utilizar 100 mg de AM, equivalente a uma área total de 32 cm2.
  2. Se o AM estiver congelado, descongele-o à temperatura ambiente.
    NOTA: Execute os seguintes procedimentos sob um exaustor de fluxo laminar classe II B.
  3. Lave o AM em uma placa de Petri com 10 mL de solução salina balanceada estéril (BSS, ver Tabela de Materiais) por 2 min.
    1. Despeje o BSS em um béquer.
    2. Repita o passo 3 e confirme visualmente que o meio glicerol não está presente na placa de Petri BSS.
      Observação : repita a etapa 3. conforme necessário, até que o meio glicerol não esteja presente na placa de Petri BSS.
  4. Incubar o AM com 10 mL de dispase II (1,7 UI/mL, ver Tabela de Materiais) a 37 °C, CO2 a 5% por 30 min.
    NOTA: A dispase II é uma protease neutra com atividade suave sobre as células epiteliais. Essa enzima efetivamente separa a epiderme intacta da derme e isola as folhas epiteliais intactas18.
  5. Após a incubação da dispase, realizar uma desepitelização mecânica14 com um policial de borracha (ver Tabela de Materiais). Confirmar a desepitelização por visualização microscópica.
    NOTA: O processo de desepitelização é corroborado em microscópio invertido utilizando objetivas 4x e 20x. Visualize o tecido para excluir a presença de qualquer camada celular.
  6. Lave o AM em uma placa de Petri com 10 mL de BSS por 2 min. Despeje o BSS em um béquer.
  7. Coloque a MA desepitelizada (dAM) em um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Mergulhe o dAM em nitrogênio líquido por 40 min.
  8. Moer manualmente o dAM congelado durante 2-3 min numa argamassa pré-arrefecida a -85 °C até obter um pó fino.
  9. Na argamassa, solubilizar o pó de dAM com 2,5 mL de solução inibidora de protease (BSS com inibidores de protease).
    NOTA: Cada comprimido de inibidor de protease consiste na seguinte mistura de enzimas: extrato de pâncreas (0,02 mg/mL), termolisina (metalloprotease) (0,0005 mg/mL), quimotripsina (0,002 mg/mL), tripsina (0,02 mg/mL) e papaína (0,33 mg/mL) (ver Tabela de Materiais).
  10. Colete a mistura com uma micropipeta e limpe as paredes de argamassa com a ajuda de uma faca de bisturi. Coloque a mistura em um tubo de 5 mL.
  11. Misture bem com o vórtice por 30 s.
  12. Homogeneizar a mistura de tecidos centrifugando a 34 x g durante 20 min a 4 °C e centrifugar imediatamente a 3360 x g durante 20 min a 4 °C.
  13. O sobrenadante coletado é o AME (Figura 1). Armazenar 0,7 mL de cada AME em diferentes tubos de microcentrífuga de 2 mL por 6, 12, 20 e 33 dias nas diferentes condições de temperatura de -20 °C, 4 °C e temperatura ambiente (RT).

figure-protocol-3567
Figura 1: Processo de preparo do AME e medida da concentração de lumican . 100 mg de AM foram incubados com dispase II a 37 °C por 30 min e mecanicamente desepitelizados. O AM desepitelizado foi lavado e imerso em nitrogênio líquido por 40 min, e depois triturado até a obtenção de um pó fino, que foi solubilizado com 2,5 mL de tampão salino com inibidores de protease e centrifugado. O sobrenadante foi coletado e armazenado a -20 °C, 4 °C e RT por 6, 12, 20 e 32 dias até a quantificação da proteína total e do lumicano. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Quantificação da proteína AME

NOTA: A quantificação da proteína total no EMA deve ser efectuada imediatamente após a obtenção. Quantifique as proteínas usando o ensaio de proteína de Lowry e siga as instruções do fabricante (consulte Tabela de Materiais). Recomenda-se que todas as normas e amostras sejam ensaiadas em triplicata.

  1. Pipetar 40 μL de cada amostra de AME para uma microplaca de 96 poços.
    1. Preparar uma curva padrão na mesma microplaca usando o padrão de albumina sérica bovina (BSA) para uma concentração final de BSA de 0-1.500 μg/mL (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1.000 e 1.500 μg/mL).
  2. Pipeta de 200 μL do reagente de Lowry modificado para cada poço. Misture imediatamente em um misturador de pratos por 30 s.
  3. Cubra a microplaca com papel alumínio e incube-a em RT por 10 min.
  4. Pipeta 20 μL de 1x reagente Folin-Ciocalteu para cada poço. Misture imediatamente em um misturador de pratos por 30 s.
    NOTA: Para preparar 1x reagente de Folin-Ciocalteu, diluir 2x (2N) reagente 1:1 com água ultrapura. Preparar 1x reagente de Folin-Ciocalteu no mesmo dia de utilização em que o reagente diluído é instável.
  5. Cubra a microplaca da luz com papel alumínio e incube-a em RT por 30 min.
  6. Medir a absorvância das amostras a 660 nm num espectrómetro de placas ELISA (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: A cor pode ser medida em comprimentos de onda entre 650 nm e 750 nm.
  7. Calcular em média o valor de absorvância de 660 nm das amostras em branco padrão e subtraí-lo de outros valores de 660 nm de amostras padrão e desconhecidas.
    1. Meça a absorbância com um espectrômetro de placa ELISA em um modo final com baixa agitação por 10 s.
  8. Use a curva padrão para determinar a concentração de proteína de cada amostra desconhecida.
  9. Para o cálculo da proteína, determine a concentração a partir de um gráfico de regressão linear usando os valores de absorbância no eixo Y contra as concentrações em mg/mL no eixo X de cada curva padrão da BSA.
    1. Obter a equação de regressão linear e valor r para calcular a concentração de proteínas.
      NOTA: Os resultados são expressos como valores de concentração relativa normalizados de proteína total em relação a mg de AM (μg/mL de proteína/mg de tecido AM).

3. Quantificação de Lumican em AME

NOTA: A concentração de lumicano deve ser medida no AME armazenado em diferentes condições de armazenamento e períodos de tempo. Quantifique o lumicano usando ELISA sanduíche e siga as instruções do fabricante. Recomenda-se que todas as normas e amostras sejam ensaiadas em duplicado.

  1. Diluir o anticorpo de captura de lumicano humano (ver Tabela de Materiais) para a concentração empregada em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    NOTA: O frasco para injetáveis de anticorpos de captura contém 120 μg de anticorpo. Após reconstituição com 0,5 mL de PBS, diluir o anticorpo de captura em uma solução funcional de 2 μg/mL.
    1. Pipetar instantaneamente 100 μL por poço do anticorpo de captura diluído para uma microplaca de 96 poços. Coloque a placa e incube-a durante a noite no RT.
  2. Aspirar cada poço e lavá-lo pipetando com 300 μL de tampão de lavagem: monolaurato de polioxietileno sorbitano a 0,05% 20 em PBS, pH 7,2-7,4 (ver Tabela de Materiais) usando um pipetador multicanal. Repita três vezes.
    NOTA: Após a última lavagem, remova qualquer amortecedor de lavagem restante sempre que a placa e bata suavemente contra toalhas de papel.
  3. Placas de bloco adicionando 300 μL de diluente reagente: 1% de BSA em PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μm filtrado (ver Tabela de Materiais) para cada poço. Incubar no RT por 1 h.
  4. Repita a etapa 2.
  5. Prepare uma curva padrão em uma microplaca de 96 poços usando diluições seriadas de duas vezes de 0-8.000 pg/mL para concentrações finais de 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000 e 8.000 pg/mL. O kit ELISA lumican contém um padrão lumicano recombinante de 75 ng (ver Tabela de Materiais).
  6. Adicionar 100 μL de amostras e a curva padrão na microplaca de 96 poços revestida com anticorpos de captura.
  7. Cubra a microplaca e incube por 2 h a RT com baixa agitação em um balancim compacto mantendo a velocidade entre 2-3 rpm.
  8. Repita a etapa 2.
  9. Adicionar 100 μL do anticorpo de detecção biotinilado (ver Tabela de Materiais) a cada alvéolo. Cobrir da luz e incubar 2 h a RT com baixa agitação em balancim compacto mantendo a velocidade entre 2-3 rpm.
    NOTA: O frasco para injetáveis de anticorpos de detecção biotinilada contém 24 μg de anticorpo. Após reconstituição com 1,0 mL de diluente reagente, diluir o anticorpo de detecção biotinilada em uma solução de trabalho de 400 ng/mL.
  10. Repita a etapa 2.
  11. Adicionar 100 μL da diluição de trabalho da peroxidase treptavidina-rábano (HRP, ver Tabela de Materiais) a cada alvéolo. Cubra a microplaca da luz e incube por 20 min no RT.
    NOTA: A estreptavidina-HRP reativa foi 40 vezes concentrada. A solução de trabalho 1x de estreptavidina-HRP foi confeccionada com diluente reagente.
    NOTA: Evite colocar a placa em luz direta.
  12. Repita a etapa 2.
  13. Finalmente, adicione 100 μL de substrato tetrametilbenzidina (TMB, ver Tabela de Materiais) solução a cada poço.
    NOTA: Prepare a solução TMB com um volume igual de solução estabilizada de peróxido de hidrogênio a 30% fornecida no kit.
    NOTA: Preparar a solução imediatamente antes da utilização e mantê-la à temperatura ambiente.
  14. Incubar por 30 min no RT em um local escuro.
    NOTA: Evite colocar a placa em luz direta. Não aspirar a solução de TMB, uma vez que não é necessária mais lavagem.
  15. Adicionar 50 μL de solução de parada de 1N H2SO4 para interromper a reação colorimétrica. Bata suavemente na placa para garantir uma mistura completa.
  16. Determinar imediatamente a absorvância de cada poço usando um leitor de microplacas ajustado para 450 nm em um espectrômetro de placa ELISA.
  17. Meça a absorbância com um espectrômetro de placa ELISA em um modo final com baixa agitação por 10 s.
  18. Calcule a média do valor de absorvância de 450 nm das amostras em branco padrão e subtraia-o de outros valores de 450 nm das amostras padrão e desconhecidas.
  19. Use a curva padrão para determinar a concentração de lumicano de cada amostra desconhecida.
  20. Para o cálculo da concentração de lumican, faça um gráfico de regressão linear utilizando os valores de absorbância no eixo Y contra as concentrações em pg/mL no eixo X de cada curva lumicana padrão.
    1. Obter a equação de regressão linear e valor r para calcular a concentração de lumicano.
      NOTA: A concentração de lumicano foi normalizada em relação ao mg de tecido extraído. Os resultados são expressos como valores de concentração relativa normalizados de lumicano para mg AM (ng/mL lumican/mg de tecido AM).

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Resultados

Os resultados são relatados como o valor médio ± desvio padrão (DP). Foram realizados testes t de Student e análise de variância (ANOVA). Os valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A análise estatística foi realizada por meio de software estatístico (ver Tabela de Materiais).

A quantidade total de proteína no EMA foi afetada pelo tempo e pelas condições de armazenamento. A concentração de proteína basal foi semel...

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Discussão

Neste estudo, a presença de lumicano foi analisada no AME e sua correlação direta com sua estabilidade sob diferentes condições de armazenamento. Curiosamente, quando a concentração de proteína total em EMA foi quantificada, a concentração de proteína aumentou após o armazenamento. Evidências sugerem três mecanismos que poderiam alterar a concentração de proteínas no armazenamento congelado: a desnaturação a frio, a concentração congelada de solutos e o desdobramento parcial da estrutura proteica ind...

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Divulgações

O estudo foi financiado pelo Programa de Apoio a Projetos de Pesquisa e Inovação Tecnológica da Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Grant No. PAPIIT IN203821) e pelo Ministério da Educação, Ciência, Tecnologia e Inovação (Grant No. SECTEI 250/2019).

Agradecimentos

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1 N H2SO4 stop solutionR&D SystemsDY994
100 μL micropipetteEppendorf
1000 μL micropipetteEppendorf
15 mm Petri dishSymlaboratorios
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm)BD Becton Dickinson 305211
2 mL microcentrifuge tubeEppendorfZ606340
20 mL plastic syringe BD Becton Dickinson 302562
20 μL micropipetteEppendorf
20-200 μL micropipetteEppendorf
5 mL microcentrifuge tubeEppendorf30119401
96-well microplateSARSTEDT821581
Aluminum foilN/AN/A
Amniotic membraneInstituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank100 mg
Balanced salt solutionBausch + LombBSS-403802
BeakerN/AN/A
BioRender BioRenderfigures design 
Compact RockerBioRad970822DDMod. 5202SD-BIO
complete, EDTA-free, Protease inhibitor
cocktail tablets		Roche11 873 580 001Protease Inhibitor
Daiggner vortex Genie 2A.Daigger & Co. , INC22220A
Dispase IIGibco17105-041
ELISA plate spectrometerThermo Labsystems 35401106Multiscan
Freezer
GraphPad Prism GraphPad Software, Incversion 9statistical analysis and graphic program 
Human lumican DuoSet ELISA kitR&D SystemsDY2846-05includes human Lumican capture antibody
Incubator Forma Scientific 3326 S/N 36481-7002
Inverted light MicroscopeOlympus 6A13921to confirm de-epithelialization  Mod.CK2
Laminar flow hoodForma Scientific 14753-567Mod.1184
Liquid nitrogenN/AN/A
MortarN/AN/A
Multi-channel pipettorEppendorf
Nitrogen TankThermo ScientificMod. Biocan 20
Paper towelsN/AN/A
Phosphate-buffered salineR&D SystemsDY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay KitThermo Scientific23240
Plate sealersR&D SystemsDY992
Reagent diluentR&D SystemsDY9951% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered
Refrigerated centrifugecenturion scientific Ltd 15877Mod. K2015R
Rubber policeman cell scraperNEST710001for mechanical de-epithelialization
Scalpel knifeBraunBB521No. 10 or 21
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated R&D Systemspart 893975
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solutionR&D SystemsDY999
Toothed tweezersInvent Germany6binox 
Ultrapure waterPISA
Wash bufferR&D SystemsWA1260.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4

Referências

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