Avaliação dos efeitos das biotoxinas nas funções das células imunes em peixe-zebra

Resumo

Este protocolo descreve ensaios de citometria de fluxo que podem avaliar os efeitos da exposição a toxinas nas funções endocíticas de diferentes subpopulações de leucócitos de peixe-zebra. O uso de inibidores funcionais específicos no ensaio permite a diferenciação dos mecanismos endocíticos alterados.

Resumo

Uma variedade de toxinas biológicas pode estar presente em níveis prejudiciais no ambiente aquático. As cianobactérias são um grupo diversificado de microrganismos procarióticos que produzem cianotoxinas no ambiente aquático. Essas biotoxinas podem ser hepatotoxinas, dermatoxinas ou neurotoxinas e podem afetar peixes e mamíferos. Em níveis elevados, esses compostos são fatais. Em níveis não letais, eles agem de forma insidiosa e afetam as funções das células imunológicas. As biotoxinas produzidas por algas incluem microcistina e anatoxina A. Animais aquáticos também podem ingerir material contaminado com neurotoxina botulínica E (BoNT / E) produzida por Clostridium botulinum, resultando também em morte ou diminuição das funções imunológicas. O peixe-zebra pode ser usado para estudar como as toxinas afetam as funções das células imunológicas. Nesses estudos, as exposições a toxinas podem ser realizadas in vivo ou in vitro. Estudos in vivo expõem o peixe-zebra à toxina e, em seguida, as células são isoladas. Este método demonstra como o ambiente do tecido pode influenciar a função dos leucócitos. Os estudos in vitro isolam as células primeiro e depois as expõem à toxina em poços de cultura. Os leucócitos são obtidos por extração de medula renal, seguida de centrifugação com gradiente de densidade. Como os leucócitos internalizam os patógenos é determinado por mecanismos endocíticos. Os ensaios de fagocitose por citometria de fluxo demonstram se os mecanismos endocíticos foram alterados pela exposição à toxina. Faltam estudos usando leucócitos isolados para determinar como as toxinas causam disfunção imunológica. Os procedimentos descritos neste artigo permitirão que os laboratórios usem o peixe-zebra para estudar os mecanismos que são afetados quando uma toxina ambiental diminui as funções endocíticas das células imunológicas.

Introdução

Existem muitos tipos de biotoxinas ambientais e agentes imunossupressores. A proliferação de algas que contêm toxinas bacterianas ocorre em águas interiores e também pode ocorrer como biofilmes¹. As cianobactérias (algas verde-azuladas) ocorrem naturalmente em todos os ecossistemas de água doce. As florações de cianobactérias aumentaram substancialmente em sistemas de água doce². Em certos momentos, as cianobactérias podem produzir toxinas prejudiciais aos animais aquáticos e terrestres. Essas toxinas podem afetar o fígado, a pele e as membranas mucosas e/ou o sistema nervoso. Dois compostos produzidos por cianobactérias são a microcistina e a anatoxina A. A microcistina é um heptapeptídeo cíclico³. A anatoxina A é um alcalóide⁴. A neurotoxina botulínica E (BoNT/E) é outra toxina que ocorre em sistemas aquáticos. É produzido por Clostridium botulinum e pode ser ingerido por animais aquáticos⁵.

A exposição a toxinas ambientais afeta os peixes e também pode afetar a saúde animal e aumentar a ocorrência de doenças⁶. Compreender como essas toxinas afetam as células imunológicas é fundamental para determinar os riscos associados à exposição a essas substâncias. O peixe-zebra é um excelente modelo para estudar os efeitos das toxinas ambientais nas células imunológicas⁷. O desenvolvimento de um método que utiliza citometria de fluxo e leucócitos de peixe-zebra é altamente benéfico. O peixe-zebra tem relevância fisiológica para os seres humanos, e esse método pode ser aplicado a uma ampla gama de áreas de pesquisa, desde toxicologia básica e imunologia até descoberta de medicamentos e biologia do desenvolvimento. Por serem organismos aquáticos, os peixes-zebra são particularmente adequados para estudar os efeitos das toxinas ambientais transmitidas pela água⁷. O uso de peixe-zebra é mais barato do que outros modelos de vertebrados e seu uso levanta menos preocupações éticas.

Os glóbulos brancos, ou leucócitos, são a primeira linha de defesa celular contra organismos causadores de doenças. A endocitose é o processo de uma célula absorver ou internalizar um líquido ou partícula externa à célula. Isso é realizado pela célula que envolve o composto em uma vesícula⁸. Os leucócitos usam esse processo como o primeiro passo para matar patógenos e preparar uma defesa contra doenças. A fagocitose é um tipo de endocitose e foi um dos primeiros métodos utilizados para investigar os efeitos de poluentes ambientais na saúde dos peixes⁹. O laboratório Petrie-Hanson desenvolveu métodos usando leucócitos de peixe-zebra para rastrear biotoxinas quanto à sua capacidade potencial de interferir nas funções endocíticas e fagocíticas dos leucócitos e afetar as defesas imunológicas. Os tipos de endocitose incluídos nesses métodos são pinocitose, fagocitose, fagocitose mediada por receptor dependente de cálcio e fagocitose mediada por receptor de manose. O uso de métodos de citometria de fluxo com peixe-zebra foi descrito pela primeira vez no laboratório de Petrie-Hanson⁹ e é usado rotineiramente para investigar toxinas e patógenos aquáticos. O peixe-zebra mutante Rag1^-/- não possui células T e B¹⁰ e pode ser usado para investigar especificamente os mecanismos das células imunes inatas.

A citometria de fluxo é baseada em laser e pode ser usada para determinar as propriedades físicas das células. A dispersão direta ou valor FSC é plotado no eixo X e representa o tamanho da célula. A dispersão lateral, ou SSC, é plotada no eixo Y e representa a granularidade citoplasmática da célula. O gráfico resultante demonstra populações de células com características físicas semelhantes agrupadas, com os diferentes tipos de células aparecendo em vários locais em um gráfico de dispersão. Essas populações podem mudar de localização no gráfico de dispersão à medida que as características físicas das células mudam⁹. O uso dessa técnica com leucócitos de peixe-zebra permite que os pesquisadores avaliem as mudanças nas populações de células em resposta a vários estímulos, incluindo toxinas ambientais.

O citômetro de fluxo é multidimensional e vários tipos de fluoróforos podem ser usados na avaliação para caracterizar ainda mais as células e sua atividade. Nos ensaios descritos neste protocolo, a endocitose é caracterizada pela medição da quantidade de material fluorescente que uma célula internalizou. Se e como a exposição à toxina afeta os mecanismos endocíticos pode ser determinado comparando a capacidade das células expostas à toxina de absorver o material em comparação com a capacidade das células não expostas à toxina usando citometria de fluxo. Os processos endocíticos que podem ser avaliados dessa forma incluem pinocitose, endocitose mediada por receptor e fagocitose.

A pinocitose é a captação de componentes solúveis e não utiliza receptores celulares. A captação envolve o rearranjo citoplasmático por microfilamentos e microtúbulos para formar pequenos vacúolos. O amarelo de luciferase (LY) é um corante fluorescente usado para medir a absorção de líquido por pinocitose não seletiva¹¹. A endocitose mediada por receptor envolve a captação seletiva de moléculas grandes. A dextrana marcada com fluoresceína (FITC) (DX) 40 pode ser usada para avaliar esse processo. A fagocitose é uma forma de endocitose que ingere partículas maiores que 0,5 micrômetros. Este processo é investigado por procedimentos utilizando FITC-DX70 e FITC-Eschericia coli. DX40 e DX70 têm pesos moleculares de 40.000 e 70.000, respectivamente. FITC-E. coli é a cepa padrão de laboratório de E. coli ligada a um flúor que pode ser medido pelo citômetro de fluxo. Muitas formas de endocitose mediada por receptores requerem cálcio como molécula de sinalização e para rearranjo do citoesqueleto⁹. Outro tipo de endocitose mediada por receptor é a endocitose mediada pelo receptor de manose (MR). Os receptores de manose são proteínas transmembranares que reconhecem formas de manana nas superfícies das células microbianas⁹. Para otimizar esses procedimentos, uma curva de resposta à dose deve ser criada com cada toxina para estabelecer as doses a serem utilizadas. Deve ser realizada uma curva de saturação para LY, FITC-DX40, FITC-DX70 e FITC-E. coli para avaliar a concentração correta a utilizar.

Os mecanismos usados pelos leucócitos para internalizar diferentes partículas podem variar. Para sugerir qual componente do processo pode ser afetado pela exposição à toxina, inibidores podem ser adicionados para bloquear os mecanismos fagocíticos. A citocalasina D (CCD) inibirá o movimento dos microtúbulos e, portanto, a pinocitose. A DCC não influencia a endocitose mediada por receptor¹¹. O EDTA bloqueia a endocitose mediada por receptor dependente de cálcio (Ca²⁺). O manano é um ligante natural para o MR. O manano é usado como inibidor do receptor de manose para avaliar se a fagocitose ou pinocitose é mediada pelo receptor de manose⁹.

O objetivo deste protocolo é demonstrar os procedimentos para determinar se a exposição à toxina afetou a capacidade dos leucócitos fagocíticos de captar patógenos. Esses protocolos também podem discernir se um mecanismo endocítico específico é afetado. A realização desses ensaios no citômetro de fluxo permite uma discriminação adicional, selecionando populações de leucócitos com base no tamanho e na granularidade citoplasmática para determinar se as subpopulações de leucócitos foram afetadas diferencialmente. Este método depende do gating eletrônico de populações de células.

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual do Mississippi (MSU-IACUC). Todos os peixes-zebra usados neste estudo foram criados a partir de uma colônia homozigótica de ^peixe-zebra mutante rag1-/- previamente estabelecido no incubatório específico livre de patógenos na Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Estadual do Mississippi (MSU) ¹⁰ . O peixe-zebra do tipo selvagem também foi propagado neste incubatório. Nesses estudos, as exposições a toxinas podem ser realizadas in vivo ou in vitro. Estudos in vivo expõem o peixe-zebra à toxina, após o que os leucócitos são isolados, indicando como a toxina e o microambiente tecidual podem interagir e influenciar a função leucocitária. Os estudos in vitro isolam os leucócitos e depois expõem as células à toxina em poços de cultura.

1. Preparação de reagentes e soluções

1. Tampão de Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS): (Solução Salina Balanceada Hanks sem Cálcio ou Magnésio (HBSS) + 0,05% de Albumina de Soro Bovino (BSA)) (ver Tabela de Materiais). Prepare-o fresco antes do isolamento celular.
2. Meios de cultura de tecidos (MTC): Use RPMI-1640 suplementado com glutamax e 10% de soro fetal bovino (ver Tabela de Materiais).
3. Citocalasina D (CCD): Preparar a solução-mãe ressuspendendo o produto comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) em 1 ml de etanol absoluto à prova de 200. Prepare a solução de trabalho adicionando 20 μL de CCD de estoque a 980 μL de tampão FACS, para obter a concentração final de 2,5 μg/mL.
4. EDTA: A solução estoque é de 1 mg / mL. Preparar a solução de trabalho adicionando 100 μL da solução-mãe a 900 μL de tampão FACS, para obter a concentração final de 1 mM.
5. Manano: Prepare uma solução-mãe de 1 mg/ml (ver Tabela de Materiais). Em seguida, prepare a solução de trabalho adicionando 100 μL da solução estoque a 900 μL de tampão FACS, para obter a concentração final de 500 μg / mL.
6. Prepare Amarelo de Lúcifer (10 μg / mL) (LY, um corante fluorescente), Dextrano-40 (DX-40, 500 μg / mL) e Dextrano-70 (DX-70, 500 μg / mL) separadamente, fazendo uma solução de 1 mg / mL de cada um, ressuspendendo os reagentes disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais) em água estéril.
7. Bactérias fluoresceínas (FITC): Cultive Escherichia coli DH5α (ver Tabela de Materiais) com agitação em 100 mL de meio Luria Bertani (LB) suplementado com 50 μg/mL de FITC durante a noite a 37 °C em um ambiente protegido contra luz, obtenha uma densidade óptica (OD) de 0,8 a 540 nm.
   1. Lave as bactérias (3x) com solução salina tamponada com fosfato (PBS) por centrifugação por 10 min a 1000 x g , seguida de aquecimento a 60 ° C por 20 min. Lave mais 1 vez e, em seguida, ajuste as concentrações bacterianas para OD₅₄₀ 0,8. Esta será a solução de estoque.
   2. Preparar a solução de trabalho fazendo uma diluição de 1:100 da solução-mãe (1 ml de caldo: 99 ml de tampão FACS). Ajuste a concentração final para 1,8 x 10⁸ células / mL.

2. Cuidados com o peixe-zebra

1. Mantenha o peixe-zebra em um sistema de fluxo de passagem única em água municipal sem cloro e alimente com farinha de peixe com alto teor de proteína e viva Artemia até a saciedade.
2. Aos 6 meses de idade, remova o peixe-zebra misto de seus tanques e transporte-o para o laboratório de pesquisa para uso no experimento. Esta é a melhor idade a ser usada para o isolamento do número ideal de leucócitos da medula renal⁹.

3. Isolamento celular

1. Eutanasiar 10 peixes-zebra em tricaína (~ 100 mL 4 mg / mL tamponado com fosfato Tricaína metano sulfonato / litro de água de peixe) (ver Tabela de Materiais) seguindo os métodos estabelecidos⁹.
2. Coloque um filtro de células de 40 μm em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL.
3. Remover os tecidos da medula renal⁹ e colocá-los em um tubo C com 3 mL de meio de cultura de tecidos e homogeneizar o tecido usando um dissociador de tecidos. Este é o procedimento preferido.
4. Como alternativa, rompa os tecidos com a extremidade de borracha de uma seringa de 3 mL em um filtro de células. Depois que o tecido for homogeneizado (ou interrompido), despeje a suspensão através de um filtro de células de 40 μm colocado em cima de um tubo cônico de 50 mL.
5. Centrifugar a suspensão filtrada a 500 x g durante 5 min a 16 °C. Despeje o sobrenadante. Ressuspenda as células em 3 mL de MTC. Repita esta etapa duas vezes.
6. Coloque cuidadosamente as células em camadas de 3 mL de meio de gradiente de densidade filtrado estéril (1,077 g / mL) à temperatura ambiente.
7. Em seguida, centrifugue a 800 x g por 20 min a 16 °C. Certifique-se de que o freio esteja na configuração mais baixa, para que as células não sejam ressuspensas quando a centrífuga parar.
8. Remova a camada opaca de buffy da interface para um tubo inferior redondo de 14 mL.
9. Lave as células adicionando 5 mL de TCM e misturando com uma pipeta Pasteur. Centrifugue a 300 x g por 5 min a 16 °C.
10. Repita a etapa, descartando o sobrenadante e ressuspendendo o pellet celular em TCM para obter aproximadamente 1 x 10⁶ células / mL.

4. Ensaio de viabilidade celular

1. Para monitorar a viabilidade celular, avalie a morte celular usando a coloração com iodeto de propídio (PI).
   1. Adicionar IP (200 μg/mL) na concentração de 5 μL/mL de células a serem analisadas. Leia no canal PE / Texas Red.
      NOTA: O iodeto de propídio se difunde através dos orifícios nas membranas das células mortas, colorindo-as. A viabilidade avaliada foi de 85% para o presente estudo.

5. Incubação de toxinas

1. Alíquota de 200 μL de células da suspensão de células isoladas em cada alvéolo de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços (3 poços para controle e 3 poços para exposição a toxinas). Isso permite que as réplicas sejam executadas em triplicado.
2. Adicione 2 mL de TCM a cada poço.
3. Adicione toxina (~ 2,5 μg / mL) aos três poços.
   NOTA: A concentração da toxina deve ser otimizada antes do início do experimento e dependerá da toxina usada para o ensaio.
4. Incube a placa de cultura de tecidos para o tempo de exposição desejado. O tempo de exposição desejado deve ser otimizado antes do início do experimento e dependerá da toxina usada para o ensaio. No presente estudo, o tempo de exposição foi de ~1 h.
5. Após o tempo de exposição, coloque a placa de cultura de tecidos no gelo por 10 min.
6. Pipete as células em cada poço para cima e para baixo com cuidado para remover quaisquer células aderentes da placa.
7. Remova as células da placa para um tubo de centrífuga de fundo redondo de 14 mL.
8. Centrifugue as células a 300 x g durante 5 min a 16 °C. Ressuspenda as células em 3 mL de tampão FACS. Repita a etapa duas vezes.
9. Ressuspenda as células em 1,5 mL de tampão FACS.
   NOTA: Para os estudos in vivo , exponha o peixe-zebra à toxina (em uma concentração semelhante à mencionada acima) e, em seguida, isole as células.

6. Ensaio de endocitose

1. Alíquota de 100 μL de células para tubos de citometria de fluxo de 5 mL. Rotule os tubos da seguinte forma com quatro tubos replicados de cada poço: (1) LY, (2) DX40, (3) DX70, (4) FITC-E. coli.
2. Adicione corante de fluorescência conforme indicado na etapa 1.6 e na etapa 1.7 aos tubos apropriados: 50 μL de LY ao tubo (1), 50 μL DX40 ao tubo (2); 50 μL DX70 para tubo (3); 50 μL de FITC-E. coli para tubo (4).
3. Incubar por 1 h. Adicione 200 μL de tampão FACS a cada tubo.
4. Centrifugar as células a 400 x g durante 5 min a 16 °C. Despeje o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 μL de tampão FACS. Repita esta etapa três vezes. Efectuar a análise por citometria de fluxo.

7. Citometria de fluxo

1. Realize citometria de fluxo para visualizar as populações de células e coletar dados. Consulte Hohn et ^al.9 para obter detalhes.
2. Identifique as populações de células-alvo na primeira etapa. Use dispersão lateral (SSC) (geralmente o eixo vertical) para remover detritos e pequenas células picnóticas no lado esquerdo e dispersão frontal (FSC) (geralmente o eixo horizontal) para remover os mesmos detritos na parte inferior do gráfico.
3. Elimine as leituras duplas (células contadas duas vezes). Isso é feito usando uma porta de geometria de pulso (FSC-H x FSC-A).
4. Determine o sinal de fundo. Execute apenas o controle de fluorescência das células e um controle de fluorescência de isotipo para cada fluorocromo usado, para identificar os níveis fluorescentes de fundo.
   NOTA: Cada fluorocromo tem seu próprio nível exclusivo de fluorescência de fundo, influenciado pela autofluorescência celular e ligação não específica. Isso distingue entre sinais verdadeiros positivos e fluorescência de fundo. Ao identificar e bloquear populações de células com base na fluorescência, esses valores de controle são subtraídos do número de eventos positivos, e o número resultante é o número usado para análise.
5. Execute as amostras e identifique as populações de células a serem fechadas. Use FSC e SSC para caracterizar e identificar morfologicamente diferentes populações de células dentro de uma mistura de células.
   NOTA: O FSC está relacionado principalmente ao tamanho da célula. Células maiores espalharão mais luz na direção para frente, resultando em valores mais altos de FSC, enquanto células menores espalharão menos luz e terão valores de FSC mais baixos. Diferentes tamanhos de células serão agrupados em clusters. Por exemplo, os linfócitos, sendo menores, podem aparecer como um aglomerado separado com valores de FSC mais baixos em comparação com os granulócitos. O SSC está relacionado à granularidade, complexidade e estrutura interna da célula. Células com mais granularidade citoplasmática terão valores mais altos de SSC. Células semelhantes se agruparão. Por exemplo, os neutrófilos têm grânulos citoplasmáticos e se agrupam em um valor de SSC mais alto do que os linfócitos.
6. Execute todas as amostras e, com base no FSC / SSC, aplique portas às populações de células a serem analisadas posteriormente. As áreas fechadas são aplicadas com base na densidade celular e nas populações de interesse.
7. Plote áreas fechadas em histogramas para analisar a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) de FITC em cada porta para fluorescência a 495 nm / 519 nm com o laser azul.
8. Contagens de células de exportação conforme determinado pelo software para se destacar no programa de análise.
9. Analise os dados em um pacote de software estatístico (consulte Tabela de Materiais).
10. Compare o MFI de cada população de células de controle com o MFI de populações de células expostas à toxina.

8. Efeito da toxina nos mecanismos endocíticos e efeitos dos inibidores CCD, EDTA e manano nos mecanismos endocíticos

NOTA: Para absorver líquidos ou partículas, o citoplasma da célula se move ativamente. Esse movimento requer múltiplos elementos estruturais e vias de sinalização. As biotoxinas podem afetar qualquer um desses elementos ou vias. A comparação dos efeitos de inibidores específicos caracterizados pode ser usada para auxiliar no discernimento de como a biotoxina pode estar agindo¹¹.

1. Execute isolamentos de células conforme descrito na etapa 3.
2. Alíquota de 100 μL de células para tubos de citometria de fluxo de 5 mL (com quatro tubos replicados de cada poço).
   NOTA: Rotule os tubos da seguinte forma: (5) CCD + LY (CCD inibe a pinocitose inibindo o rearranjo de microfilamentos e microtúbulos; A LY é usada para avaliar a absorção de líquidos por micropinocitose)⁹. (6) EDTA + DX40 (o EDTA bloqueia a fagocitose e a micropinocitose mediadas pelo receptor dependente de Ca²⁺ ; medindo se a captação envolve um mecanismo dependente de cálcio). (7) EDTA + DX70. (8) EDTA + FITC-E. coli. (9) Manano + DX40 (o manano inibe a captação específica pelo receptor de manose, medindo a endocitose dependente de RM⁹). (10) Mannan + DX70. (11) Manano + FITC-E. coli.
3. Adicionar inibidores: 1 μL de CCD ao tubo (5); 10 μL de EDTA para tubos (6-8); 100 μL de manano para tubos (9-11). Siga as concentrações mencionadas na etapa 1. Incubar por 5 min.
4. Adicionar fluorescente secundário aos tubos apropriados: 50 μL de LY ao tubo (1) e (5); 50 μL de DX40 para o tubo (2), (6) e (9); 50 μL de DX70 para tubo (3), (7) e (10); 50 μL de FITC-E. coli para o tubo (4), (8) e (11). Incubar por 30 min.
5. Adicione 200 μL de tampão FACS a cada tubo. Centrifugue a 400 x g a 16 °C por 5 min.
6. Despeje o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 μL de tampão FACS. Repita as etapas 8.5-8.6 duas vezes.
7. Execute as amostras no citômetro de fluxo seguindo a etapa 7.

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Resultados

Os ensaios de endocitose usam leucócitos mistos isolados de gradientes e fechados para fagócitos e linfócitos para determinar se mecanismos celulares específicos foram alterados pela exposição a toxinas. Primeiro, as células são fechadas com base no tamanho e na granularidade¹⁰. Células mortas, fragmentadas ou moribundas são visualizadas no canto inferior esquerdo do gráfico de dispersão e são eliminadas, não analisadas quanto à fagocitose. A porta ...

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Discussão

A utilização de citometria de fluxo com leucócitos de peixe-zebra oferece uma abordagem poderosa e versátil para estudar o sistema imunológico em detalhes, avaliar o impacto de toxinas ambientais e facilitar a pesquisa toxicológica. Ele fornece uma maneira de avaliar de forma rápida e eficaz o impacto das toxinas nas células imunológicas e na resposta imune. Os resultados revelam fatores humorais envolvidos e sugerem como a fisiologia e o metabolismo do peixe interagem com as bi...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% fetal bovine serum	Gibco	A3160501
14 mL round bottom centrifuge tubes	BD Biosciences	352059
40 µm cell straininer	Corning	07-201-430
5 mL flow cytometry tubes	BD Biosciences	352235
50 mL conical centrifuge tube	Corning	14-959-49A
Absolute ethanol	Fisher	BP2818-500
Automated cell counter	Life Technologies Countess II FL		for studying cell viability
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A3059
cytochalasin D (CCD)	Sigma	C8273-5MG
Dextran 40	Sigma	FD40-100MG
Dextran 70	Sigma	46945-100MG-F
Escherichia coli DH5α (or other lab bacterial strain)	New England Biolabs	C29871
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	ED4SS
Flow analysis software	Novoacea software
Flow cytometer	Novocyte 3000
Fluorescein	Fluka BioChemica	46950
hanks balanced salt solution without calcium or magnesium	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Lucifer Yellow	Sigma	L0259-25MG
Mannan	Sigma	M7504-250MG
Phosphate buffered saline	Sigma	P3813
RPMI-1640 with GlutaMax	Gibco	61870036
Statistical software	SPSS
Toxin
Tricaine	Western Chemical Inc	NC0342409