Ressecção de linfonodo vascular poplíteo no membro posterior de coelho para indução secundária de linfedema

Resumo

Aqui, a indução cirúrgica de linfedema adquirido estável no membro posterior do coelho é descrita. Este animal experimental pode ser usado para investigar mais detalhadamente o efeito do tratamento do linfedema por técnicas microcirúrgicas.

Resumo

O linfedema é uma condição comum frequentemente associada ao câncer e seu tratamento, que leva a danos ao sistema linfático, e os tratamentos atuais são principalmente paliativos e não curativos. Sua alta incidência entre pacientes oncológicos indica a necessidade de estudar tanto a função linfática normal quanto a disfunção patológica. Para reproduzir o linfedema crônico, é necessário escolher um animal experimental adequado. As tentativas de estabelecer modelos animais são limitadas pela capacidade regenerativa do sistema linfático. Dentre os potenciais candidatos, o membro posterior do coelho é de fácil manuseio e extrapola para o cenário clínico humano, tornando-o vantajoso. Além disso, o tamanho desta espécie permite uma melhor seleção de vasos linfáticos para ressecção de linfonodos vascularizados.

Neste estudo, apresentamos um procedimento de ressecção de linfonodos vasculares no membro posterior de coelhos para indução de linfedema secundário. Os animais anestesiados foram submetidos à medida circunferencial, infiltração de azul patente V e linfografia com indocianina verde (ICG-L) usando fluorescência de infravermelho próximo em tempo real, uma técnica que permite a identificação de linfonodos poplíteos e canais linfáticos únicos. O acesso às estruturas identificadas é obtido pela excisão do nó poplíteo e pela ligação dos linfáticos aferentes medial e lateral. Cuidados especiais devem ser tomados para garantir que qualquer vaso linfático que se una ao sistema linfático femoral dentro da coxa sem entrar no nódulo poplíteo possa ser identificado e ligado.

A avaliação pós-operatória foi realizada aos 3, 6 e 12 meses após a indução, utilizando-se medidas circunferenciais do membro posterior e do ICG-L. Conforme demonstrado durante o acompanhamento, os animais desenvolveram refluxo dérmico que foi mantido até o^12º mês, tornando este animal experimental útil para novas avaliações de longo prazo no manejo do linfedema. Em conclusão, a abordagem descrita aqui é viável e reprodutível. Além disso, durante a janela de tempo apresentada, pode ser representativo do linfedema humano, fornecendo assim uma ferramenta de pesquisa útil.

Introdução

O linfedema é uma condição crônica que merece atenção especial, devido à sua incidência mundial, falta de tratamento curativo e padronizado e sério impacto na qualidade de vida dos pacientes ^1,2.

Nos países desenvolvidos, o linfedema é principalmente adquirido e secundário ao câncer de mama, devido à alta prevalência dessa malignidade; A incidência cumulativa de linfedema relacionado ao câncer de mama 10 anos após a cirurgia pode chegar a 41,1%³. No entanto, doenças como melanoma, cânceres ginecológicos, tumores geniturinários e neoplasias de cabeça e pescoço também estão associadas a uma alta incidência dessa doença⁴. A ressecção de linfonodos regionais, como parte do tratamento oncológico necessário para aumentar as taxas de sobrevida, leva à interrupção da drenagem linfática funcional. Em alguns casos, isso resulta em mecanismos compensatórios que previnem ou retardam o aparecimento do linfedema⁵. No entanto, quando a quimioterapia e a radioterapia são administradas, esses mecanismos não são capazes de compensar a mudança e, consequentemente, ocorre o linfedema. Isso tem um impacto negativo na qualidade de vida dos pacientes, afetando seu bem-estar funcional, social e psicológico ^6,7.

A necessidade de uma cura eficaz para o linfedema requer a compreensão da fisiopatologia do sistema linfático, bem como uma visão profunda dos mecanismos celulares complexos e suas respostas nos sistemas linfáticos normais e disfuncionais ^8,9,10. Tais insights podem ser obtidos inicialmente a partir de modelos animais experimentais que podem reproduzir doenças humanas crônicas¹¹.

Muitas tentativas foram feitas para replicar o linfedema em modelos animais experimentais; No entanto, a maioria deles tem sido prejudicada por algumas limitações, incluindo a incapacidade de reproduzir a insuficiência linfática crônica em um modelo animal estável, os custos do estudo e, principalmente, a grande capacidade regenerativa do sistema linfático, que permite restaurar a circulação^12,13.

Este estudo apresenta a abordagem experimental para induzir cirurgicamente linfedema adquirido estável usando o membro posterior de coelho. Com base na revisão da literatura, esse animal pode ser considerado ideal para o desenvolvimento de linfedema devido à anatomia consistente de seu sistema linfático de membros posteriores, que inclui um único nódulo poplíteo que drena o membro posterior e atinge o sistema linfático femoral principal na perna^14,15.

A anatomia específica do membro posterior do coelho permite a reprodução dos procedimentos cirúrgicos realizados em humanos para induzir linfedema secundário. Portanto, esse procedimento pode ser usado para treinamento microcirúrgico e pesquisa pré-clínica para extrapolar os resultados para a medicina humana.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética do Centro de Cirurgia Minimamente Invasiva Jesús Usón e pelas diretrizes de bem-estar do governo regional, que se baseiam na legislação europeia.

1. Preparação pré-cirúrgica e cirúrgica

1. Abrigam nove coelhas brancas da Nova Zelândia pesando 4-4,5 kg e com 4 meses de idade em gaiolas separadas mantidas a uma temperatura de 22-25 °C, com livre acesso a comida e água. Certifique-se de que as gaiolas contenham uma bandeja de polissulfona com uma área de superfície de 3 m² e uma altura de 40 cm, bem como uma cama com aparas de madeira.
   1. Identifique as gaiolas com o código do projeto e o número de identificação do animal.
   2. Aclimatar os animais por 1 semana antes da cirurgia para evitar problemas induzidos pelo estresse. Colete valores laboratoriais pré-operatórios de amostras de sangue para garantir que cada animal esteja em boas condições de saúde antes da anestesia.
2. Certifique-se de que todos os coelhos sigam um jejum de 12 horas antes de cada procedimento cirúrgico.
   1. Após a pré-medicação, pré-oxigenar os coelhos usando uma máscara facial (máscara Hall) por 5 min com oxigênio a 100% e um fluxo de gás fresco de 3-5 L/min. Realize a fase de co-indução com midazolam (0,3 mg/kg) e propofol (10 mg/kg) por via intravenosa.
3. Intubar os coelhos com tubos endotraqueais 3,0-3,5, com pneumotaponação, conectados a um circuito circular semifechado ligado a um ventilador com fluxo de gases frescos a 1 L/min por 5 min iniciais e, posteriormente, ajustado a 0,5 L/min.
   1. Realize a anestesia de manutenção por inalação de sevoflurano a uma concentração de 3% a 3,5% definida no vaporizador.
4. Administre uma infusão contínua de solução de lactato de Ringer (2-4 mL / kg / h) através da veia marginal da orelha aos coelhos anestesiados durante todo o procedimento cirúrgico.
   1. Use uma pomada protetora para os olhos para proteger a superfície ocular.
5. Monitoramento geral da anestesia: use um termômetro retal para monitorar a temperatura em 38,7-39,7 °C, inspecione a cor da membrana mucosa e monitore a saturação de O₂em >95% e a frequência cardíaca em 180-240 bpm usando um oxímetro de pulso de coelho.
6. Coloque um suporte térmico para que o animal mantenha uma temperatura constante durante todo o procedimento.
7. Administre cetorolaco (1,5 mg/kg) mais tramadol (3 mg/kg) por via intravenosa para analgesia intraoperatória.
8. Administrar antibióticos (7,5 mg/(kg∙dia) de enrofloxacina por via subcutânea [s.c.]) antes da cirurgia e 5 dias após a cirurgia, bem como analgesia pós-operatória (10 μg/(kg∙dia) de buprenorfina s.c.) por 5 dias.
9. Coloque os coelhos em decúbito dorsal e raspe as áreas posteriores e inguinais do animal. Coloque o animal em decúbito dorsal / supino e corte o cabelo das áreas dos membros posteriores e inguinais.
10. Realize a antissepsia da pele aplicando clorexidina a 0,5% e etanol a 70% na pele previamente depilada. Uma vez desinfetada a área, cubra o coelho com um pano estéril, exceto o membro posterior esquerdo.

2. Cirurgia de ressecção de linfonodos vasculares poplíteos (Figura 1)

1. Infiltre 0,2-0,3 mL de indocianina verde (ICG) por via intradérmica no segundo e terceiro espaços interdigitais do membro posterior esquerdo. Massageie, flexione suavemente e estenda o membro posterior por alguns minutos para facilitar a absorção do corante nos vasos linfáticos. Use o membro contralateral como controle.
2. Use uma câmera de fluorescência de infravermelho próximo em tempo real para visualizar e marcar (usando um marcador cirúrgico) os vasos linfáticos que se cruzam no nível do joelho e o linfonodo poplíteo (PLN) na pele (Figura 2).
3. Injetar azul patente V (0,2 mL) na área interdigital para posterior identificação dos vasos linfáticos e linfonodos.
4. Uma vez que o PLN é identificado usando uma câmera de fluorescência de infravermelho próximo em tempo real (Figura 3), crie uma incisão de 2 cm no centro da fossa poplítea, longitudinal ao longo eixo do membro posterior através da veia isquiática, que é visível através da pele.
   1. Para obter imagens panorâmicas em tempo real do sistema linfático com a câmera de fluorescência de infravermelho próximo em tempo real, use a cabeça óptica equipada com um laser de classe 1 como fonte de luz de excitação e uma câmera sensível ao infravermelho próximo, do tornozelo ao joelho do membro posterior do animal.
   2. Visualize os vasos linfáticos acima da fáscia muscular ressecando a gordura subcutânea⁵. Os vasos linfáticos aparecem azuis devido à coloração V azul patente na etapa 2.3.
   3. Use pinças microcirúrgicas para esticar a incisão e expor o PLN, incluindo os pedículos linfáticos vasculares e aferentes. Garanta uma visibilidade clara de todas as estruturas linfáticas e vasculares (Figura 4).
   4. Identifique o PLN, com diâmetro de 0,8 mm, sob a veia isquiática e entre os músculos bíceps femoral e isquiotibiais mediais.
5. Identifique os dois principais vasos linfáticos na face medial do PLN. Esses vasos estão localizados paralelamente à veia safena distal e se dividem em uma rede de microvasos à medida que se aproximam do PLN (Figura 5).
6. Dissecar o pedículo do linfonodo, evitando danos aos tecidos e vasos circundantes (Figura 6).
7. Ligue a artéria medial (um ramo da artéria poplítea) e a veia safena lateral distal e proximalmente usando pontos inabsorvíveis de náilon 10/0.
8. Identifique e cauterize os dois grupos de vasos linfáticos aferentes que se unem diretamente ao sistema linfático femoral dentro da coxa, mas não entram no PLN (Figura 7).
   NOTA: O primeiro grupo corresponde aos vasos linfáticos aferentes mediais que drenam a linfa da parte superior da perna e da panturrilha. O segundo grupo é composto por vasos linfáticos na musculatura dos membros inferiores. Esses vasos correm ao longo do músculo gastrocnêmio, juntamente com a veia safena.
9. Confirme a interrupção completa do sistema linfático repetindo imagens de fluorescência de infravermelho próximo em tempo real.
10. Remova totalmente o tecido adiposo circundante para evitar uma possível linfangiogênese.
11. Suturar a incisão na pele com suturas trançadas absorvíveis de ácido poliglicólico (PGA) 4-0 (com agulha triangular 3/8 de 16 mm) usando um padrão intradérmico contínuo para evitar a automutilação pós-operatória.
12. Alojar os coelhos individualmente em gaiolas após a cirurgia; Mantê-los sob vigilância e a uma temperatura ambiente entre 16 e 22 °C.

3. Avaliação pós-operatória

1. Realizar avaliações pós-operatórias aos 3, 6 e 12 meses após a indução.
2. Anestesie os coelhos seguindo os passos utilizados anteriormente (passos 1.2-1.7).
3. Meça os perímetros dos membros posteriores dos coelhos anestesiados com uma fita métrica. Faça medições a cada 2 cm, sendo o primeiro ponto no tornozelo e o último no joelho. Calcule o volume total usando a fórmula do cone truncado.
4. Use linfografia com indocianina verde (ICG-L) para avaliar a função linfática.
   1. Infiltre 0,2-0,3 mL de ICG por via intradérmica no segundo e terceiro espaços interdigitais e massageie suavemente por 1 min para facilitar a captação de ICG nos vasos linfáticos.
5. Colete imagens após 15 minutos usando o sistema de fluorescência de infravermelho próximo para avaliar o refluxo dérmico.
6. Uma vez concluídos os acompanhamentos, eutanasiar o coelho seguindo o mesmo protocolo anestésico utilizado na intervenção. Uma vez alcançado o plano anestésico desejado, administrar cloreto de potássio intravenoso na veia auricular a uma taxa média de 2 meq/kg.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Nove coelhos foram submetidos à indução de linfedema neste estudo, no entanto, três coelhos morreram durante o pós-operatório imediato e não puderam ser avaliados. Os dados do estudo foram obtidos aos 3, 6 e 12 meses de pós-operatório por três pesquisadores independentes. Medidas circunferenciais dos membros posteriores e ICG-L foram realizadas sob anestesia geral para avaliar a função do sistema linfático e o refluxo dérmico.

Os dados obtidos pe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

A ressecção do PLN em um animal experimental é um procedimento relativamente novo que pode induzir linfedema secundário nos membros para avaliação e estudo. Após a ressecção linfonodal, há um período de alteração da funcionalidade do sistema linfático, acúmulo linfático e alterações histológicas dos vasos linfáticos que aparecem dilatados. Quando esse acúmulo de linfa atinge níveis adequados, o refluxo dérmico característico do linfedema, semelhante ao observado e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleu Patente V sodique (Guerbet)	Guerbet. Villepinte, France		2.5 g/100 mL
Buprenorphine (Bupaq)	Richter Pharma. Wels, Austria	0820645AA	3 mg/10 mL
Fluobeam	Fluoptics. Grenoble, France		Fluorescence imaging
IBM SPSS software	IBM	version 21.0
Indocyanine green (Verdye, Diagnostic Green GmbH)	Diagnostic Green GmbH. Aschheim-Dornach, Germany		5 mg/mL
Ketorolaco  (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T01H	30 mg/mL
Microsoft Excel	Microsoft	version 16.66.1
Midazolam (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T35M	15 mg/3 mL
Pentero 800 microscope, fluorescence module	Carl Zeiss Meditec AG. Goeschwitzer Strasse 51-52. Jena, Germany	302581-9245-000
Potassium chloride (Braun)	B.Braun. Barcelona, Spain	19262010	20 mmol/10 mL
Propofol (Propomitor, Orion Pharma)	Orion Pharma. Spoo, Finland	20R039B	200 mg/20 mL
RÜSCH endotracheal tubes	Teleflex Medical IDA Business and Technology Park. Athione, Ireland.	12CE 12	Size Tube 4.0 I.D. mm
Sevoflurano (SevoFlo, Zoetis)	Zoetis Belgium. Luvain-la-Neuve, Belgium	6093559	1000 mg/g (250 mL)
Tramadol (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T08U	100 mg/2 mL