Manutenção de um dispositivo de lesão por percussão de fluido lateral

Resumo

Cuidados e manutenção adequados são essenciais para que um dispositivo de lesão de percussão de fluido lateral (LFPI) funcione de forma confiável. Aqui, demonstramos como limpar, preencher e montar corretamente um dispositivo LFPI e garantir que ele seja mantido adequadamente para obter os melhores resultados.

Resumo

O traumatismo cranioencefálico (TCE) é responsável por cerca de 2,5 milhões de atendimentos de emergência e hospitalizações anualmente e é uma das principais causas de morte e incapacidade em crianças e adultos jovens. O TCE é causado por uma força súbita aplicada à cabeça e, para melhor compreensão do TCE humano e seus mecanismos subjacentes, modelos experimentais de lesão são necessários. A lesão da percussão lateral do fluido (LFPI) é um modelo de lesão comumente usado devido às semelhanças nas alterações patológicas encontradas no TCE humano em comparação com o LFPI, incluindo hemorragias, ruptura vascular, déficits neurológicos e perda de neurônios. A LFPI emprega um pêndulo e um cilindro cheio de fluido, este último com um pistão móvel em uma extremidade, e uma conexão de trava Luer para tubulação rígida e cheia de fluido na outra extremidade. A preparação do animal envolve a realização de uma craniectomia e a fixação de um cubo Luer sobre o local. No dia seguinte, a tubulação do dispositivo de lesão é conectada ao cubo Luer no crânio do animal e o pêndulo é elevado a uma altura especificada e liberado. O impacto do pêndulo com o pistão gera um pulso de pressão que é transmitido à dura-máter intacta do animal através da tubulação e produz o TCE experimental. Cuidados e manutenção adequados são essenciais para que o dispositivo LFPI funcione de forma confiável, pois o caráter e a gravidade da lesão podem variar muito dependendo da condição do dispositivo. Aqui, demonstramos como limpar, preencher e montar corretamente o dispositivo LFPI e garantir que ele seja mantido adequadamente para obter os melhores resultados.

Introdução

O traumatismo cranioencefálico (TCE) é causado por uma força súbita aplicada na cabeça. Após lesões primárias resultantes do impacto físico, os sobreviventes de TCE comumente experimentam lesões secundárias, incluindo déficits cognitivos e disfunções neurológicas que estão associadas às respostas fisiológicas à lesão inicial¹. Estima-se que cerca de 69 milhões de indivíduos no mundo sofram de TCE anualmente². Somente nos Estados Unidos, aproximadamente 2,5 milhões de atendimentos de emergência e hospitalizações por TCE ocorrem a cada ano, tornando o TCE uma das principais causas de incapacidade e morte entre crianças e adultos^jovens3. O TCE pode ser classificado em leve, moderado ou grave, sendo o TCE leve (TCEm) responsável por aproximadamente 70%-90% dos casos de^TCE4. A patologia histológica e cognitiva do TCE pode ocorrer dentro de minutos a horas após a lesão, e os efeitos do TCE podem persistir por meses a anos após a lesão inicial⁵.

O desenvolvimento de modelos experimentais tem sido fundamental para a compreensão dos efeitos e mecanismos subjacentes do TCE. Um desses modelos, a lesão por percussão lateral no fluido (LFPI), é comumente usado para avaliar o TCE in vivo. A ILPI reproduz de perto patologias associadas ao TCE humano, incluindo rupturas vasculares, hemorragias, perda neuronal, inflamação, gliose e distúrbios moleculares ^6,7,8. A técnica de LFPI é utilizada para diversas aplicações experimentais, incluindo a modelagem do TCE pediátrico, bem como condições neurodegenerativas crônicas, como a encefalopatia traumática^crônica9,10. A IFTL é um método bem definido e reprodutível de TCE experimental que permite ajustar a gravidade da^lesão11. O dispositivo LFPI possui vários componentes importantes, entre eles: um pêndulo com martelo ponderado, um pistão, um cilindro cheio de líquido, um transdutor de pressão, um osciloscópio digital e um pequeno tubo na extremidade do cilindro com uma trava Luer que se prende a um cubo no crânio do animal (Figura 1). O LFPI funciona balançando o pêndulo no pistão, criando uma onda de pressão através do fluido (água deionizada desgaseificada ou soro fisiológico) no cérebro do animal anexado; isso aumenta a pressão intracraniana, replicando as características mecânicas e alterações biológicas do TCE¹². Além disso, animais utilizados em experimentos de LFPI são submetidos a uma craniectomia para expor o cérebro ao impacto da pressão do fluido do dispositivo.

A manutenção e o monitoramento de rotina são necessários para garantir que o dispositivo LFPI esteja funcionando com precisão. Os seguintes métodos são vitais para evitar a introdução de bolhas de ar contaminantes no dispositivo. Aqui, demonstramos métodos para limpar, preencher e montar corretamente o dispositivo LFPI. Também discutiremos as saídas do osciloscópio e os tempos de retificação do mouse como formas de confirmar a viabilidade do LFPI.

Protocolo

1. Limpeza do cilindro LFPI

1. Retire cuidadosamente as seringas conectadas à carcaça do transdutor e à porta de enchimento, bem como o cabo conectado ao transdutor de pressão (consulte a Figura 1 para um esquema dos componentes do dispositivo de lesão).
2. Tomando cuidado para não soltar o cilindro, desaparafuse os botões de mão na parte de trás do dispositivo das braçadeiras do cilindro para liberar o cilindro.
3. Remova o pistão na extremidade do cilindro, do transdutor, da carcaça do transdutor e dos anéis O do êmbolo.
4. Escorra o líquido para fora do cilindro.
5. Adicione detergente neutro, como detergente para lavar louça, ao cilindro e esfregue levemente com uma escova de prato ou garrafa¹³.
6. Para garantir que todo o detergente seja enxaguado, encha completamente o cilindro com água e enxágue completamente.

2. Desgaseificação do fluido usado para encher o cilindro

1. Use uma bomba de vácuo para desgaseificar o fluido antes de reabastecer o cilindro para evitar a formação de novas bolhas e absorver as bolhas existentes.
   NOTA: Aproximadamente 1,5 L de fluido será necessário para encher o cilindro, embora a desgaseificação de aproximadamente 2 L deixe um pequeno suprimento para repor qualquer fluido perdido durante o uso e teste.
   NOTA: Os aspiradores domésticos são muito fracos para desgaseificar eficazmente o fluido. O vácuo deve ser capaz de produzir uma pressão de 25-28 inHg.
2. Adicione uma barra de agitação ao líquido e coloque o recipiente de líquido em um prato agitado. Agitar o fluido durante o processo de desgaseificação ajuda a estimular o borbulhamento e a liberação de gás. A agitação também evita um grande aumento súbito do borbulhamento.
   NOTA: O processo de desgaseificação deve terminar quando muito poucas bolhas estão sendo produzidas; Isso ocorre após aproximadamente 45 min.

3. Remontagem do dispositivo LFPI

1. Aplique uma fina camada de vaselina no êmbolo do pistão.
2. Fixe o êmbolo do pistão com o êmbolo saliente a aproximadamente 32 mm do cilindro¹⁴.
   NOTA: O ar frequentemente fica preso no êmbolo antes do O-ring principal. Para se livrar desse excesso de ar, torça o êmbolo enquanto o move para dentro e para fora para trabalhar o ar para fora dessa lacuna.
3. Aplique também uma fina camada de vaselina nos outros O-rings e fixe-os ao cilindro, com exceção do O-ring na porta de enchimento.
4. Enrole a fita de teflon duas vezes ao redor dos fios do transdutor.

4. Reabastecer o dispositivo LFPI e encaixar na base

1. Conecte uma seringa de 10 mL cheia de fluido desgaseificado e livre de bolhas de ar ao cubo Luer lock na carcaça do transdutor.
2. Segure o transdutor com a extremidade rosqueada voltada para cima e preencha completamente o poço dentro da região rosqueada do transdutor com o fluido desgaseificado usando uma seringa de 10 mL. O objetivo aqui é encher bem o transdutor sem introduzir bolhas de ar. Tenha cuidado para não danificar bem a membrana delicada na parte inferior do transdutor.
3. Com o cilindro colocado em um ângulo para evitar que o ar volte a entrar na carcaça do transdutor, conecte a carcaça do transdutor ao cilindro¹³ e use uma chave para apertá-lo confortavelmente.
4. Remova a tampa da porta de enchimento e do cilindro quando o fluido desgaseificado atingir aproximadamente 2/3 da capacidade do cilindro.
5. Coloque o cilindro horizontalmente e termine de enchê-lo com fluido desgaseificado.
   OBS: Para evitar a formação de bolhas de ar, recomenda-se despejar o líquido lentamente¹⁴.
6. Substitua a tampa na porta de enchimento e feche todas as torneiras.
7. Manipule o cilindro para trabalhar quaisquer bolhas de ar até a porta de enchimento¹⁴.
8. Abra a torneira na porta de enchimento e injete fluido usando a seringa na carcaça do transdutor para forçar quaisquer bolhas de ar para fora da porta¹⁴.
9. Inspecione todo o dispositivo e certifique-se de que não há bolhas de ar.
10. Adicione uma seringa de 10 mL cheia de líquido desgaseificado ao cubo Luer lock na tampa de enchimento.
11. Reconecte o cilindro à base usando os parafusos manuais.
12. Certifique-se de que o cilindro esteja horizontal e alinhado com o centro do martelo pesado no pêndulo.

Resultados

Testamos os efeitos da contaminação por bolhas de ar em um dispositivo LFPI na formação de formas de onda. Injetamos bolhas de ar no dispositivo e comparamos as saídas do osciloscópio com os dados do osciloscópio coletados de um dispositivo LFPI não contaminado. As condições foram: não contaminado, injeção de 5 mL de ar, injeção de 10 mL de ar e injeção de 15 mL de ar. Mantivemos o pêndulo em uma altura consistente para todos os impactos para todas as condições e realizamos 15 impactos por condição....

Discussão

As técnicas descritas acima demonstram como manter adequadamente um dispositivo LFPI. A limpeza e o monitoramento de rotina são necessários para manter o dispositivo LFPI funcionando corretamente e de forma confiável. Além disso, devido à natureza invasiva do procedimento de LFPI, é imperativo que o dispositivo seja cuidadosamente limpo para evitar a infecção de animais de laboratório.

Evitar a formação de bolhas de ar no dispositivo é crucial para obter lesões e formas de onda ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 - 10 mL syringes with Luer lock capability			Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid
Degassed fluid			Helps to reduce air bubble formation during injury procedure
Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B)	Custom Designs & Fabrications Inc.	N/A	Injury device used to model TBI in rodents
Mild detergent			Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder
Petroleum Jelly			Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust
Teflon tape			Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device
*Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company.